מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

Maria  Virginia Giolito; Léo Claret; Carla Frau; Michelina Plateroti

doi:10.3791/61783

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.

Abstract

סרטן המעי הגס מאופיין בהטרוגניות ובארגון היררכי הכולל אוכלוסייה של תאי גזע סרטניים (CSCs) האחראים על התפתחות הגידול, תחזוקתו והעמידות לתרופות. הבנה טובה יותר של מאפייני CSC עבור המיקוד הספציפי שלהם היא, אם כן, דרישה מוקדמת לטיפול יעיל. עם זאת, יש מחסור במודלים פרה-קוליניים מתאימים לחקירות מעמיקות. למרות הפריה דו מימדית (2D) קווי תאים סרטניים לספק תובנות חשובות לתוך הביולוגיה הגידול, הם לא לשכפל את ההטרוגניות גידול פנוטיפי וגנטי. לעומת זאת, מודלים תלת מימדיים (תלת מימדיים) מטפלים ומשכפלים מורכבות סרטן כמעט פיזיולוגית והטרוגניות של תאים. מטרת עבודה זו הייתה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה הניתנת לשחזור לחקר הביולוגיה של CSC. המתודולוגיה הנוכחית מתארת את הפיתוח והאופטימיזציה של תנאים ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים, שהם הומוגניים בגודלם, מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2, מודל שניתן להשתמש בו לתרבות ארוכת טווח. חשוב לציין, בתוך הכדורואידים, התאים שאורגנו סביב מבנים דמויי לומן, התאפיינו בדפוסי התפשטות תאים דיפרנציאליים ובנוכחות CSCs המבטאים פאנל של סמנים. תוצאות אלו מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה תלת-ממדית זו לחקר הטרוגניות התא וביולוגיה של CSC, כולל התגובה לכימותרפיה.

Introduction

סרטן המעי הגס (CRC) נשאר הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן בעולם¹. הפיתוח של CRC הוא^תוצאהשל רכישה מתקדמת והצטברות של מוטציות גנטיות ו / או שינויים אפיגנטיים 2^,³, כולל הפעלה של אונקוגנים והפעלה של גנים מדכאי גידול³^,⁴. יתר על כן, גורמים לא גנטיים (למשל, microenvironment) יכול לתרום ולקדם טרנספורמציה oncogenic ובכך להשתתף באבולוציה של CRCs⁵. חשוב לציין, CRCs מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות, כולל CSCs מובחנים ותאי גידול בתפזורת המציגים כמה תכונות בידול, המהוות מבנה היררכי המזכיר את ארגון האפיתל בקריפטה המעי הגס נורמלי⁶^,⁷.

CSCs נחשבים אחראים על מראה הגידול⁸, תחזוקה וצמיחה שלה, קיבולת גרורתית, והתנגדות לטיפולים קונבנציונליים⁶^,⁷. בתוך גידולים, תאים סרטניים, כולל CSCs, להציג רמה גבוהה של הטרוגניות ומורכבות במונחים של פרופילים מוטציה ואפיגנטית מובהק שלהם, הבדלים מורפולוגיים פנוטיפיים, ביטוי גנים, חילוף החומרים, שיעורי התפשטות, פוטנציאל גרורתי⁹. לכן, כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הסרטן, התקדמות הגידול, ורכישת עמידות לטיפול ותרגומו לטיפולים יעילים, מודלים פרה-קוליניים אנושיים הלוכדים את ההטרוגניות וההיררכיה של סרטן זה חשובים¹⁰^,¹¹.

In vitro 2D קווי תאים סרטניים שימשו במשך זמן רב ולספק תובנות חשובות על התפתחות הגידול ואת המנגנונים שבבסיס היעילות של מולקולות טיפוליות. עם זאת, המגבלה שלהם ביחס לחוסר ההטרוגניות הפנוטיפית והגנטית שנמצאה בגידולים המקוריים מוכרת כיום באופן נרחב¹². יתר על כן, חומרים מזינים, חמצן, שיפוע pH, ואת microenvironment הגידול אינם משוחזרים, microenvironment להיות חשוב במיוחד לשמירה על סוגי תאים שונים כולל CSCs¹¹^,¹². כדי להתגבר על חסרונות עיקריים אלה, מספר מודלים 3D פותחו כדי לטפל באופן ניסיוני ולשכפל את המורכבות וההטרוגניות של סרטן. למעשה, מודלים אלה מסכמים מחדש את ההטרוגניות התאית הגידולית, אינטראקציות תאים וארכיטקטורה מרחבית, בדומה לאלה שנצפו ב vivo¹²^,¹³^,¹⁴. אורגנואידים גידול ראשוני הוקמה גידולים טריים, כמו גם ספירואידים קו התא נגזר, מועסקים בעיקר¹⁵^,¹⁶.

ניתן לתרבת ספרואידים באופן נטול פיגומים או פיגומים כדי לאלץ את התאים להיווצר ולצמוח באגרגטים של תאים. שיטות ללא פיגומים מבוססות על תרבות התאים בתנאים שאינם עמידים (למשל, שיטת תלייה-טיפה או לוחות התקשרות נמוכים במיוחד), ואילו מודלים מבוססי פיגומים מסתמכים על ביו-חומרים טבעיים, סינתטיים או היברידיים לתאי תרבות¹²^,¹³^,¹⁴. ספירואידים מבוססי פיגומים מציגים חסרונות שונים שכן היווצרות הכדורואיד הסופי תהיה תלויה באופיו ובהרכבו של החומר (הביולוגי) בו נעשה שימוש. למרות ששיטות הכדורידים נטולות הפיגומים הזמינות עד כה אינן מסתמכות על אופי המצע, הן יוצרות ספרואידים המשתנים במבנה ובגודל¹⁷^,¹⁸.

עבודה זו נועדה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה וניתנת לשחזור של ספרואידים, שהם הומוגניים בגודלם, המורכבים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2 לחקר הביולוגיה של CSC. תאי Caco2 מעניינים במיוחד בשל יכולתם להבדיל לאורך זמן¹⁹^,²⁰, מאוד מציע פוטנציאל דמוי גזע. בהתאם לכך, תרבות ארוכת טווח של הכדורואידים חשפה את נוכחותן של אוכלוסיות CSC שונות עם תגובות שונות לכימותרפיה.

Protocol

הערה: הפרטים של כל ריאגנטים וחומרים מפורטים בטבלת החומרים.

1. היווצרות ספרואידית

מדיית תרבות ספרואידית
1. הכינו מדיום בזלי המורכב מ-DMEM בינוני הנשר שעבר שינוי של Dulbecco בתוספת 4 מ"מ L-אלניל-ל-גלוטמין דיפטיד.
2. הכינו מדיום מלא של DMEM המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין) במדיום בסיסי משלב 1.1.1.
3. הכן מדיום מטריצת קרום DMEM/מרתף המכיל מטריצת קרום מרתף של 2.5%, FBS 10% ו- 1% עט/סטרפטוקוקוס במדיום בסיסי משלב 1.1.1.
הכנת צלחות להיווצרות ספרואידית
1. מטריצה חמה של בזל ו- DMEM / ממברנה במרתף בינונית בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ -20 דקות.
2. Pretreat בארות של צלחת 24-באר המוקדש היווצרות ספרואידים על ידי הוספת 500μL של פתרון נגד דבקות שטיפה לכל באר.
  הערה: בצלחות אלה, כל באר מורכבת 1,200 microwells.
3. צנטריפוגה הצלחת ב 1,200 × גרם במשך 5 דקות רוטור דלי מתנדנד עם מתאמים עבור צלחות.
  הערה: אם נעשה שימוש בצלחת אחת בלבד, הכינו צלחת סטנדרטית נוספת מלאה במים כדי לאזן את המשקל.
4. שוטפים כל באר עם 2 מ"ל של מדיום בזל חם, ושופטים את המדיום מהבארות.
5. שים לב לצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי בועות הוסרו לחלוטין מן microwells. אם בועות להישאר לכודים, צנטריפוגה שוב ב 1,200 × g במשך 5 דקות כדי לחסל את הבועות.
6. חזור על שלבי השטיפה 1.2.4-1.2.5.
7. הוסף 1 מ"ל של מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף חם לכל באר.
דור של ספרואידים
1. לגדל את תאי Caco2 ב monolayer 2D במדיום DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% עט / סטרפטוקוקוס ב 37 °C (77 °F) באווירה לחה המכילה 5% CO₂ (להלן נקרא 37 °C /5% CO₂).
  הערה: המספר המרבי של מעברי תאים לשימוש הוא 80.
2. כאשר מגיעים ל-80% מההתקהלות, שוטפים את התאים עם מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) 1x (5 מ"ל לצלחת של 10 ס"מ), מוסיפים חומצה טטראאצטית טריפסין-אתילנדיאמין (EDTA) (2 מ"ל למנה של 10 ס"מ), ומדגירה למשך 2-5 דקות ב-37°C/5%_CO2.
3. בדוק ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ, ולנטרל את טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של DMEM מדיום מלא לכל צלחת 10 ס"מ.
4. ספירת תאים באמצעות המוציטרומטר כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים.
5. צנטריפוגה השעיית התא ב 1,200 × g במשך 5 דקות. השלך את supernatant, ו resuspend גלולה בנפח המתאים של מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף בינוני.
6. עיין בטבלה 1 כדי לקבוע את מספר התאים הדרושים לבאר כדי להשיג את מספר התאים הרצוי לכל מיקרווול. לחלופין, חשב את מספר התאים באמצעות הנוסחה הבאה עבור צלחת של 24 בארות, בהתחשב בכך שכל באר מכילה 1,200 מיקרו-בתים
  מספר תאים נדרש לבאר = מספר התאים הרצוי למיקרווול × 1,200
7. הוסף את הנפח הנדרש של השעיית התא לכל באר כדי להשיג את מספר התא הרצוי בכרך סופי של 1 מ"ל.
8. הוסף 1 מ"ל של מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף לכל באר כדי להגיע לנפח הסופי של 2 מ"ל לבאר (ראה גם שלב 1.2.7).
  הערה: היזהר לא להכניס בועות לתוך microwells.
9. צנטריפוגה הצלחת מיד ב 1,200 × g במשך 5 דקות כדי ללכוד את התאים microwells. במידת הצורך, לאזן את הצנטריפוגה עם צלחת סטנדרטית מלאה במים.
10. שים לב ללוח שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בין המיקרווולים.
11. דגירה את הצלחת ב 37 °C/5% CO₂ עבור 48 שעות מבלי להפריע את הצלחת.
  הערה: על פי הפרוטוקול המקורי²¹, למרות קווי תאים רבים יכולים ליצור ספרואידים בתוך 24 שעות, חלקם דורשים זמן דגירה ארוך יותר. בפרוטוקול זה, 48 שעות מספיקות להיווצרות ספרואידית.
קצירת הכדורואידים מהמיקרווולים
1. מחממים את מדיום מטריצת הבזל וה- DMEM / מרתף ב- RT למשך כ -20 דקות.
2. באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר מחצית מדיום התרבות (1 מ"ל) מכל באר.
3. מוסיפים את המדיום בחזרה אל פני השטח של הבאר כדי לעקור את הכדורואידים מהמיקרו-גלים.
  הערה: אין לגעת או לתעתע את הכדורואידים.
4. מניחים מסננת הפיכה 37 מיקרומטר (או מסננת סטנדרטית 40 מיקרומטר) על גבי צינור חרוט 15 מ"ל כדי לאסוף את spheroids.
  הערה: אם אתם משתמשים במסננת סטנדרטית של 40 מיקרומטר, הניחו אותה במהופך.
5. בעדינות לשאוף את spheroids נעקר (משלב 1.4.3), ולהעביר את ההשעיה ספרואידית דרך מסננת.
  הערה: הכדורואידים יישארו על המסנן; תאים בודדים יזרמו דרך עם המדיום.
6. באמצעות פיפטה סרולוגית, לוותר 1 מ"ל של מדיום הבסיס חם על פני כל פני השטח של הבאר כדי לעקור את כל spheroids הנותרים לשחזר אותם על מסננת.
7. חזור על שלב כביסה זה 1.4.6 פעמיים.
8. שימו לב ללוח שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל הכדורואידים הוסרו מהמיקרווולים. חזור על הכביסה במידת הצורך (צעדים 1.4.6-1.4.7).
9. להפוך את מסננת, ומניחים אותו על צינור חרוט חדש 15 מ"ל. לאסוף את spheroids על ידי שטיפת מסננת עם מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף.
  הערה: הכדורואידים שנאספו מוכנים ליישומים וניתוחים במורד הזרם.
תרבות ארוכת טווח של ספרואידים
1. הכן 1.5% פתרון agarose במדיום בסיסי, לעקר אותו על ידי autoclaving (מחזור סטנדרטי).
2. בעוד הפתרון agarose הוא חם ועדיין נוזלי, לציפוי בארות של צלחות תרבות סטנדרטיות או מנות, כמתואר בטבלה 2.
  הערה: חימום המנה/צלחת בתנור יקל על שלב הציפוי. ניתן להשאיר כלים/ צלחות מצופים ב- RT עד 10 ימים בסביבה סטרילית ומוגנים מפני האור.
3. זרעו את הכדורואידים שנקטפו (משלב 1.4.9) בלוחות מצופים הארגרוז, והוסיפו מדיום מטריצת קרום DMEM/מרתף כדי להשיג את הנפח הסופי בהתאם לגודל הצלחת.
  הערה: כדי למנוע אגרגטים ספרואידיים, זרע אותם בצפיפות אופטימלית של 22 ספרואידים / ס"מ². שימו לב שהציפה אינה שטוחה לחלוטין, והיא עולה לכיוון הקצה, ויוצרת קהירות קלה במרכז הצלחת. אם מספר הכדורים גבוה מדי, סביר יותר שהם ידבקו זה בזה.
4. דגירה את הצלחת ב 37 °C/5% CO₂ עד התאוששות של spheroids לניתוחים ספציפיים_.
טיפול בספרואידים עם תרופות כימותרפיות
1. spheroids צלחת משלב 1.5.4, ולגדל אותם במשך 2 ימים. החל מהיום השלישי (D3), טפל בהם עם FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 מיקרוגרם / מ"ל; אירינוטקן, 100 מיקרוגרם/ מ"ל; Leucovorin, 25 מיקרוגרם / מ"ל) או עם FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 מיקרוגרם / מ"ל; אוקסליפלטין, 10 מיקרוגרם/ מ"ל; Leucovorin, 25 מיקרוגרם / מ"ל) שילובים משטר כימותרפי המשמשים באופן שגרתי לטיפול בחולי CRC²²^,²³^,²⁴^,²⁵, או לשמור אותם במצב (שליטה) לא מטופל (NT).
2. לאסוף את spheroids לאחר 3 ימים של טיפול באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך (1,000 קצה μL), להבטיח כי כל מצב מיוצג על ידי לפחות שלושה שכפולים. צנטריפוגה אותם ב 1,000 × g במשך 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
3. לתקן את כדורי 2% paraformaldehyde (PFA) לניתוח היסטולוגי (ראה סעיף 3), או להשתמש כדורי עבור מיצוי RNA (ראה סעיף 4).
4. כדי לנתח מוות של תאים, דגירה spheroids משלב 1.6.1 בתרבות השחורה גם צלחות DMEM / מרתף מטריצת מדיום במשך 30 דקות עם כתם חומצת גרעין (1:5000 דילול) שאינו מחלחל תאים חיים, אבל חודר את הקרומים בסכנה של תאים מתים²⁶. למדוד את הצטברות של פלואורסצנטיות עם קורא microplate.

2. ניטור צמיחת ספרואידים

באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לרכוש תמונות מייצגות של ספרואידים מתוחזקים בתנאים שונים לאורך כל הימים בתרבות.
לנתח את התמונות על ידי מדידת שלושה קטרים נציג שונים של כל ספרואיד באמצעות תוכנה מתאימה.
השתמש בנוסחה הבאה כדי להשיג את אמצעי האחסון המשוער.

הערה: המונחים d1, d2 ו- d3 הם שלושת הקוטרים של הכדורואיד.

3. שפעת אימונופלואורסצנטית (IF) וכתמים היסטולוגיים

קיבוע והטבעת פרפין
1. לאסוף את spheroids בנקודות זמן נבחרות באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך כמתואר בשלב 1.6.2, ולתקן אותם במשך 30 דקות ב RT ב 2% PFA.
  הערה: לחלופין, לאחסן את הדגימות בשלב זה ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
2. להטמעת פרפין, לשטוף את spheroids 3x עם PBS 1x, ו resuspend אותם 70% אתנול. לאחר הכללה וניתוח של פרפין, בצע כתמי המטוקסילין (H&E) לניתוח היסטולוגי.
אימונולה של סעיפי פרפין
הערה: השתמש בקטעים בעובי 5 מיקרומטר לחיסון עקיף.
1. דגירה שקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות כדי להמיס את השעווה ולשפר deparaffinization.
2. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 3 דקות במתילציקלוהקסאן.
3. לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 1:1 מתילציקלוהקסאן:100% אתנול.
4. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 3 דקות ב 100% אתנול.
  הערה: בצע את כל המניפולציות עבור שלב 3.2.2 לשלב 3.2.4 במכסה המנוע הכימי.
5. לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 90% אתנול.
6. לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 75% אתנול.
7. לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 50% אתנול.
8. לשטוף את המגלשות תחת מי ברז.
9. מחזרים את המגלשות במים מזוקקים במשך 5 דקות.
10. הכן 700 מ"ל של 0.01 M מאגר ציטראט, pH 6.0, ולהוסיף אותו מיכל מתאים (רוחב: 11.5 ס"מ, אורך: 17 ס"מ, גובה: 7 ס"מ); שקוע את השקופיות בתוכו. מחממים את המיכל במיקרוגל במשך 9-10 דקות ב 700 W, וכאשר הרתיחה מתחילה, להקטין את הכוח ל 400-450 W. דגירה במשך 10 דקות נוספות.
11. תן לשקופיות להתקרר במאגר ל- RT למשך כ- 30-40 דקות.
12. לשטוף את השקופיות פעמיים PBS במשך 5 דקות.
13. צייר עיגול סביב המקטעים באמצעות עט סימון כדי ליצור מחסום לנוזלים המוחלים על המקטעים.
14. דגירה כל קטע עם 50 μL של חיץ חסימה (10% סרום עזים רגיל, 1% אלבומין סרום שור (BSA), ו 0.02% טריטון X-100 ב PBS) לפחות 30 דקות ב RT.
15. הסר את מאגר החסימה, והוסף 50 μL של נוגדנים ראשוניים מדוללים במאגר הדגירה (1% סרום עזים רגיל, 0.1% BSA ו- 0.02% טריטון X-100 ב- PBS). דגירה במשך 2 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
16. הסר את הנוגדנים העיקריים, ולשטוף את השקופיות 3x ב PBS במשך 5 דקות.
17. דגירה שקופיות עם 50 μL של נוגדנים משניים פלואורסצנטי מדולל במאגר הדגירה במשך 1 שעות ב RT.
18. הסר את הנוגדנים המשניים, ולשטוף את השקופיות 3x ב PBS במשך 5 דקות.
19. הוסף 50 μL של מדיום הרכבה עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול לכל קטע, ומניחים כיסוי זכוכית על החלק.

4. מיצוי RNA, תגובת שרשרת שעתוק פולימראז הפוכה (RT-PCR), ו RT-PCR כמותי (qRT-PCR)

לאסוף ספרואידים בנקודות זמן שונות, כל נקודה המיוצגת על ידי לפחות שלושה שכפולים. צנטריפוגה אותם ב 1,000 × g במשך 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
הערה: כדורי יכול לשמש ישירות עבור מיצוי RNA או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
לבודד את ה-RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית, על פי הוראות היצרן.
תעתיק לאחור 500 ng של כל דגימת RNA לתוך DNA משלים (cDNA) עם ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן.
לאחר שעתוק הפוך, לבצע ניתוח PCR על 1 μL של cDNA כדי להגביר את גן משק הבית עם פריימרים הממוקמים exons שונים.
הערה: שלב זה מאפשר אימות של היעדר כל זיהום DNA גנומי בהכנות RNA. עבור פרוטוקול זה, פפטידיל רוליל isomerase B(PPIB) פריימרים שימשו.
בצע הגברה qPCR על 4 μL של cDNA מדולל בעבר (1:10 במים מזוקקים כפולים ללא RNAse) באמצעות פריימרים ספציפיים עבור הגנים של עניין. בכל מדגם, לכמת ביטוי mRNA ספציפי באמצעות שיטת ΔΔCt וערכים מנורמלים נגד רמות גנים משק בית.
הערה: עבור פרוטוקול זה, נבחר β-actin (ACTB). פריימנים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 3.

תוצאות

כמו חוסר הומוגניות בגודל של ספרואידים הוא אחד החסרונות העיקריים של מערכות תרבות 3D ספירואיד זמין כיום¹³, המטרה של עבודה זו הייתה להקים פרוטוקול אמין לשחזור כדי להשיג כדוריות הומוגניות. ראשית, כדי לקבוע תנאי עבודה אידיאליים, נבדקו מספר שונה של תאי Caco2, הנעים בין...

Discussion

אין ויטרו מודלים 3D להתגבר על החסרונות הניסיוניים העיקריים של תרביות תאים סרטניים 2D, כפי שהם נראים אמינים יותר recapitulating תכונות גידול טיפוסי כולל microenvironment והטרוגניות התא. מודלים תלת-ממדיים נפוצים של ספרואידים הם נטולי פיגומים (בתרבית בתנאים של התקשרות נמוכה) או מבוססי פיגומים (שימוש בביו-חו?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgements

אנו מכירים בפלטפורמות ההדמיה וההיסטולוגיה של אניפת רצ'ה (CRCL, CLB). אנו חייבים לבית המרקחת של בית החולים סנטר לאון ברארד (CLB) עבור המתנה האדיבה של FOLFOX ו FOLFIRI. אנו מודים גם לבריג'יט מנשיפ על הקריאה הביקורתית של כתב היד. העבודה נתמכה על ידי FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ועל ידי האינקה (PLBIO19-289). MVG ו- LC קיבלו תמיכה מה- FRM ו- CF שקיבלו תמיכה מקרן ARC ומהמרכז לאון ברארד.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 µm Reversible Strainer, Large	STEMCELL Technologies	27250	To be used with 50 mL conical tubes
5-Fluorouracil	Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)	-	stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-well plates	STEMCELL Technologies	34411	1,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Rat	Invitrogen	14-133-82	dilution 1:100
Anti-CD44 -Rabbit	Abcam	ab157107	dilution 1:2000
Anti-PCNA - Mouse	Dako	M0879	dilution 1:1000
Anti-β-catenin - Mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	dilution 1:50
Black multiwell plates	Thermo Fisher Scientific	237108
Citric Acid Monohydrate	Sigma	C1909
CLARIOstar apparatus	BMG Labtech		microplate reader
Dako pen			marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel mounting medium with DAPI	Interchim	FP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	dilution 1:1000
ImageJ software			Spheroid image analysis
Irinotecan	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Gift from Pharmacy CLB	-	stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)	Gibco	25300062
Zeiss-Axiovert microscope			inverted microscope for acquiring images of spheroids

References

Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annual Review of Pathology. 6 (1), 479-507 (2011).
Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
Weiswald, L. -. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
Silva-Almeida, C., Ewart, M. -. A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167 Caco2

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: