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Resumo

Este protocolo apresenta um novo, robusto e reprodutível sistema cultural para gerar e cultivar esferoides tridimensionais a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2. Os resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação dessa abordagem para estudar a biologia das células-tronco do câncer, incluindo a resposta à quimioterapia.

Resumo

Os cânceres colorretais são caracterizados pela heterogeneidade e uma organização hierárquica composta por uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) responsáveis pelo desenvolvimento do tumor, manutenção e resistência aos fármacos. Uma melhor compreensão das propriedades do CSC para seu direcionamento específico é, portanto, um pré-requisito para uma terapia eficaz. No entanto, há uma escassez de modelos pré-clínicos adequados para investigações aprofundadas. Embora as linhas de células cancerígenas in vitro bidimensionais (2D) forneçam insights valiosos sobre a biologia tumoral, elas não replicam a heterogeneidade fenotípica e genética do tumor. Em contraste, modelos tridimensionais (3D) abordam e reproduzem a complexidade do câncer quase fisiológico e a heterogeneidade celular. O objetivo deste trabalho foi projetar um sistema de cultura 3D robusto e reprodutível para estudar biologia CSC. A presente metodologia descreve o desenvolvimento e otimização das condições para a geração de esferoides 3D, que são homogêneos em tamanho, a partir de células de adenocarcinoma de cólon caco2, modelo que pode ser utilizado para a cultura de longo prazo. É importante ressaltar que, dentro dos esferoides, as células que se organizavam em torno de estruturas semelhantes ao lúmen, foram caracterizadas por padrões diferenciais de proliferação celular e pela presença de CSCs expressando um painel de marcadores. Esses resultados fornecem a primeira prova de conceito para a adequação desta abordagem 3D para estudar heterogeneidade celular e biologia CSC, incluindo a resposta à quimioterapia.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) continua sendo a segunda principal causa de mortes associadas ao câncer no mundo1. O desenvolvimento do CRC é resultado de uma progressiva aquisição e acúmulo de mutações genéticas e/ou alterações epigenéticas2,3, incluindo a ativação de oncogenes e a inativação dos genes supressores tumorais3,4. Além disso, fatores não genéticos (por exemplo, o microambiente) podem contribuir e promover a transformação oncogênica e, assim, participar da evolução dos CRCs5. É importante ressaltar que os CRCs são compostos por diferentes populações celulares, incluindo CSCs indiferenciados e células tumorais a granel exibindo alguns traços de diferenciação, que constituem uma estrutura hierárquica que lembra a organização do epitélio em uma cripta normal de cólon6,7.

Os CSCs são considerados responsáveis pela aparência do tumor8,sua manutenção e crescimento, capacidade metastática e resistência às terapias convencionais6,7. Dentro dos tumores, as células cancerígenas, incluindo os CSCs, apresentam um alto nível de heterogeneidade e complexidade em termos de seus distintos perfis mutacionais e epigenéticos, diferenças morfológicas e fenotípicas, expressão genética, metabolismo, taxas de proliferação e potencial metastático9. Portanto, para entender melhor a biologia do câncer, a progressão do tumor e a aquisição da resistência à terapia e sua tradução para tratamentos eficazes, modelos pré-clínicos humanos que capturam essa heterogeneidade e hierarquia do câncer são importantes10,11.

As linhas in vitro de células cancerígenas 2D têm sido usadas há muito tempo e fornecem insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor e os mecanismos subjacentes à eficácia das moléculas terapêuticas. No entanto, sua limitação em relação à falta da heterogeneidade fenotípica e genética encontrada nos tumores originais é agora amplamente reconhecida12. Além disso, nutrientes, oxigênio, gradientes de pH e o microambiente tumoral não são reproduzidos, sendo o microambiente especialmente importante para a manutenção de diferentes tipos celulares, incluindo CSCs11,12. Para superar essas principais desvantagens, vários modelos 3D foram desenvolvidos para abordar experimentalmente e reproduzir a complexidade e heterogeneidade dos cânceres. Com efeito, esses modelos recapitulam a heterogeneidade celular tumoral, interações células celulares e arquitetura espacial, semelhantes às observadas in vivo12,13,14. Os organoides tumorais primários estabelecidos a partir de tumores frescos, bem como esferoides derivados de linhas celulares, são em grande parte empregados15,16.

Esferoides podem ser cultivados de uma maneira livre de andaimes ou baseados em andaimes para forçar as células a se formarem e crescerem em agregados celulares. Os métodos livres de andaimes baseiam-se na cultura das células em condições não aderentes (por exemplo, o método de queda suspensa ou placas de fixação ultra-baixas), enquanto os modelos baseados em andaimes dependem de biomateriais naturais, sintéticos ou híbridos para células culturais12,13,14. Os esferoides à base de andaimes apresentam diferentes desvantagens, pois a formação final de esferoides dependerá da natureza e composição do (bio)material utilizado. Embora os métodos esferoides livres de andaimes disponíveis até agora não dependam da natureza do substrato, eles geram esferoides que variam em estrutura e tamanho17,18.

Este trabalho teve como objetivo projetar um robusto e reprodutível sistema de cultura 3D de esferoides, que são homogêneos em tamanho, composto por células de adenocarcinoma de cólon caco2 para estudar biologia CSC. As células caco2 são de particular interesse devido à sua capacidade de diferenciar ao longo do tempo19,20, sugerindo fortemente um potencial semelhante a uma haste. Assim, a cultura de longo prazo dos esferoides revelou a presença de diferentes populações de CSC com diferentes respostas à quimioterapia.

Protocolo

NOTA: Os detalhes de todos os reagentes e materiais estão listados na Tabela de Materiais.

1. Formação esferoide

  1. Mídia de cultura esféide
    1. Prepare o meio basal composto pelo DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco, complementado com dipeptida l-alanyl-L-glutamina de 4 mM.
    2. Prepare o MDM MÉDIO completo contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (Pen/Estreptomicina) em meio basal a partir da etapa 1.1.1.
    3. Prepare o meio da matriz de membrana DMEM/porão contendo matriz de membrana de 2,5% no porão, 10% FBS e 1% Caneta/Estreptococos em meio basal a partir da etapa 1.1.1.
  2. Preparação de placas para formação de esferoides
    1. O meio de matriz de membrana basal quente e DMEM/porão em temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 20 minutos.
    2. Pré-traça os poços de uma placa de 24 poços dedicada à formação de esferoides adicionando 500μL de solução anti-adesão para cada poço.
      NOTA: Nestas placas, cada poço é composto por 1.200 microwells.
    3. Centrifugar a placa a 1.200 × g por 5 min em um rotor de balde balançando com adaptadores para placas.
      NOTA: Se apenas uma placa for usada, prepare uma placa padrão adicional cheia de água para contrabalançar o peso.
    4. Enxágüe cada poço com 2 mL de meio basal quente e aspire o meio dos poços.
    5. Observe a placa sob o microscópio para garantir que as bolhas tenham sido completamente removidas dos microwells. Se as bolhas permanecerem presas, centrífuga novamente a 1.200 × g por 5 minutos para eliminar as bolhas.
    6. Repita as etapas de lavagem 1.2.4-1.2.5.
    7. Adicione 1 mL de matriz de membrana DMEM quente/porão para cada poço.
  3. Geração de esferoides
    1. Cultivar as células Caco2 em uma monocamada 2D em DMEM médio suplementado com 10% de FBS e 1% Caneta/Estreptococos a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 (doravante referido como 37 °C/5% CO2).
      NOTA: O número máximo de passagens celulares a serem utilizadas é de 80.
    2. Quando 80% da confluência for atingida, lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) 1x (5 mL para um prato de 10 cm), adicione o ácido tetraacético de trippsin-etilenodiamina (EDTA) (2 mL para um prato de 10 cm) e incuba por 2-5 min a 37 °C/5% CO2.
    3. Verifique o desprendimento celular sob o microscópio e neutralize a trippsina adicionando 4 mL de DMEM meio completo por prato de 10 cm.
    4. Conte células usando um hemócito para determinar o número total de células.
    5. Centrifugar a suspensão celular a 1.200 × g por 5 min. Descarte o supernasce e resuspenque a pelota em um volume apropriado de meio de matriz de membrana DMEM/porão.
    6. Consulte a Tabela 1 para determinar o número de células necessárias por poço para alcançar o número desejado de células por microwell. Alternativamente, calcule o número de células usando a seguinte fórmula para uma placa de 24 poços, considerando que cada poço contém 1.200 microwells
      Número necessário de células por poço = Número desejado de células por microwell × 1.200
    7. Adicione o volume necessário da suspensão da célula a cada poço para alcançar o número de célula desejado em um volume final de 1 mL.
    8. Adicione 1 mL de matriz de membrana DMEM/porão média para cada poço para atingir o volume final de 2 mL por poço (veja também o passo 1.2.7).
      NOTA: Tenha cuidado para não introduzir bolhas nos microwells.
    9. Centrifugar a placa imediatamente a 1.200 × g por 5 minutos para capturar as células nos microwells. Se necessário, contrabalanceia a centrífuga com uma placa padrão cheia de água.
    10. Observe a placa sob o microscópio para verificar se as células estão distribuídas uniformemente entre os microwells.
    11. Incubar a placa a 37 °C/5% de CO2 por 48 h sem perturbar a placa.
      NOTA: De acordo com o protocolo original21, embora muitas linhas celulares possam formar esferoides dentro de 24 horas, algumas requerem um tempo de incubação mais longo. Neste protocolo, 48 h são suficientes para a formação de esferoides.
  4. Colhendo os esferoides dos microwells
    1. Aqueça o meio da matriz de membrana basal e DMEM/porão em RT por aproximadamente 20 minutos.
    2. Utilizando uma pipeta sorológica, remova metade do meio de cultura (1 mL) de cada poço.
    3. Adicione o meio de volta à superfície do poço para desalojar os esferoides dos microwells.
      NOTA: Não toque ou tritura os esferoides.
    4. Coloque um coador reversível de 37 μm (ou um coador padrão de 40 μm) na parte superior de um tubo cônico de 15 mL para coletar os esferoides.
      NOTA: Se usar um coador padrão de 40 μm, coloque-o de cabeça para baixo.
    5. Aspire suavemente os esferoides desalojados (a partir da etapa 1.4.3), e passe a suspensão esferoide através do coador.
      NOTA: Os esferoides permanecerão no filtro; células únicas fluirão através do meio.
    6. Usando uma pipeta sorológica, dispense 1 mL do meio basal quente em toda a superfície do poço para desalojar quaisquer esferoides restantes e recuperá-los no coador.
    7. Repita esta etapa de lavagem 1.4.6 duas vezes.
    8. Observe a placa sob o microscópio para garantir que todos os esferoides tenham sido removidos dos microwells. Repita a lavagem se necessário (etapas 1.4.6-1.4.7).
    9. Inverta o coador e coloque-o em um novo tubo cônico de 15 mL. Colete os esferoides lavando o coador com meio de matriz de membrana DMEM/porão.
      NOTA: Os esferoides coletados estão prontos para aplicações e análises a jusante.
  5. Cultura de longo prazo de esferoides
    1. Prepare a solução de 1,5% de agarose em meio basal e esterilize-a por autoclaving (ciclo padrão).
    2. Enquanto a solução agarose é quente e ainda líquida, cubra os poços de pratos ou pratos de cultura padrão, conforme descrito na Tabela 2.
      NOTA: Aquecer o prato/prato no forno facilitará a etapa de revestimento. Pratos/pratos revestidos podem ser deixados na RT por até 10 dias em um ambiente estéril e protegidos da luz.
    3. Sementes os esferoides colhidos (a partir da etapa 1.4.9) nas placas revestidas de agarose, e adicionem o meio de matriz de membrana DMEM/porão para alcançar o volume final, dependendo do tamanho da placa.
      NOTA: Para evitar agregados eferóides, semeá-los na densidade ideal de 22 esferoides/cm2. Observe que o revestimento não é perfeitamente plano, e ele sobe em direção à borda, criando uma leve concavidade no centro da placa. Se o número de esferoides é muito alto, eles são mais propensos a aderir uns aos outros.
    4. Incubar a placa a 37 °C/5% de CO2 até a recuperação dos esferoides para análises específicas.
  6. Tratamento de esferoides com quimioterapia
    1. Placas esferoides do passo 1.5.4, e plantá-los por 2 dias. A partir do dia 3 (D3), trate-os com FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Irinotecan, 100 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) ou com FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/mL; Oxaliplatina, 10 μg/mL; Leucovorina, 25 μg/mL) combinações de regime quimioterápico rotineiramente utilizado para tratar pacientes com CRC22,23,24,25, ou mantê-los em (controle) não tratado (NT).
    2. Colete os esferoides após 3 dias de tratamento usando uma pipeta com a ponta cortada (ponta de 1.000 μL), garantindo que cada condição seja representada por pelo menos três réplicas. Centrifuá-los a 1.000 × g por 3 min, e depois remover o supernante.
    3. Fixar as pelotas em 2% de paraformaldeído (PFA) para análise histológica (ver seção 3) ou usar as pelotas para extração de RNA (ver seção 4).
    4. Para analisar a morte celular, incubar os esferoides do passo 1.6.1 na cultura negra bem placas em DMEM/porão matriz de membrana média por 30 min com uma mancha de ácido nucleico (diluição 1:5000) que não permeia células vivas, mas penetra nas membranas comprometidas das células mortas26. Meça o acúmulo de fluorescência com um leitor de microplaca.

2. Monitoramento do crescimento de spheroid

  1. Utilizando um microscópio invertido, adquira imagens representativas de esferoides mantidos em diferentes condições ao longo dos dias na cultura.
  2. Analise as imagens medindo três diâmetros representativos diferentes de cada esferoide usando software apropriado.
  3. Use a seguinte fórmula para obter o volume estimado da esfera.
    figure-protocol-8934

    NOTA: Os termos, d1, d2 e d3, são os três diâmetros do esferoide.

3. Imunofluorescência (IF) e coloração histológica

  1. Fixação e incorporação de parafina
    1. Colete os esferoides em pontos de tempo selecionados usando uma pipeta com a ponta cortada conforme descrito na etapa 1.6.2, e fixe-os por 30 min em RT em 2% pfa.
      NOTA: Alternativamente, armazene as amostras nesta etapa a 4 °C até que use mais.
    2. Para incorporação de parafina, lave os esferoides 3x com PBS 1x e resuspensá-los em 70% de etanol. Após inclusão e secção de parafina, realize a coloração de hematoxilina & eosina (H&E) para análise histológica.
  2. Imunolabelamento de seções de parafina
    NOTA: Use seções de 5-μm de espessura para imunossão indireta.
    1. Incubar lâminas a 60 °C por 2h para derreter a cera e melhorar a desparafinação.
    2. Lave os slides duas vezes por 3 minutos em metilciclone.
    3. Lave os slides por 3 min em 1:1 metilcicclohexano:100% etanol.
    4. Lave os slides duas vezes por 3 min em 100% etanol.
      NOTA: Realize todas as manipulações para a etapa 3.2.2 para a etapa 3.2.4 em um capô químico.
    5. Lave os slides por 3 min em 90% de etanol.
    6. Lave os slides por 3 min em 75% de etanol.
    7. Lave os slides por 3 min em 50% de etanol.
    8. Lave os slides sob a água da torneira.
    9. Reidratar os slides em água destilada por 5 minutos.
    10. Prepare 700 mL de tampão citrato de 0,01 M, pH 6.0, e adicione-o a um recipiente adequado (largura: 11,5 cm, comprimento: 17 cm, altura: 7 cm); submergir os slides nele. Aqueça o recipiente no micro-ondas por 9-10 min a 700 W, e quando a ebulição começar, diminua a potência para 400-450 W. Incubar por mais 10 minutos.
    11. Deixe os slides esfriarem no buffer para RT por aproximadamente 30-40 min.
    12. Lave os slides duas vezes em PBS por 5 minutos.
    13. Desenhe um círculo ao redor das seções com uma caneta marcadora para criar uma barreira para líquidos aplicados às seções.
    14. Incubar cada seção com 50 μL de tampão de bloqueio (10% soro de cabra normal, 1% albumina de soro bovino (BSA) e 0,02% Triton X-100 em PBS) por pelo menos 30 min na RT.
    15. Remova o tampão de bloqueio e adicione 50 μL de anticorpos primários diluídos no tampão de incubação (soro de cabra normal de 1%, 0,1% BSA e 0,02% Triton X-100 em PBS). Incubar por 2 h no RT ou durante a noite a 4 °C.
    16. Remova os anticorpos primários e lave os slides 3x em PBS por 5 minutos.
    17. Incubar os slides com 50 μL de anticorpos secundários fluorescentes diluídos no tampão de incubação por 1 h no RT.
    18. Remova os anticorpos secundários e lave os slides 3x em PBS por 5 minutos.
    19. Adicione 50 μL de meio de montagem com 4′,6-diamidino-2-fenilôdole em cada seção e coloque um deslizamento de vidro sobre a seção.

4. Extração de RNA, reação em cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

  1. Coletar esferoides em diferentes pontos de tempo, cada ponto representado por pelo menos três réplicas. Centrifuá-los a 1.000 × g por 3 min, e depois remover o supernante.
    NOTA: As pelotas podem ser usadas diretamente para extração de RNA ou armazenadas a -20 °C até serem utilizadas posteriormente.
  2. Isole o RNA total usando um kit comercial de isolamento de RNA, de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Transcreva inversa 500 ng de cada amostra de RNA em DNA complementar (cDNA) com um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Após transcrição reversa, realize uma análise pcr em 1 μL de cDNA para amplificar um gene de limpeza com primers localizados em diferentes exons.
    NOTA: Esta etapa permite a verificação da ausência de qualquer contaminação genômica de DNA nas preparações do RNA. Para este protocolo, foram utilizados primers de isomerase de peptidylprolyl B(PPIB).
  5. Realize a amplificação qPCR em 4 μL de cDNA previamente diluída (1:10 em água dupla-destilada sem RNAse) usando primers específicos para os genes de interesse. Em cada amostra, quantifique a expressão específica de mRNA usando o método ΔΔCt e valores normalizados em relação aos níveis genéticos de limpeza.
    NOTA: Para este protocolo, foi selecionado β-actin(ACTB). Os primers usados neste protocolo estão listados na Tabela 3.

Resultados

Como a falta de homogeneidade no tamanho dos esferoides é uma das principais desvantagens dos sistemas de cultura 3D3D 13disponíveis atualmente, o objetivo deste trabalho foi criar um protocolo confiável e reprodutível para obter spheroids homogêneos. Primeiro, para estabelecer condições ideais de trabalho, foram testados diferentes números de células Caco2, variando de 50 a 2.000 células por microwell/esferoide utilizando placas dedicadas(Tabela ...

Discussão

Modelos 3D in vitro superam as principais desvantagens experimentais das culturas de células cancerígenas 2D, pois parecem ser mais confiáveis na recapitulação de características tumorais típicas, incluindo microambiente e heterogeneidade celular. Modelos 3D comumente usados de esferoides são livres de andaimes (cultivados em condições de baixa fixação) ou baseados em andaimes (usando biomateriais para células de cultura). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, pois dependem da natureza do andaim...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

Reconhecemos as plataformas de histologia de recherche de imagem e anipath (CRCL, CLB). Estamos em dívida com a farmácia do Hospital Centro Léon Bérard (CLB) pelo tipo presente do FOLFOX e FOLFIRI. Agradecemos também a Brigitte Manship pela leitura crítica do manuscrito. A obra contou com o apoio da FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) e do Inca (PLBIO19-289). A MVG e a LC receberam apoio da FRM e cf recebeu apoio da fundação ARC e do Centro Léon Bérard.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
37 µm Reversible Strainer, Large STEMCELL Technologies27250To be used with 50 mL conical tubes
5-FluorouracilGift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB)-stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL
Agarose SigmaA9539
Aggrewell 400 24-well platesSTEMCELL Technologies344111,200 microwells per well for spheroid formation and growth
Anti Caspase3 - RabbitCell Signaling9661dilution 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - RateBioscience/Thermo Fisher14-9896-82dilution 1:500
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mLSTEMCELL Technologies07010
Anti-CD133 (13A4) - RatInvitrogen14-133-82dilution 1:100
Anti-CD44 -RabbitAbcamab157107dilution 1:2000
Anti-PCNA - MouseDakoM0879dilution 1:1000
Anti-β-catenin - MouseSanta Cruz Biotechnologysc-7963dilution 1:50
Black multiwell platesThermo Fisher Scientific237108
Citric Acid MonohydrateSigmaC1909
CLARIOstar apparatus BMG Labtechmicroplate reader
Dako penmarker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21202dilution 1:1000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10037dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA21206dilution 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA10042dilution 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)Gibco10569010
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000044
Fluorogel mounting medium with DAPIInterchimFP-DT094B
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA11077dilution 1:1000
ImageJ softwareSpheroid image analysis
Irinotecan Gift from Pharmacy CLB-stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL
iScript reverse transcriptase Bio-Rad1708891
LeucovorinGift from Pharmacy CLB-stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning354234Basement membrane matrix
Nucleospin RNA XS KitMacherey-Nagel740902 .250
OxaliplatinGift from Pharmacy CLB-stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL
Penicillin-streptomycinGibco15140130
Phosphate Buffer Saline (PBS)Gibco14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TakaraRR420B
SYTOX- GreenThermo Fisher ScientificS7020nucleic acid stain; dilution 1:5000
Trypsin-EDTA (0.05 %)Gibco25300062
Zeiss-Axiovert microscopeinverted microscope for acquiring images of spheroids

Referências

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