جمع العينات وتحليل ميكروبيوم الاثني عشر

Summary

في هذه المخطوطة ، نناقش طريقة جديدة لأخذ عينات وتحليل ميكروبيوم الاثني عشر. توفر هذه الطريقة تصويرا دقيقا للتنوع الميكروبي وتكوينه في الاثني عشر ويمكن أن تكون مفيدة لمزيد من التحقيق في ميكروبيوم الاثني عشر.

Abstract

ارتبطت التحولات في الميكروبيوم بفسيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية للعديد من أنظمة الأعضاء في كل من البشر ونماذج الفئران. تمت دراسة ميكروبيوم الأمعاء عادة من خلال مجموعات عينات البراز. أدت سهولة الحصول على عينات البراز إلى العديد من الدراسات التي كشفت عن معلومات تتعلق بالجهاز الهضمي اللمعي البعيد. ومع ذلك ، فقد تناولت دراسات قليلة أهمية الميكروبيوم في الأمعاء القريبة. بالنظر إلى أن الاثني عشر هو موقع رئيسي للهضم والامتصاص ، فإن ميكروبيومها وثيق الصلة بالتغذية وأمراض الكبد ويستدعي مزيدا من التحقيق. نوضح هنا بالتفصيل طريقة جديدة لأخذ عينات من ميكروبيوم الأمعاء اللمعية والمخاطية القريبة في البشر الذين يخضعون للتنظير العلوي عن طريق الحصول على شفط الاثني عشر والخزعة. شراء العينات سهل ولا يتأثر بالقطع الأثرية مثل الالتزام التحضيري للمريض ، كما هو الحال في الحصول على عينات القولون أثناء تنظير القولون. تظهر النتائج الأولية أن الميكروبيوم اللمعي والمخاطي يختلفان اختلافا كبيرا ، والذي من المحتمل أن يكون مرتبطا بالظروف البيئية ووظائف الحاجز. لذلك ، يكشف مزيج من نفطة الاثني عشر والخزعات عن صورة أكثر شمولا للميكروبيوم في الاثني عشر. يتم الحصول على الخزعات من الأجزاء الهابطة والأفقية من الاثني عشر ، والتي تكون قريبة تشريحيا من الكبد والشجرة الصفراوية. هذا مهم في دراسة دور بيولوجيا الأحماض الصفراوية ومحور الأمعاء والكبد في أمراض الكبد. يمكن استخدام الخزعات والشفط لتسلسل الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S ، والتمثيل الغذائي ، والتطبيقات المماثلة الأخرى.

Introduction

أصبح الميكروبيوم المعوي مجالا ذا اهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. من المفهوم الآن أن مجموعة البكتيريا المتنوعة في الأمعاء يمكن أن تختلف بناء على مجموعة متنوعة من العوامل ، بما في ذلك علم الوراثة والنظام الغذائي والأدوية والتأثيرات^{البيئية 1}. حددت الدراسات أيضا ملامح ميكروبية فريدة مرتبطة بأمراض الجهاز الهضمي المختلفة ، مثل السمنة وأمراض التهاب الأمعاء وأمراض الكبد^2،3. تركز غالبية الدراسات على تحديد ملامح ميكروبيوم الأمعاء الغليظة من خلال تحليل عينات الغشاء المخاطي البرازية^{والبعيدة 4}. على الرغم من أن أعلى تركيز للبكتيريا المعوية موجود في القولون (10¹² بكتيريا / جرام) ، إلا أن هناك مجتمعا معقدا من الميكروبات الموجودة في الاثني عشر (10³ / جم) ، الصائم (10⁴ / جم) ، والدقاق (10⁷ / جم) التي تلعب دورا رئيسيا في التمثيل الغذائي الهضمي والامتصاص⁵.

تعمل الأمعاء الدقيقة كموقع أساسي لانهيار المغذيات وامتصاصها في الجهاز الهضمي. تلعب البكتيريا المبطنة للأمعاء الدقيقة دورا أساسيا في المساعدة في الانهيار الكيميائي للركائز الغذائية وفي إطلاق المركبات النشطة بيولوجيا التي تساعد في امتصاص العناصر^{الغذائية 6}. تساهم هذه التفاعلات في بيئة معقدة من الميكروبات والميكروبات المضيفة ونشاط الميكروبات المضيفة في الأمعاء^{الدقيقة 7}. وجدت دراسة راقبت ميكروبات الأمعاء الدقيقة في نماذج الفئران أن الفئران الخالية من الجراثيم التي تتغذى على نظام غذائي غني بالدهون قد أضعفت امتصاص الدهون ، ولكن عندما استعمرت بالميكروبات الصائمية ، كان لديها زيادة مباشرة في امتصاص الدهون⁶. وجدت دراسة تجريبية بشرية توصيف الجراثيم الاثني عشر للأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة والأصحاء أن الجراثيم الاثني عشر للأفراد الذين يعانون من السمنة المفرطة لديها تغييرات في مسارات انهيار الأحماض الدهنية والسكروز ، والتي من المحتمل أن تكون مستحثة في علاقة تعتمد على النظام^{الغذائي 8}. علاوة على ذلك ، تم تحديد خلل التنسج في ميكروبات الأمعاء الدقيقة في العديد من الأمراض بما في ذلك فرط نمو بكتيريا الأمعاء الدقيقة ، ومتلازمة الأمعاء القصيرة ، والتهاب الجيب ، والخلل المعوي البيئي ، ومتلازمة القولون العصبي⁷.

نحن مهتمون بالعلاقة بين الميكروبيوم والمراحل المختلفة لأمراض الكبد المزمنة. على وجه التحديد ، يعمل الاثني عشر كموقع أول للانهيار الكيميائي والامتصاص الغذائي في الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجلب الدورة الدموية الكبدية البابية العناصر الغذائية والمستقلبات إلى الكبد ، حيث تتم معالجتها وتنظيمها في مجرى الدم. يخلق القرب التشريحي بين الأمعاء والكبد بيئة عرضة للاستجابات المؤيدة للالتهابات التي يمكن أن تنشأ بسبب فشل حاجز الأمعاء أو التغيرات في ميكروبيوم الأمعاء⁹. حددت الدراسات التي تبحث في تطور الميكروبيوم وأمراض الكبد خلل التنسج الميكروبي في المرضى الذين يعانون من مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والتهاب الكبد الدهني (NASH) ، ومرض الكبد الكحولي ، وتليف^{الكبد 10،11}. في حين أن غالبية الدراسات تميز ميكروبيوم القولون ، فقد كنا مهتمين بالتحقيق في ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة فيما يتعلق بأمراض الكبد. من خلال استخدام الطريقة الجديدة المعروضة هنا ، حددنا الملامح الميكروبية الفريدة للاثني عشر في المرضى الذين يعانون من تليف الكبد فيما يتعلق بالنظام الغذائي¹².

نظرا لأن توصيف ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة لا يزال مجالا ذا أهمية متزايدة ، فمن الضروري تطوير تقنيات موحدة للحصول على عينات تمثل بدقة ميكروبات الأمعاء الدقيقة. ومع ذلك ، هناك تحديات مرتبطة بشراء العينات التي أدت إلى تعقيد دراسة بيئة ميكروبيوم الأمعاء الدقيقة. تتطلب طرق أخذ العينات الحالية إجراءات جراحية غالبا ما تكون عرضة للتلوث ، كما هو موضح من قبل Kastl et al⁷. نشرح هنا بالتفصيل طريقة جديدة للحصول على شفط الاثني عشر والخزعات للتحليل الميكروبي من المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الذين يخضعون لتنظير المريء والمعدة والاثني عشر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحصول على عينات من الاثني عشر في نظام الرعاية الصحية لشؤون المحاربين القدامى في لوس أنجلوس الكبرى ، ومركز سيدارز سيناي الطبي ، ومركز رونالد ريغان الطبي بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس بعد قبول البروتوكول السريري لدراسة الميكروبيوم والعلامات الميكروبية وأمراض الكبد (M3LD) من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجنة مراجعة الأخلاقيات المحلية. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى المشاركين.

1. موافقة المشاركين

1. اقترب من الأشخاص الذين تم تشخيص تليف الكبد من أي مسببات باستخدام التنظير الداخلي المقرر لفحص الدوالي أو ارتفاع ضغط الدم البابي للتجنيد. استبعاد المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الكبدية (HCC).
2. قدم الدراسة ، وتأكد بعناية من فهم المشاركين ، واسأل المشارك عما إذا كان يرغب في التطوع في الدراسة. أكمل نموذج الموافقة المستنيرة إذا وافقوا.
3. تأكد من أن أخصائي طبي مدرب ومعتمد بشكل صحيح يقوم بإجراء التنظير الداخلي.

2. جمع العينات

1. تخدير المريض ب 50 مجم من الفنتانيل و 2 مجم من الميدازولام. قم بزيادة الجرعة حسب الحاجة حتى يتم تخدير المريض بشكل معتدل ويمكنه تحمل المنظار الداخلي.
2. أدخل منظارا داخليا (على سبيل المثال ، Pentax EG29-i10) في مريء المريض وتقدم نحو البواب.
   ملاحظة: سيختلف حجم المنظار بناء على فسيولوجيا المريض. لا تستخدم المنظار الداخلي لأي شفط قبل جمع العينة لتجنب تلويث قناة المنظار بإفرازات المعدة أو البلعوم.
3. احصل على شريحة مجهرية وإبرة حقنة غير حادة عيار 18 للتحضير لشراء العينات. قم بإعداد وسادة معقمة ستستخدم لنقل الخزعات من شريحة المجهر إلى المجهر.
4. عندما يصل المنظار إلى الجزء الثاني من الاثني عشر البعيد عن أمبولة Vater ، قم بشفط أي سائل موجود من خلال قسطرة شفط معقمة يمكن التخلص منها تمر عبر قناة العمل الخاصة بالمنظار العلوي واجمعها في حاوية عينة يمكن التخلص منها سعة 40 مل. اغسل ما يصل إلى 30 مل من الماء المعقم الإضافي عن طريق المحقنة في الاثني عشر وشفط السائل في مصيدة عينة سائلة لجمع إجمالي 15 مل.
5. قم بإزالة حاوية الشفط المرفقة بمكون الشفط في القسطرة على الفور وقم بتغطيتها. ضع الحاوية في الترمس فوق الثلج وفي كيس نقل العينات لنقلها إلى مختبر المعالجة.
6. أدخل ملقط خزعة أحادي الاستخدام مقاس 2.8 مم في المنفذ الموجود على جانب المنظار الداخلي لإزالة عينات الأنسجة للبحث. قم بإجراء تمريرتين عشوائيتين من الملقط داخل الجزء الثاني من الاثني عشر ، وجمع لدغتين من الأنسجة في كل تمريرة.
7. استخدم إبرة حقنة غير حادة عيار 18 لاستخراج عينات الأنسجة من الملقط وعلى شريحة المجهر قبل نقل العينات إلى أربع مباردات فارغة منفصلة سعة 2 مل. برغي بإحكام على الأغطية.
8. أدخل جميع 4 أنواع كريوفيال مغطاة بإحكام في وعاء فارغ ، مثل كوب البول ، وقم بإنشاء حمام يتكون من 20 مل من الإيثانول والثلج الجاف ، لتجميد الخزعات.
9. ضع الخزعة المبردة في وعاء معزول من الستايروفوم على طبقة من الثلج الجاف وانقل العينات إلى فريزر -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل للحفاظ على العينات.

3. معالجة الشفط

1. بعد جمع العينات الحيوية ، انقل العينات الحيوية على الفور إلى مختبر BSL2 أو أعلى للمعالجة.
2. اقلب حاوية سائل الشفط برفق أربع مرات ، ثم قم بتحويل ما يقرب من 1.5 مل من السائل إلى 2 مل من التبريد.
3. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى يمكن إجراء تحليل الدفعات.

4. إدارة الاستبيان وجمع البيانات السريرية

1. اطلب من المشاركين إكمال الاستبيانات للحصول على معلومات عن النظام الغذائي والتركيبة السكانية وعادات التدخين / الكحول والحالات الطبية / الأدوية ونوعية الحياة¹³.
2. راجع المخططات الطبية لالتقاط البيانات السريرية بما في ذلك المختبرات السريرية وبيانات التصوير والأدوية والمضاعفات الطبية.

5. استخراج الحمض النووي

1. قم بإجراء استخراج الحمض النووي فور إزالة خزعات الاثني عشر والشفط من التخزين عند -80 درجة مئوية. لا توجد خطوات تحضيرية مطلوبة لاستخراج الحمض النووي من عينات خزعة الاثني عشر.
2. إجراء استخراج الحمض النووي وتسلسله لجميع العينات في نفس اليوم لتقليل مخاطر تأثير الدفعة في التحليل. قم بإعداد مكتبة خاصة بالعينات التي تم جمعها قبل تسلسل العينات.
3. استخدم مجموعة أدوات التحضير الدقيق للحمض النووي لاستخراج الحمض النووي من عينات خزعة الاثني عشر ، وفقا لبروتوكول الشركة^{المصنعة 14}.
4. أضف الحد الأقصى لكمية العينة لكل إرشادات بروتوكول إلى أنبوب تحلل يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول التحلل وحجم جاف 0.7 مل من الخرز الزجاجي 2 مم.
5. قم بتأمين أنابيب التحلل في مضرب حبة بحامل أنبوب وقم بتشغيل الخافق بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق على الأقل. سيختلف الوقت بناء على مضرب الخرزة والعينة التي يتم تحليلها.
6. الطرد المركزي أنابيب التحلل في جهاز طرد مركزي دقيق عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
7. انقل ما يصل إلى 400 ميكرولتر من المادة الطافية من خلال أنبوب تجميع مفلتر وجهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 8000 × جم لمدة 1 دقيقة.
8. أضف 1200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم إلى المرشح في أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه جيدا حتى يتجانس.
9. انقل 800 ميكرولتر من الخليط إلى عمود الدوران ومجموعة الأنبوب. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق.
10. ضع عمود الدوران على أنبوب طرد مركزي جديد مع 400 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي واخلطه جيدا حتى يتجانس. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق.
11. كرر الخطوة 5.10 مرتين ، مع 700 ميكرولتر ثم 200 ميكرولتر مخزن غسيل الحمض النووي لكل غسلة.
12. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي جديد. احتضن لمدة دقيقة واحدة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة لتصفية الحمض النووي. تجاهل العمود.
13. قم بتصفية الحمض النووي مرة أخرى. الحمض النووي جاهز الآن لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

6. تضخيم الحمض النووي

1. قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة V4 لجين الحمض النووي الريبي الريبوزومي 16S بواسطة 250 × 2 تسلسل مزدوج على aMiSeq أو HiSeq أو NovaSeq¹⁵.
2. قم بإنشاء لوحة أولية من 96 بئرا. قم بإنشاء مزيج رئيسي من 165 ميكرولتر من ILHS_515f التمهيدي الأمامي المحفوظ (مخزون 100 ملليمتر) و 2970 ميكرولتر من الماء من درجة البيولوجيا الجزيئية. أضف 28.5 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل بئر.
3. أضف 1.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي المقابل من لوحة 96 بئر من الباركود IL_806r الاشعال الفريدة (مخزون 100 ميكرومتر). ستحدد هذه الرموز الشريطية عينات فريدة من نوعها.
4. قم بإنشاء مزيج رئيسي من الماء (23.1 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات) ، ومخزن PCR المؤقت (3 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات) ، و dNTPs (0.6 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات) ، و JumpStart Taq DNA polymerase (0.3 ميكرولتر × 3.3 × عدد العينات).
   ملاحظة: يجب إجراء تضخيم الحمض النووي 16S في ثلاث نسخ.
5. أضف 81 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر في أول 96 بئر من الصفيحة. أضف 6 ميكرولتر من الحمض النووي و 3 مل من مزيج التمهيدي إلى كل بئر. استخدم ماصة P200 متعددة القنوات لخلط الآبار، ثم قم بإدخال ماصة 30 ميكرولتر في البئر المقابل لكل من لوحي PCR الآخرين. أغلق اللوحة.
6. استخدم إعدادات التدوير الحراري التالية: 94 درجة مئوية × 3 دقائق ؛ 35 دورة: 94 درجة مئوية × 45 ثانية ، 50 درجة مئوية × 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية × 1.5 دقيقة. بعد 35 دورة: 72 درجة مئوية × 10 دقائق ، 94 درجة مئوية × 5 دقائق ، 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.

7. التنظيف وإعداد المكتبة

1. استخدم مجموعة أدوات تنظيف PCR أو DNA لتنقية منتجات PCR. قم بتخفيض الحمض النووي ب 30 ميكرولتر من الماء من فئة PCR (معالج ب DEPC).
2. استخدم مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية الذي لديه القدرة على تحديد عينات PCR.
3. افتح برنامج مقياس الطيف الضوئي على سطح مكتب الكمبيوتر. انقر فوق الحمض النووي.
4. امسح المنفذ بالماء المقطر. أضف 1 ميكرولتر من 1x PCR buffer / ماء إلى المنفذ والمعايرة.
5. أدخل معرف العينة وقم بإدخال 1 ميكرولتر من العينة على المنفذ.
6. أغلق المنفذ واضغط على قياس.
   ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند إضافة عينات إلى المنفذ.
7. امسح العينة بمناديل المختبر والماء المقطر ، ثم قم بإعداد العينة التالية. سجل القيم مع كل عينة. يجب أن يقوم الكمبيوتر أيضا بالحفظ التلقائي.
8. اجمع بين 250 نانوغرام من كل منتج PCR مضخم في 1 أنبوب. هذه هي مكتبة الحمض النووي.
9. قم بتسليم المكتبة ، جنبا إلى جنب مع القراءتين 1 و 2 وبادئات تسلسل الفهرس إلى مختبر التسلسل للتسلسل.
   ملاحظة: إذا لم يكن المختبر المحلي متاحا ، فيمكن استخدام مختبر تسلسل تجاري لهذه الخطوة.

8. تنسيق البيانات

1. توفر بيانات التسلسل نتائج في ملفات .fastq للأمام والعكس. قم بتحويل هذه البيانات إلى ورقة بيانات وتنظيفها بحيث يمكن تحليل المعلومات للتطبيقات النهائية
2. افتح برنامج البرمجة R. اتبع التعليمات والتعليمات البرمجية المدرجة في ملف الترميز التكميلي للمتابعة عبر خط أنابيب DADA2 وتنظيف بيانات تسلسل الحمض النووي¹⁶. قم بتنزيل قاعدة البيانات المرجعية SILVA لتعيين التصنيف بعد تمرير التسلسلات عبر خط الأنابيب¹⁷.
3. باختصار ، قم بتحميل حزمة DADA2 في R. حدد مسارا يتم فيه حفظ جميع ملفات .fastq في نفس الدليل واستخراج الملفات إلى R.
4. اقرأ أسماء ملفات fastq وقم بمطابقة قوائم ملفات fastq للأمام والعكس.
5. افحص جودة القراءات الأمامية والقراءات العكسية.
   ملاحظة: يمكن اقتطاع تسلسلات النيوكليوتيدات للحفاظ على تسلسلات عالية الجودة.
6. قم بتصفية ملفات fastq وتقليمها. استخدم أسلوب learnErrors لمعرفة نموذج الخطأ البارامتري الذي يستخدمه DADA2. سيوضح هذا معدلات الخطأ المرصودة والمتوقعة لكل استبدال محتمل للنيوكليوتيدات (A → C ، A → T ، A → G ، إلخ).
7. قم بتطبيق خوارزمية استدلال العينة لتحديد عدد التسلسلات الفريدة في كل عينة وفحص كائن فئة dada للوصول إلى عدد المتغيرات الفريدة الحقيقية لكل عينة.
8. ادمج القراءات الأمامية والخلفية للحصول على تسلسلات كاملة وخالية من الضوضاء.
9. قم بإنشاء جدول متغير تسلسل amplicon (ASV).
10. قم بإزالة الوهم من جدول ASV. التسلسلات الخيميرية هي تسلسل واحد ناتج عن تسلسلين أصليين أكثر وفرة.
11. تعقب العدد الإجمالي للقراءات التي مرت عبر البنية الأساسية لبرنامج ربط العمليات التجارية. سيستخدم DADA2 SILVA لتعيين تصنيف لكل تسلسل فريد. يمكن تحليل الدقة من خلال تضمين مجتمع من تسلسلات البكتيريا المعروفة في خط أنابيب DADA2 ومقارنة متغيرات تسلسل DADA2 بالتكوين المتوقع للمجتمع.
    ملاحظة: تم الآن تنظيف بيانات تسلسل الحمض النووي وجاهزة للتحليل بناء على النطاق والأهداف المحددة لمشروع البحث.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الاختلافات السكانية بين الميكروبيوم المخاطي واللمعي للأمعاء القريبة
وجدت الدراسات السابقة اختلافات في التجمعات الميكروبية لعينات القولون اللمعية والمخاطية^4،5،18. تظهر النتائج الأولية أن عينات الخزعة والنف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تعتبر دراسات الميكروبيوم مهمة للغاية ، حيث أن هذا النظام البيئي المعقد له دور حاسم في توازن الطاقة ، والاستجابات المناعية ، والتمثيل الغذائي¹⁹. توجد اختلافات في الميكروبيوم الإقليمي قد تعكس الوظائف الفسيولوجية المتميزة لمناطق مختلفة من الجهاز الهضمي ، وال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity