Coleta e análise de amostras do microbioma duodenal

Resumo

Neste manuscrito, discutimos um novo método para amostrar e analisar o microbioma duodenal. Este método fornece uma representação precisa da diversidade e composição microbiana no duodeno e pode ser útil para uma investigação mais aprofundada do microbioma duodenal.

Resumo

Mudanças no microbioma foram correlacionadas com a fisiologia e fisiopatologia de muitos sistemas de órgãos, tanto em humanos quanto em modelos de camundongos. O microbioma intestinal tem sido tipicamente estudado por meio de coletas de amostras fecais. A facilidade de obtenção de amostras fecais resultou em muitos estudos que revelaram informações sobre o trato gastrointestinal luminal distal. No entanto, poucos estudos abordaram a importância do microbioma no intestino proximal. Dado que o duodeno é um importante local de digestão e absorção, seu microbioma é relevante para nutrição e doenças hepáticas e merece uma investigação mais aprofundada. Aqui, detalhamos um novo método para amostragem do microbioma intestinal proximal luminal e mucoso em indivíduos humanos submetidos à endoscopia digestiva alta, obtendo aspirado duodenal e biópsias. A obtenção de amostras é fácil e não é afetada por artefatos como a adesão preparatória do paciente, como pode ser o caso na obtenção de amostras de cólon durante a colonoscopia. Os resultados preliminares mostram que os microbiomas luminal e mucoso diferem significativamente, o que provavelmente está relacionado às condições ambientais e às funções de barreira. Portanto, uma combinação de aspirado duodenal e biópsias revela uma imagem mais abrangente do microbioma no duodeno. As biópsias são obtidas dos segmentos descendente e horizontal do duodeno, que estão anatomicamente próximos ao fígado e à árvore biliar. Isso é importante para estudar o papel da biologia dos ácidos biliares e do eixo intestino-fígado na doença hepática. Biópsias e aspirados podem ser usados para sequenciamento de RNA ribossômico 16S, metabolômica e outras aplicações semelhantes.

Introdução

O microbioma intestinal tornou-se uma área de crescente interesse nos últimos anos. Agora entende-se que a população bacteriana diversificada no intestino pode diferir com base em uma variedade de fatores, incluindo genética, dieta, medicação e influências ambientais¹. Estudos também identificaram perfis microbianos únicos ligados a várias doenças gastrointestinais, como obesidade, doença inflamatória intestinal e doença hepática ^2,3. A maioria dos estudos se concentra no perfil do microbioma do intestino grosso por meio da análise de amostras de mucosa fecal e distal⁴. Embora a maior concentração de bactérias intestinais resida no cólon (10¹² bactérias / grama), existe uma comunidade complexa de micróbios que residem no duodeno (10³ / g), jejuno (10⁴ / g) e íleo (10^{7 /} g) que desempenha um papel fundamental no metabolismo digestivo e na absorção⁵.

O intestino delgado serve como o principal local de quebra e absorção de nutrientes no trato gastrointestinal. As bactérias comensais que revestem o intestino delgado desempenham um papel fundamental no auxílio na quebra química dos substratos alimentares e na liberação de compostos bioativos que auxiliam na absorção de nutrientes⁶. Essas interações contribuem para um ambiente complexo de atividade micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio no intestino delgado⁷. Um estudo que observou a microbiota do intestino delgado em modelos murinos descobriu que camundongos livres de germes alimentados com uma dieta rica em gordura tinham absorção de lipídios prejudicada, mas, quando colonizados com microbiota jejunal, tinham um aumento direto na absorção de lipídios⁶. Um estudo piloto humano que traçou o perfil da microbiota duodenal de indivíduos obesos e saudáveis descobriu que a microbiota duodenal de indivíduos obesos apresentava alterações nas vias de degradação de ácidos graxos e sacarose, provavelmente induzidas em uma relação dependente da dieta⁸. Além disso, a disbiose na microbiota do intestino delgado foi identificada em várias doenças, incluindo supercrescimento bacteriano do intestino delgado, síndrome do intestino curto, bolsite, disfunção entérica ambiental e síndrome do intestino irritável⁷.

Estamos interessados na relação entre o microbioma e os diferentes estágios da doença hepática crônica. Especificamente, o duodeno serve como o primeiro local de decomposição química e absorção nutricional no intestino delgado. Além disso, a circulação hepática portal traz nutrientes e metabólitos para o fígado, onde são processados e regulados na corrente sanguínea. A proximidade anatômica entre o intestino e o fígado cria um ambiente suscetível a respostas pró-inflamatórias que podem surgir devido a falhas na barreira intestinal ou alterações no microbioma intestinal⁹. Estudos que investigam a progressão do microbioma e da doença hepática identificaram disbiose microbiana em pacientes com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), esteato-hepatite (NASH), doença hepática alcoólica e cirrose^10,11. Embora a maioria dos estudos caracterize o microbioma do cólon, estávamos interessados em investigar o microbioma do intestino delgado em relação à doença hepática. Utilizando o novo método aqui apresentado, identificamos perfis microbianos duodenais únicos em pacientes com cirrose hepática em relação à dieta¹².

Como a caracterização do microbioma do intestino delgado continua a se tornar uma área de crescente interesse, é necessário desenvolver técnicas uniformes para obter amostras que representem com precisão a microbiota do intestino delgado. No entanto, existem desafios associados à obtenção de amostras que complicaram o estudo do ambiente do microbioma do intestino delgado. Os métodos atuais de amostragem requerem procedimentos invasivos que muitas vezes estão sujeitos a contaminação, conforme descrito por Kastl et al⁷. Aqui detalhamos um novo método para obtenção de aspirado duodenal e biópsias para análise microbiana de pacientes com doença hepática submetidos à esofagogastroduodenoscopia.

Protocolo

As amostras duodenais foram obtidas no Veteran Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, no Cedars-Sinai Medical Center e no Ronald Reagan UCLA Medical Center após o protocolo clínico para o estudo Microbioma, Marcadores Microbianos e Doença Hepática (M3LD) ter sido aceito pelo conselho de revisão institucional do comitê de revisão de ética local. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes participantes.

1. Consentimento dos participantes

1. Aborde indivíduos com diagnóstico de cirrose hepática de qualquer etiologia com endoscopias agendadas para triagem de varizes ou hipertensão portal para recrutamento. Exclua pacientes com carcinoma hepatocelular (CHC).
2. Apresente o estudo, garanta cuidadosamente a compreensão do participante e pergunte ao participante se ele gostaria de ser voluntário no estudo. Preencha um formulário de consentimento informado se eles concordarem.
3. Certifique-se de que um profissional médico devidamente treinado e credenciado realize a endoscopia.

2. Coleta de amostras

1. Anestesiar o paciente com 50 mg de fentanil e 2 mg de midazolam. Aumente a dose conforme necessário até que o paciente esteja moderadamente anestesiado e possa tolerar o endoscópio.
2. Insira um endoscópio (por exemplo, Pentax EG29-i10) no esôfago do paciente e progrida em direção ao piloro.
   NOTA: O tamanho do endoscópio varia de acordo com a fisiologia do paciente. Não use o endoscópio para qualquer aspiração antes da coleta de amostras para evitar contaminar o canal do endoscópio com secreções gástricas ou orofaríngeas.
3. Obtenha uma lâmina de microscópio e uma agulha de seringa de calibre 18 romba para se preparar para a aquisição da amostra. Prepare uma almofada estéril que será usada para transferir biópsias da lâmina do microscópio para criogeniais.
4. Quando o endoscópio chegar à segunda porção do duodeno distal à ampola de Vater, aspire qualquer fluido presente através de um cateter de aspiração descartável estéril passado pelo canal de trabalho do endoscópio superior e colete-o em um recipiente de amostra descartável de 40 mL. Lave até 30 mL de água estéril adicional por seringa no duodeno e aspire o fluido em uma armadilha de amostra de fluido para coletar um total de 15 mL.
5. Remova e tampe imediatamente o recipiente de aspirado conectado ao componente de sucção do cateter. Coloque o recipiente em uma garrafa térmica com gelo e em um saco de transporte de amostras para transferência para o laboratório de processamento.
6. Insira uma pinça de biópsia de uso único de 2.8 mm na porta na lateral do endoscópio para remover amostras de tecido para pesquisa. Realize 2 passagens aleatórias da pinça na segunda porção do duodeno, coletando duas mordidas de tecido em cada passagem.
7. Use uma agulha de seringa de calibre 18 rombo para extrair amostras de tecido da pinça e na lâmina do microscópio antes de transferir as amostras para quatro criogenias vazias separadas de 2 mL. Aperte bem as tampas.
8. Insira todos os 4 criogeniais bem tampados em um recipiente vazio, como um copo de urina, e crie um banho, consistindo de 20 mL de etanol e gelo seco, para congelar rapidamente as biópsias.
9. Coloque os criogeniais de biópsia em um recipiente isolado de isopor em uma cama de gelo seco e transfira as amostras para um freezer a -80 ° C para armazenamento de longo prazo para preservar as amostras.

3. Processamento de aspiração

1. Após a coleta de bioespécimes, transfira imediatamente os bioespécimes para um laboratório BSL2 ou superior para processamento.
2. Inverta suavemente o recipiente de fluido aspirado quatro vezes e, em seguida, alíquota de aproximadamente 1,5 mL do fluido em 2 mL crioviais.
3. Armazene as amostras a -80 °C até que a análise em lote possa ser realizada.

4. Administração de questionários e coleta de dados clínicos

1. Peça aos participantes que preencham questionários para obter informações sobre dieta, dados demográficos, hábitos de fumar / álcool, condições médicas / medicamentos e qualidade de vida¹³.
2. Revise os prontuários médicos para capturar dados clínicos, incluindo laboratórios clínicos, dados de imagem, medicamentos e complicações médicas.

5. Extração de DNA

1. Realize a extração de DNA imediatamente após a remoção das biópsias duodenais e aspire do armazenamento a -80 ° C. Nenhuma etapa preparatória é necessária para extrair DNA de amostras de biópsia duodenal.
2. Realize a extração e o sequenciamento de DNA para todas as amostras no mesmo dia para diminuir o risco de um efeito de lote na análise. Configure uma biblioteca específica para as amostras coletadas antes que as amostras possam ser sequenciadas.
3. Use um kit de micropreparação de DNA para extrair DNA de amostras de biópsia duodenal, de acordo com o protocolo do fabricante¹⁴.
4. Adicione a quantidade máxima de amostra de acordo com as diretrizes do protocolo a um tubo de lise contendo 750 μL de solução de lise e um volume seco de 0,7 mL de esferas de vidro de 2 mm.
5. Prenda os tubos de lise em um batedor de contas com um suporte de tubo e opere o batedor na velocidade máxima por pelo menos cinco minutos. O tempo varia de acordo com o batedor de contas e a amostra que está sendo analisada.
6. Centrifugue os tubos de lise em uma microcentrífuga a 10.000 x g por 1 min.
7. Transferir até 400 μL de sobrenadante através de um tubo de recolha filtrado e centrifugar novamente a 8000 x g durante 1 min.
8. Adicione 1200 μL de tampão de ligação ao filtrado em um tubo de microcentrífuga e misture bem até ficar homogêneo.
9. Transfira 800 μL da mistura para um conjunto de coluna giratória e tubo. Centrifugue a 10.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo.
10. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de centrífuga com 400 μL de tampão de lavagem de DNA e misture bem até ficar homogêneo. Centrifugue a 10.000 x g por 1 min. Descarte o fluxo.
11. Repita a etapa 5.10 duas vezes, com 700 μL e depois 200 μL de tampão de lavagem de DNA por lavagem.
12. Adicione 20 μL de tampão de eluição à coluna de rotação em um novo tubo de centrífuga. Incube por um minuto e, em seguida, centrifugue a 10.000 x g por 1 min para eluir o DNA. Descarte a coluna.
13. Filtre o DNA novamente. O DNA agora está pronto para amplificação por PCR.

6. Amplificação do ADN

1. Realize a amplificação por PCR da região V4 do gene do RNA ribossômico 16S por sequenciamento de extremidade emparelhada 250 × 2 no sequenciador aMiSeq, HiSeq ou NovaSeq¹⁵.
2. Crie uma placa de primer de 96 poços. Crie uma mistura principal de 165 μL de primer direto conservado ILHS_515f (estoque de 100 mM) e 2970 μL de água de grau de biologia molecular. Adicione 28,5 μL desta mistura a cada poço.
3. Adicione 1,5 μL de primer reverso correspondente da placa de 96 poços de primers IL_806r exclusivos com código de barras (estoque de 100 μM). Esses códigos de barras identificarão amostras exclusivas de pacientes.
4. Crie uma mistura principal de água (23,1 μL x 3,3 x número de amostras), tampão PCR (3 μL x 3,3 x número de amostras), dNTPs (0,6 μL x 3,3 x número de amostras) e JumpStart Taq DNA polimerase (0,3 μL x 3,3 x número de amostras).
   NOTA: A amplificação do DNA 16S deve ser realizada em triplicata.
5. Adicione 81 μL de master mix a cada poço na primeira placa de 96 poços. Adicione 6 μL de DNA e 3 mL de mistura de primer a cada poço. Use uma pipeta multicanal P200 para misturar os poços e, em seguida, pipete 30 μL no poço correspondente de cada uma das outras duas placas de PCR. Sele a placa.
6. Use as seguintes configurações do termociclador: 94 °C x 3 min; 35 ciclos: 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 min, 72 °C x 1,5 min. Após 35 ciclos: 72 °C x 10 min, 94 °C x 5 min, 4 °C indefinidamente.

7. Limpeza e configuração da biblioteca

1. Empregue um kit de limpeza de PCR ou DNA para purificar os produtos de PCR. Eluir o DNA com 30 μL de água de grau PCR (tratada com DEPC).
2. Use um espectrofotômetro de espectro UV-visível que tenha a capacidade de quantificar amostras de PCR.
3. Abra o software do espectrofotômetro na área de trabalho do computador. Clique em Ácido Nucleico.
4. Limpe a porta com água destilada. Adicione 1 μL de 1x tampão/água PCR à porta e calibre.
5. Insira o ID da amostra e pipete 1 μL de amostra na porta.
6. Feche a porta e pressione Medir.
   NOTA: Evite bolhas de ar ao adicionar samples na porta.
7. Limpe a amostra com lenços umedecidos e água destilada e, em seguida, prepare a próxima amostra. Registre valores com cada amostra. O computador também deve salvar automaticamente.
8. Combine 250 ng de cada produto de PCR amplificado em 1 tubo. Esta é a biblioteca de DNA.
9. Entregue a biblioteca, juntamente com as leituras 1 e 2 e os primers de sequenciamento de índice a um laboratório de sequenciamento para sequenciamento.
   NOTA: Se um laboratório local não estiver disponível, um laboratório de sequenciamento comercial pode ser utilizado para esta etapa.

8. Formatação de dados

1. Os dados de sequenciamento fornecem resultados em arquivos .fastq de encaminhamento e reverso. Converta esses dados em uma planilha de dados e limpe para que as informações possam ser analisadas para aplicativos downstream.
2. Abra o software de programação R. Siga as instruções e o código listados no arquivo de codificação suplementar para prosseguir com o pipeline DADA2 e limpar os dados de sequenciamento de DNA¹⁶. Baixe o banco de dados de referência SILVA para a atribuição de taxonomia depois que as sequências tiverem sido passadas pelo pipeline¹⁷.
3. Resumidamente, carregue o pacote DADA2 em R. Defina um caminho no qual todos os arquivos .fastq sejam salvos no mesmo diretório e extraia os arquivos em R.
4. Leia os nomes dos arquivos fastq e corresponda às listas de arquivos fastq de encaminhamento e reverso.
5. Inspecione a qualidade das leituras diretas e inversas.
   NOTA: As sequências de nucleotídeos podem ser truncadas para manter sequências de alta qualidade.
6. Filtre e corte os arquivos fastq. Use o método learnErrors para aprender o modelo de erro paramétrico que o DADA2 usa. Isso mostrará as taxas de erro observadas e esperadas para cada substituição possível de nucleotídeos (A → C, A → T, A → G, etc.).
7. Aplique o algoritmo de inferência de amostra para determinar o número de sequências exclusivas em cada amostra e inspecione ainda mais o objeto de classe dada para chegar ao número de variantes únicas verdadeiras por amostra.
8. Mescle as leituras direta e reversa para obter sequências completas e sem ruído.
9. Construa uma tabela de variante de sequência de amplicon (ASV).
10. Remova as quimeras da tabela ASV. As sequências quiméricas são uma única sequência resultante de duas sequências parentais mais abundantes.
11. Acompanhe o número total de leituras que passaram pelo pipeline. O DADA2 usará o SILVA para atribuir taxonomia a cada sequência única. A precisão pode ser analisada incluindo uma comunidade de sequências de bactérias conhecidas no pipeline DADA2 e comparando as variantes da sequência DADA2 com a composição esperada da comunidade.
    NOTA: Os dados de sequenciamento de DNA agora estão limpos e prontos para análise com base no escopo e objetivos específicos do projeto de pesquisa.

Resultados

Diferenças populacionais entre o microbioma mucoso e luminal do intestino proximal
Estudos anteriores encontraram diferenças nas populações microbianas de amostras de cólon luminal e mucosa ^4,5,18. Os resultados preliminares mostram que as amostras de aspirado duodenal e biópsia podem medir a microbiota luminal e mucosa no intestino proximal. Além disso, descobrimos qu...

Discussão

Estudos do microbioma são incrivelmente importantes, pois esse ecossistema complexo tem um papel crítico na homeostase energética, respostas imunológicas e metabolismo¹⁹. Existem diferenças regionais no microbioma que podem refletir as funções fisiológicas distintas de várias regiões do trato gastrointestinal, o que pode afetar diferentes estados de doença²⁰. O microbioma fecal é mais comumente estudado, mas mais recentemente o ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity