대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

요약

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

초록

대장암은 종양 발달, 유지 보수 및 약물에 대한 내성을 담당하는 암 줄기세포(CSC)의 인구를 포함하는 이질성 및 계층적 조직을 특징으로 한다. 그들의 특정 표적을 위한 CSC 속성의 더 나은 이해는, 그러므로, 효과적인 치료를 위한 전제 조건입니다. 그러나 심층 조사에 적합한 전임상 모델이 부족합니다. 시험관 내 2차원 (2D) 암 세포주가 종양 생물학에 귀중한 통찰력을 제공하지만, 그들은 현상및 유전 종양 이질성을 복제하지 않습니다. 대조적으로, 3차원 (3D) 모형은 거의 생리적인 암 복잡성 및 세포 이질성을 해결하고 재현합니다. 이 작업의 목적은 CSC 생물학을 연구하기 위해 강력하고 재현 가능한 3D 문화 시스템을 설계하는 것이었습니다. 본 방법론은 장기 배양에 사용될 수 있는 모델인 Caco2 결장 아데노암종 세포로부터 동질적인 3D 스페로이드를 생성하는 조건의 개발 및 최적화를 설명합니다. 중요한 것은, 스페로이드 내에서, 루멘과 같은 구조물을 중심으로 조직된 세포는, 차동 세포 증식 패턴및 마커 패널을 표현하는 CSC의 존재에 의해 특징지어졌다. 이러한 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 세포 이질성 및 CSC 생물학을 연구하기 위한 이 3D 접근법의 적합성을 위한 첫 번째 개념 증명을 제공합니다.

서문

대장암(CRC)은 세계^1에서암 관련 사망의 두 번째 주요 원인으로 남아 있다. CRC의 발달은 종양 억제 유전자^3,4의온코진 활성화 및 불활성화를 포함하는 유전 돌연변이 및/또는 후성유전학 적 변경^2,3의점진적 습득 및 축적의 결과입니다. 더욱이, 비유전적 요인(예를 들어, 마이크로환경)은 종양성 변혁에 기여하고 촉진하여 CRC^5의진화에 참여할 수 있다. 중요한 것은, CRC는 정상 결장 토굴^6,7에서상피의 조직을 연상시키는 계층 구조를 구성하는 일부 분화 된 CSC 및 벌크 종양 세포를 포함한 상이한 세포 집단으로 구성된다.

CSC는 종양 출현^8,유지 보수 및 성장, 전이성 용량 및 종래의 치료법에 대한 내성을 담당하는 것으로 간주됩니다^6,7. 종양 내에서, CSC를 포함한 암세포는 그들의 명백한 돌연변이 및 후성 유전학 단면도, 형태학 및 표현성 다름, 유전자 발현, 물질 대사, 증식 비율 및 전이성 전위^9의관점에서 이질성과 복잡성의 높은 수준을 표시합니다. 따라서, 암 생물학, 종양 진행, 효과적인 치료법으로의 내성 획득, 이 암 이질성 및 계층 구조를 포착하는 인간 전임상 모델은^10,11에중요하다.

체외 2D 암 세포주에서 는 오랫동안 사용되어 왔으며 종양 발달과 치료 분자의 효능의 근간이 되는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 그러나, 본래 종양에서 발견되는 현상및 유전적 이질성의 부족에 대하여 그들의 한계는 지금 널리 인식된다^12. 더욱이, 영양분, 산소, pH 그라데이션 및 종양 미세환경은 재현되지 않으며, 마이크로환경은^{CSC(11,12)를}포함한 상이한 세포 유형의 유지에 특히 중요하다. 이러한 주요 단점을 극복하기 위해 여러 3D 모델이 실험적으로 암의 복잡성과 이질성을 해결하고 재현하기 위해 개발되었습니다. 실제로, 이들 모델은 생체 내^{12,13,14에서}관찰된 것과 유사한 종양 세포 이질성, 세포 세포 상호 작용 및 공간^{아키텍처를}재구성한다. 신선한 종양뿐만 아니라 세포 주 유래 스페로이드에서 확립된 1차 종양 오르가노이드는 주로^15,16으로채용된다.

스페로이드는 세포가 세포 응집체에서 형성되고 성장하도록 강제하기 위해 비계가 없거나 스캐폴드 기반 방식으로 배양될 수 있다. 스캐폴드 프리 방법은 비부착 조건(예를 들어, 매달려 드롭 방법 또는 초저부착 플레이트)의 세포 배양에 기초한 반면, 스캐폴드 기반 모델은 천연, 합성 또는 하이브리드 생체 재료에 의존하여^{배양세포(12,13,14)에}의존한다. 스캐폴드 계 스페로이드는 최종 스페로이드 형성이 사용되는 (바이오) 물질의 성질과 조성에 따라 달라지기 때문에 상이한 단점을 제시한다. 지금까지 사용할 수있는 스캐폴드프리 스페로이드 방법은 기판의 특성에 의존하지 않지만 구조및 크기^17,18에따라 달라지는 스페로이드를 생성한다.

이 연구는 CSC 생물학을 공부하기 위하여 Caco2 결장 선암 세포로 구성된 크기에서 균질한 spheroids의 견고하고 재현가능한 3D 배양 시스템을 설계하는 것을 목표로 했습니다. Caco2 세포는 시간이 지남에 따라 분화 하는 그들의 능력에 때문에 특히 관심^19,20,강하게 줄기 같은 잠재력을 제안. 이에 따라, 스페로이드의 장기 문화는 화학요법에 다른 반응을 가진 다른 CSC 인구의 존재를 밝혔습니다.

프로토콜

참고: 모든 시약 및 재료의 세부 정보는 재료 표에나열됩니다.

1. 스페로이드 형성

1. 스페로이드 문화 미디어
   1. 덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)로 구성된 기저형 매체를 4m L-alanyl-L-글루타민 디펩티드로 보충한다.
   2. 1.1.1단계에서 기저 배지에서 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유한 DMEM 완전 배지를 준비한다.
   3. 지하 멤브레인 매트릭스 2.5%, FBS 10%, 기초 매체 1%를 포함하는 DMEM/지하 막 매트릭스 배지를 1.1.1단계에서 준비한다.
2. 스페로이드 형성을 위한 플레이트 준비
   1. 실온(RT)에서 약 20분 동안 따뜻한 기저및 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지.
   2. 각 우물에 500μL의 안티 준수 헹구는 용액을 추가하여 스페로이드 형성에 전념하는 24웰 플레이트의 우물을 후퇴시킵니다.
      참고: 이 플레이트에서는 각 음웰이 1,200마이크로웰로 구성됩니다.
   3. 플레이트용 어댑터가 있는 스윙 버킷 로터에서 1,200× g의 플레이트원심분리기.
      참고: 한 접시만 사용하는 경우 무게의 균형을 맞추기 위해 물로 채워진 표준 플레이트를 추가로 준비합니다.
   4. 따뜻한 기저 질의 2mL로 각각 잘 헹구고 우물에서 배지를 흡인시합니다.
   5. 현미경의 밑에 접시를 관찰하여 기포가 마이크로웰에서 완전히 제거되었는지 확인합니다. 거품이 갇혀 있는 경우, 원심분리기는 거품을 제거하기 위해 5 분 동안 1,200 × g에서 다시 원심분리기를 제거합니다.
   6. 헹도 단계를 반복합니다 1.2.4-1.2.5.
   7. 각 웰에 따뜻한 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지 1mL를 추가합니다.
3. 스페로이드 생성
   1. 5% CO2를 포함하는 가습된 분위기에서 10% FBS 및 1% 펜/스트렙으로 보충된 DMEM 배지내의 2D 단층에서 Caco2 세포를 성장시다(이하 37°C/5%_CO2라고 함).
      참고: 사용할 최대 셀 구절 수는 80개입니다.
   2. 인플루언서의 80%에 도달하면 인산완충식살린(PBS) 1x(10cm 접시에 5mL)로 세포를 씻고, 트립신 에틸렌디아민 테트라아세산(EDTA)(10cm 접시2mL)을 추가하고, 37°C에서 2~5분 동안인큐베이트에 2-5%를 더한다.
   3. 현미경으로 세포 분리를 확인하고, 10cm 접시 당 DMEM 의 4 mL을 추가하여 트립신을 중화시다.
   4. 혈종계를 사용하여 세포를 계산하여 총 세포 수를 결정합니다.
   5. 세포 현탁액을 1,200 × g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 버리고, DMEM/지하 막 매트릭스 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재놓는다.
   6. 마이크로웰 당 원하는 수의 세포수를 달성하기 위해 웰당 필요한 세포 수를 결정하기 위해 표 1을 참조하십시오. 또는, 24웰 플레이트에 대해 다음 수식을 사용하여 세포 수를 계산하고, 각 우물에는 1,200마이크로웰이 포함되어 있습니다.
      웰 당 필요한 세포 수 = 마이크로웰 당 원하는 세포 수 × 1,200
   7. 1 mL의 최종 부피에서 원하는 세포 수를 달성하기 위해 각 웰에 셀 서스펜션의 필요한 부피를 추가합니다.
   8. DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지 1mL을 각 웰에 추가하여 웰당 2mL의 최종 부피에 도달합니다(1.2.7단계 참조).
      참고 : 마이크로 웰에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
   9. 소웰에서 세포를 포획하기 위해 5 분 동안 1,200 × g에서 즉시 플레이트를 원심 분리합니다. 필요한 경우 원심분리기를 물로 채워진 표준 플레이트와 균형을 맞설 수 있습니다.
   10. 현미경의 밑에 플레이트를 관찰하여 세포가 마이크로웰 사이에서 균등하게 분포되어 있는지 확인합니다.
   11. 플레이트를 방해하지 않고 48h에 대해 37°C/5%_CO2에서 플레이트를 배양합니다.
       참고 : 원래 프로토콜^(21)에따르면 많은 세포주가 24 시간 이내에 스페로이드를 형성 할 수 있지만 일부는 더 긴 잠복기가 필요합니다. 이 프로토콜에서 48h는 스페로이드 형성에 충분합니다.
4. 마이크로웰에서 스페로이드 수확
   1. RT에서 기저 및 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지를 약 20분 동안 데워보시킵니다.
   2. 세로지학적 파이펫을 사용하여 각 우물에서 배양 배지(1mL)의 절반을 제거합니다.
   3. 마이크로웰에서 스페로이드를 제거하기 위해 배지를 우물 표면에 다시 넣습니다.
      참고: 스페로이드를 만지거나 삼중시키지 마십시오.
   4. 15mL 원피스 튜브 상단에 37 μm 가역 스트레이너(또는 40μm 표준 스트레이너)를 배치하여 스페로이드를 수집합니다.
      참고: 40 μm 표준 여과기를 사용하는 경우 거꾸로 놓습니다.
   5. 제거된 스페로이드(1.4.3단계에서)를 부드럽게 흡인시키고 스페로이드 서스펜션을 여과기를 통과합니다.
      참고: 스페로이드는 필터에 유지됩니다. 단일 셀은 배지로 흐르게 됩니다.
   6. 세로지학적 파이펫을 사용하여 웰의 전체 표면에 따뜻한 기저 배지 1mL을 분배하여 남은 스페로이드를 빼내고 여조기에 회수합니다.
   7. 이 세탁 단계를 두 번 반복하십시오.
   8. 현미경 의 밑에 접시를 관찰하여 모든 스페로이드가 마이크로웰에서 제거되었는지 확인합니다. 필요한 경우 세척을 반복하십시오(1.4.6-1.4.7 단계).
   9. 여과기를 반전시키고 새로운 15mL 원추형 튜브에 놓습니다. DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지로 스트레이너를 세척하여 스페로이드를 수집합니다.
      참고: 수집된 스페로이드는 다운스트림 응용 프로그램 및 분석을 위해 준비되었습니다.
5. 스페로이드의 장기 문화
   1. 기저 배지에 1.5% 아가로즈 용액을 준비하고, 오토클레이브(표준 사이클)를 통해 멸균한다.
   2. 아가로즈 용액은 따뜻하고 여전히 액체이지만 표 2에설명된 바와 같이 표준 배양 접시 또는 접시의 우물을 코팅합니다.
      참고 : 오븐에서 접시 / 접시를 따뜻하게하면 코팅 단계를 용이하게합니다. 코팅 된 접시 / 접시는 멸균 환경에서 최대 10 일 동안 RT에 남아 빛으로부터 보호 할 수 있습니다.
   3. 아가로즈 코팅 플레이트에서 수확된 스페로이드(1.4.9단계에서)를 시드하고, DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지를 추가하여 플레이트의 크기에 따라 최종 부피를 달성한다.
      참고: 스페로이드 응집체를 피하려면 22스페로이드/cm^2의최적 밀도로 시드하십시오. 코팅이 완벽하게 평평하지 않고 가장자리쪽으로 상승하여 플레이트 중앙에 가벼운 굴착을 일으킵니다. 스페로이드의 수가 너무 높으면 서로 고칠 가능성이 높습니다.
   4. 특정 분석을 위해 스페로이드를 회수할 때까지 플레이트를 37°C/5%_{CO2로 배양한다.}
6. 화학 요법 약물로 스페로이드 치료
   1. 플레이트 스페로이드는 1.5.4 단계에서 2 일 동안 성장합니다. 3일째 (D3)부터 시작하여 FOLFIRI(5-플루오로라실, 50 μg/mL)로 치료하십시오. 이리노테칸, 100 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL) 또는 FOLFOX(5-플루오루라실, 50 μg/mL; 옥산스립라틴, 10 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL) 화학요법 요법 조합은 CRC 환자를 치료하기 위해 일상적으로 사용된다^22,23,24,25,또는 (대조) 치료되지 않은 (NT) 조건에서 유지.
   2. 팁 이 끊기(1,000 μL 팁)가 있는 파이펫을 사용하여 처리 3일 후에 스페로이드를 수집하여 각 조건이 적어도 3개의 복제로 표현되도록 합니다. 원심 분리는 3 분 동안 1,000 × g로 한 다음 상체를 제거합니다.
   3. 조직학적 분석을 위해 2% 파라포름알데히드(PFA)로 펠릿을 고정하거나 RNA 추출을 위해 펠릿을 사용한다(섹션 4 참조).
   4. 세포사멸을 분석하기 위해, DMEM/지하막 매트릭스 배지에서 흑배양웰 플레이트에서 1.6.1단계로부터 스페로이드를 30분 동안 배양하여 살아있는 세포에 침투하지 않는 핵산 얼룩(1:5000 희석)을 가지고, 그러나 죽은 세포의 손상된^막(26)을관통한다. 마이크로 플레이트 판독기와 형광의 축적을 측정합니다.

2. 스페로이드 성장 모니터링

1. 반전 된 현미경을 사용하여, 문화에서 일 내내 다른 조건하에서 유지 되는 스페로이드의 대표적인 이미지를 취득.
2. 적절한 소프트웨어를 사용하여 각 스페로이드의 3가지 대표 직경을 측정하여 이미지를 분석합니다.
3. 다음 수식을 사용하여 예상 구 체적을 가져옵니다.
   
   
   참고: 용어, d1, d2 및 d3는 스페로이드의 세 가지 직경입니다.

3. 면역 형광 (IF) 및 조직학적 염색

1. 고정 및 파라핀 포함
   1. 1.6.2 단계에서 설명한 바와 같이 팁이 잘린 파이펫을 사용하여 선택한 시간 지점에서 스페로이드를 수집하고 2% PFA에서 RT에서 30분 동안 수정합니다.
      참고: 또는 추가 사용이 될 때까지 이 단계에서 샘플을 4°C로 저장합니다.
   2. 파라핀 포함의 경우 PBS 1x로 스페로이드 3배를 세척하고 70% 에탄올로 재보선다. 파라핀 포함 및 단면 후 조직학적 분석을 위해 헤마톡시린 및 에오신(H&E) 염색을 수행합니다.
2. 파라핀 섹션의 면역 라벨링
   참고: 간접 면역 염색을 위해 5μm 두께의 섹션을 사용합니다.
   1. 왁스를 녹이고 분리화를 개선하기 위해 2 시간 동안 60 °C에서 슬라이드를 인큐베이션합니다.
   2. 메틸시클로헥산에서 슬라이드를 3분 동안 두 번 씻으십시오.
   3. 슬라이드를 1:1 메틸시클로헥산:100% 에탄올로 3분 간 세척합니다.
   4. 슬라이드를 100% 에탄올로 3분 동안 두 번 씻으십시오.
      참고: 3.2.2 단계의 모든 조작을 수행하여 화학 후드에서 3.2.4 단계를 수행합니다.
   5. 슬라이드를 90% 에탄올로 3분 동안 씻으십시오.
   6. 75%의 에탄올로 슬라이드를 3분 동안 세척합니다.
   7. 50% 에탄올로 슬라이드를 3분 동안 씻으십시오.
   8. 수돗물 아래에서 슬라이드를 씻으십시오.
   9. 5 분 동안 증류수에 슬라이드를 다시 수분.
   10. 0.01 M 구연산 버퍼, pH 6.0의 700 mL을 준비하고 적합한 용기에 추가하십시오 (너비 : 11.5 cm, 길이 : 17cm, 높이 : 7cm); 슬라이드를 잠급합니다. 전자레인지에 있는 용기를 700W에서 9-10분 동안 가열하고 끓이기 시작하면 400-450W. 인큐베이터의 전력을 추가로 10분 간 감소시다.
   11. 약 30-40분 동안 버퍼에서 슬라이드를 RT로 식힙니다.
   12. 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 두 번 씻으십시오.
   13. 마커 펜으로 섹션 주위에 원을 그리면 섹션에 적용된 액체에 대한 장벽을 만듭니다.
   14. 각 섹션에 50 μL의 블로킹 버퍼(일반 염소 세럼 10%, 소 세럼 알부민 1%, PBS의 0.02% Triton X-100)를 RT에서 최소 30분 동안 배양합니다.
   15. 차단 버퍼를 제거하고 인큐베이션 버퍼에서 희석된 1차 항체의 50 μL을 추가합니다(일반 염소 혈청 1%, BSA 0.1%, PBS에서 0.02% 트리톤 X-100). RT에서 2 시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
   16. 1 차적인 항체를 제거하고 PBS에서 슬라이드3x를 5 분 동안 세척하십시오.
   17. RT에서 1h에 대한 인큐베이션 버퍼에서 희석된 형광 이차 항체의 50 μL로 슬라이드를 배양한다.
   18. 이차 항체를 제거하고 PBS에서 슬라이드를 3x로 5 분 동안 세척하십시오.
   19. 각 섹션에 4′,6-diamidino-2-phenylindole와 장착 매체의 50 μL을 추가하고, 섹션 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다.

4. RNA 추출, 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR), 및 정량성 RT-PCR(qRT-PCR)

1. 다른 시간 지점에서 스페로이드를 수집, 각 점은 적어도 세 복제로 표현. 원심 분리는 3 분 동안 1,000 × g로 한 다음 상체를 제거합니다.
   참고: 펠릿은 RNA 추출에 직접 사용하거나 추가 사용이 있을 때까지 -20°C에 저장될 수 있습니다.
2. 제조 업체의 지침에 따라 상용 RNA 격리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 각 RNA 샘플의 500 ng를 보완 DNA (cDNA)로 역 전사합니다.
4. 역전사 후, 다른 엑슨에 있는 프라이머로 가사 유전자를 증폭시키기 위해 cDNA의 1 μL에 PCR 분석을 수행합니다.
   참고: 이 단계는 RNA 제제에 있는 어떤 유전체 DNA 오염의 부재의 확인을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 위해 펩디딜프로릴 이솜라제B(PPIB) 프라이머가 사용되었다.
5. 관심 유전자에 특정 프라이머를 사용하여 이전에 희석 된 cDNA (RNAse 프리 이중 증류수에서 1:10)의 4 μL에 qPCR 증폭을 수행합니다. 각 샘플에서, ΔΔCt 방법을 사용하여 특정 mRNA 발현을 정량화하고 가사 유전자 수준에 대해 정규화된 값을 한다.
   참고: 이 프로토콜의 경우 β액틴(ACTB)이 선택되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 프라이머는 표 3에나열됩니다.

결과

스페로이드의 크기에서 균질성의 부재가 현재 사용 가능한 3D 스페로이드 배양^{시스템(13)의}주요 단점 중 하나이기 때문에, 이 작업의 목적은 균일한 스페로이드를 얻기 위해 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜을 설정하는 것이었습니다. 첫째, 이상적인 작업 조건을 확립하기 위해, 전용 플레이트(표 1)를 사용하여 마이크로웰/스페로이드당 50~2,000세포?...

토론

체외 3D 모델은 2D 암 세포 배양의 주요 실험적 단점을 극복, 그들은 미세 환경 과 세포 이질성을 포함한 전형적인 종양 기능을 다시 항복에 더 신뢰할 것으로 보인다. 일반적으로 사용되는 3D 스푸로이드 모델은 스캐폴드가 없는(저부착 조건에서 배양됨) 또는 스캐폴드 기반(생체 물질을 배양 세포에 사용)이다. 이러한 방법은 사용되는 비계의 특성에 의존하거나 구조와 크기가 가변적인 스페로이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	-	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids