十二指腸マイクロバイオームの標本収集と解析

要約

この論文では、十二指腸マイクロバイオームをサンプリングおよび分析するための新しい方法について説明します。この方法は、十二指腸の微生物の多様性と組成を正確に描写し、十二指腸マイクロバイオームのさらなる研究に役立つ可能性があります。

要約

マイクロバイオームの変化は、ヒトとマウスモデルの両方で、多くの臓器系の生理学および病態生理学と相関しています。腸内細菌叢は通常、糞便検体のコレクションを通じて研究されてきました。糞便サンプルの入手の容易さは、遠位管腔胃腸管に関する情報を明らかにした多くの研究をもたらしました。しかし、近位腸内のマイクロバイオームの重要性を扱った研究はほとんどありません。十二指腸が消化と吸収の主要な部位であることを考えると、そのマイクロバイオームは栄養と肝疾患に関連しており、さらなる調査が必要です。ここでは、十二指腸吸引物と生検を取得することにより、上部内視鏡検査を受けているヒト被験者の近位管腔および粘膜腸内細菌叢をサンプリングする新しい方法について詳しく説明します。検体の調達は容易であり、大腸内視鏡検査中に結腸サンプルを取得する場合のように、患者の準備アドヒアランスなどのアーティファクトの影響を受けません。予備的な結果は、管腔マイクロバイオームと粘膜マイクロバイオームが大きく異なることを示しており、これは環境条件とバリア機能に関連している可能性があります。したがって、十二指腸吸引液と生検の組み合わせにより、十二指腸のマイクロバイオームのより包括的な画像が明らかになります。生検は、解剖学的に肝臓および胆道樹に近い十二指腸の下降および水平セグメントから得られる。これは、肝疾患における胆汁酸生物学と腸-肝臓軸の役割を研究する上で重要です。生検と吸引は、16SリボソームRNAシーケンシング、メタボロミクス、およびその他の同様のアプリケーションに使用できます。

概要

腸内細菌叢は、近年、関心が高まっている分野となっています。現在では、腸内の多様な細菌集団は、遺伝学、食事、投薬、環境の影響など、さまざまな要因に基づいて異なる可能性があることが理解されています¹。また、肥満、炎症性腸疾患、肝疾患など、さまざまな胃腸疾患に関連するユニークな微生物プロファイルも研究で特定されています^2,3。研究の大部分は、糞便および遠位粘膜サンプルの分析を通じて大腸のマイクロバイオームをプロファイリングすることに焦点を当てています⁴。腸内細菌の濃度が最も高いのは結腸(10¹²細菌/グラム)ですが、十二指腸(10³ / g)、空腸(10⁴ / g)、回腸(10⁷ / g)には、消化代謝と吸収に重要な役割を果たす微生物の複雑なコミュニティ^{があります5。}

小腸は、胃腸管での栄養素の分解と吸収の主要な部位として機能します。小腸の内側を覆う共生細菌は、食品基質の化学的分解と、栄養素の吸収を助ける生理活性化合物の放出を助ける基本的な役割を果たします⁶。これらの相互作用は、小腸における微生物-微生物および宿主-微生物の活動の複雑な環境に寄与^{している7。}マウスモデルで小腸内細菌叢を観察した研究では、高脂肪食を与えられた無菌マウスは脂質吸収が損なわれていたが、空腸微生物叢をコロニー化すると、脂質吸収が直接増加したことがわかりました⁶。肥満者と健康な個人の十二指腸微生物叢をプロファイリングした人間のパイロット研究では、肥満の個人の十二指腸微生物叢には脂肪酸とショ糖の分解経路に変化があり、おそらく食事依存の関係で誘発されることがわかりました⁸。さらに、小腸細菌叢の異常は、小腸細菌の異常増殖、短腸症候群、嚢炎、環境性腸機能障害、過敏性腸症候群など、いくつかの疾患で確認^{されています7。}

私たちは、マイクロバイオームと慢性肝疾患のさまざまな病期との関係に興味を持っています。具体的には、十二指腸は、小腸での化学的分解と栄養吸収の最初の部位として機能します。さらに、門脈肝循環は栄養素と代謝産物を肝臓に運び、肝臓で処理されて血流に調節されます。腸と肝臓の間の解剖学的近接性は、腸バリアの失敗や腸内細菌叢の変化によって発生する可能性のある炎症誘発性反応の影響を受けやすい環境を作り出し^ます9。マイクロバイオームと肝疾患の進行を調査した研究では、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、脂肪性肝炎(NASH)、アルコール性肝疾患、および肝硬変の患者における微生物叢異常が特定されています^10,11。大多数の研究は結腸のマイクロバイオームを特徴付けていますが、私たちは肝臓疾患に関連して小腸のマイクロバイオームを調査することに興味を持っていました。ここで紹介した新しい方法を利用することにより、食事^療法12に関連して、肝硬変患者のユニークな十二指腸微生物プロファイルを特定しました。

小腸マイクロバイオームの特性評価がますます関心を集めるようになるにつれ、小腸マイクロバイオームを正確に表すサンプルを得るための統一的な技術を開発する必要があります。しかし、検体の調達には課題があり、小腸マイクロバイオーム環境の研究を複雑にしています。現在のサンプリング方法では、Kastl et^{al 7} で概説されているように、汚染されることが多い侵襲的な手順が必要です。ここでは、食道胃十二指腸内視鏡検査を受けている肝疾患患者からの微生物分析のための十二指腸吸引液と生検を取得するための新しい方法について詳しく説明します。

プロトコル

マイクロバイオーム、微生物マーカー、肝疾患(M3LD)研究の臨床プロトコルが地元の倫理審査委員会の機関審査委員会によって承認された後、退役軍人省グレーターロサンゼルスヘルスケアシステム、シダーズサイナイメディカルセンター、およびロナルドレーガンUCLAメディカルセンターで十二指腸サンプルが取得されました。書面によるインフォームドコンセントは、参加したすべての患者から得られました。

1. 参加者の同意

1. あらゆる病因の肝硬変と診断された被験者に、静脈瘤スクリーニングまたは募集のための門脈圧亢進症に予定されている内視鏡検査でアプローチします。肝細胞がん (HCC) の患者は除外します。
2. 研究を紹介し、参加者の理解を慎重に確認し、参加者に研究にボランティアとして参加するかどうかを尋ねます。同意する場合は、インフォームドコンセントフォームに記入します。
3. 適切に訓練され、資格を持つ医療専門家が内視鏡検査を行うことを確認します。

2. 検体採取

1. 50 mgのフェンタニルと2 mgのミダゾラムで患者に麻酔をかけます。.患者が中等度の麻酔を受け、内視鏡に耐えられるようになるまで、必要に応じて投与量を増やします。
2. 内視鏡(ペンタックスEG29-i10など)を患者の食道に挿入し、幽門に向かって進行します。
   注:内視鏡のサイズは、患者の生理機能によって異なります。内視鏡を吸引に使用しないでくださいamp内視鏡チャネルが胃または中咽頭分泌物で汚染されるのを避けるために、サンプル収集前。
3. 顕微鏡スライドと鈍い18ゲージシリンジ針を入手して、標本調達の準備をします。顕微鏡スライドからクライオバイアルに生検を移すために使用される滅菌パッドを準備します。
4. スコープがVaterの膨大部から遠位の十二指腸の2番目の部分に到着したら、上部内視鏡の作業チャネルを通過した滅菌使い捨て吸引カテーテルを介して存在する任意の液体を吸引し、それを40mLの使い捨て検体容器に収集します。シリンジで最大30 mLの追加滅菌水を十二指腸に洗い流し、液体を液体検体トラップに吸引して合計15 mLを収集します。
5. カテーテルの吸引コンポーネントに取り付けられている吸引容器をすぐに取り外してキャップします。容器を氷の上の魔法瓶に入れ、試料輸送バッグに入れて処理ラボに移します。
6. 2.8mmのシングルユース生検鉗子を内視鏡の側面のポートに挿入して、研究用の組織標本を取り出します。十二指腸の第2部分内で鉗子を2回ランダムに通過させ、各パスで組織の2つの咬傷を収集します。
7. 鈍い18ゲージシリンジニードルを使用して、鉗子から組織サンプルを抽出し、顕微鏡スライド上にサンプルを取り出してから、サンプルを4つの別々の空の2 mLクライオバイアルに移します。キャップをしっかりとねじ込みます。
8. しっかりと蓋をした4つのクライオバイアルすべてを尿カップなどの空の容器に挿入し、20 mLのエタノールとドライアイスからなる浴を作り、生検を急速凍結します。
9. 生検クライオバイアルをドライアイスのベッドの上の断熱発泡スチロール容器に入れ、標本を-80°Cの冷凍庫に移して長期保存し、標本を保存します。

3. 吸引処理

1. 生体試料の採取後、直ちに生体試料をBSL2以上の研究室に移し、処理を行います。
2. 吸引液の容器を静かに4回反転させ、約1.5 mLの液体を2 mLのクライオバイアルに分注します。.
3. バッチ分析が実施できるようになるまで、試料を-80°Cで保存してください。

4. アンケートの実施と臨床データの収集

1. 参加者にアンケートに回答してもらい、食事、人口統計、喫煙/アルコール習慣、病状/投薬、生活の質に関する情報を引き出す¹³.
2. カルテを見直して、臨床検査室、画像データ、投薬、合併症などの臨床データを取得します。

5. DNA抽出

1. 十二指腸生検を取り出したらすぐにDNA抽出を行い、-80°Cで保存から吸引します。 十二指腸生検標本からDNAを抽出するための準備手順は必要ありません。
2. すべてのサンプルのDNA抽出とシーケンシングを同じ日に実施し、分析におけるバッチ効果のリスクを減らします。サンプルのシーケンシングを行う前に、収集した標本に固有のライブラリを設定します。
3. DNAマイクロプレップキットを使用して、メーカーのプロトコル¹⁴に従って、十二指腸生検標本からDNAを抽出します。
4. 750 μLの溶解液と0.7 mLの乾燥容量の2 mmガラスビーズが入った溶解チューブに、プロトコールガイドラインに従って最大量のサンプルを加えます。
5. 溶解チューブをチューブホルダー付きのビーズビーターに固定し、ビーターを最大速度で少なくとも5分間運転します。時間は、ビードビーターと分析するサンプルによって異なります。
6. 微量遠心分離機で溶解チューブを10,000 x gで1分間遠心分離します。
7. ろ過されたコレクションチューブを介して最大400 μLの上清を移し、8000 x gで1分間再度遠心分離します。
8. 1200 μLの結合バッファーを微量遠心チューブ内の濾液に加え、均一になるまで十分に混合します。
9. 混合物800μLをスピンカラムおよびチューブアセンブリに移します。10,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
10. スピンカラムを400 μLのDNA洗浄バッファーを入れた新しい遠心分離チューブに置き、均一になるまで十分に混合します。10,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
11. ステップ 5.10 を 2 回繰り返し、700 μL と 200 μL の DNA ウォッシュバッファーを 1 回の洗浄で使用します。
12. 20 μLの溶出バッファーを新しい遠心分離チューブのスピンカラムに加えます。1分間インキュベートした後、10,000 x gで1分間遠心分離してDNAを溶出します。列を破棄します。
13. DNAを再度ろ過します。これで、DNAをPCR増幅する準備が整いました。

6. DNA増幅

1. aMiSeq、HiSeq、またはNovaSeqシーケン^サー15上の250×2ペアエンドシーケンシングにより、16SリボソームRNA遺伝子のV4領域のPCR増幅を行う。
2. 96ウェルプレートプライマープレートを作成します。165 μLのILHS_515f保存フォワードプライマー(100 mMストック)と2970 μLの分子生物学グレードの水のマスターミックスを作成します。このミックスを各ウェルに28.5μL加えます。
3. バーコード付きプライマー IL_806rユニークプライマー(100 μMストック)の96ウェルプレートから、対応するリバースプライマー1.5 μLを添加します。これらのバーコードは、一意の患者サンプルを識別します。
4. 水(23.1 μL x 3.3 x サンプル数)、PCR バッファー(3 μL x 3.3 x サンプル数)、dNTP(0.6 μL x 3.3 x サンプル数)、および JumpStart Taq DNA ポリメラーゼ (0.3 μL x 3.3 x サンプル数) のマスターミックスを作成します。
   注:16S DNA増幅はトリプリケートで行う必要があります。
5. 最初の96ウェルプレートの各ウェルに81 μLのマスターミックスを加えます。各ウェルに6 μLのDNAと3 mLのプライマーミックスを加えます。P200マルチチャンネルピペットを使用してウェルを混合し、次に他の2つのPCRプレートのそれぞれの対応するウェルに30μLをピペットで移します。プレートを密封します。
6. 次のサーマルサイクラー設定を使用します:94°Cx3分。35サイクル:94°C×45秒、50°C×1分、72°C×1.5分35サイクル後:72°C×10分、94°C×5分、4°C無期限。

7. クリーンアップとライブラリのセットアップ

1. PCRまたはDNAクリーンアップキットを使用して、PCR産物を精製します。30 μLのPCRグレード(DEPC処理済み)水でDNAを溶出します。
2. PCRサンプルを定量する機能を備えた紫外可視スペクトル分光光度計を使用してください。
3. コンピュータのデスクトップで分光光度計ソフトウェアを開きます。 Nucleic Acidをクリックします。
4. ポートを蒸留水で拭きます。1x PCRバッファー/水1 μLをポートに加え、キャリブレーションします。
5. サンプルIDを入力し、1μLのサンプルをポートにピペットで移します。
6. ポートを閉じて 、[測定]を押します。
   注意: サンプルをポートに追加するときは、気泡を避けてください。
7. ラボ用ワイプと蒸留水でサンプルを拭き取り、次のサンプルを準備します。各サンプルで値を記録します。コンピュータも自動保存されるはずです。
8. 各増幅PCR産物250 ngを1本のチューブに組み合わせます。これがDNAライブラリーです。
9. ライブラリを、リード1と2、およびインデックスシーケンシングプライマーとともに、シーケンシングラボに納入してシーケンシングします。
   注:地元のラボが利用できない場合は、このステップで市販のシーケンシングラボを利用できます。

8. データのフォーマット

1. シーケンシングデータは、フォワードおよびリバースの.fastqファイルで結果を提供します。このデータをデータシートに変換してクリーンアップし、ダウンストリームアプリケーションで情報を分析できるようにします。
2. Rプログラミングソフトウェアを開きます。補足コーディングファイルに記載されている指示とコードに従って、DADA2パイプラインを進行し、DNAシーケンシングデータ¹⁶をクリーニングします。配列がパイプライン¹⁷を通過した後、分類学の割り当てのためのSILVA参照データベースをダウンロードする。
3. 簡単に言うと、DADA2パッケージをRにロードし、すべての.fastqファイルを同じディレクトリに保存するパスを定義し、ファイルをRに抽出します。
4. fastq ファイルの名前を読み取り、順方向と逆方向の fastq ファイルのリストを一致させます。
5. フォワードリードとリバースリードの品質を検査します。
   注:ヌクレオチド配列は、高品質の配列を維持するために切り捨てることができます。
6. fastqファイルをフィルタリングしてトリミングします。learnErrors メソッドを使用して、DADA2 が使用するパラメトリック エラー モデルを学習します。これにより、考えられる各ヌクレオチド置換(A → C、A → T、A → Gなど)の観測エラー率と期待エラー率が表示されます。
7. サンプル推論アルゴリズムを適用して、各サンプルの一意のシーケンスの数を決定し、さらに dada クラスのオブジェクトを調べて、サンプルあたりの真の一意のバリアントの数を算出します。
8. フォワードリードとリバースリードをマージして、完全なノイズ除去シーケンスを取得します。
9. アンプリコン配列バリアント (ASV) テーブルを作成します。
10. ASV テーブルからキメラを削除します。キメラ配列は、より豊富な2つの親配列から生じる単一の配列です。
11. パイプラインを通過した読み取りの合計数を追跡します。DADA2 は SILVA を使用して、各一意の配列に分類法を割り当てます。精度は、既知の細菌配列のコミュニティをDADA2パイプラインに含め、DADA2配列バリアントをコミュニティの予想される組成と比較することで分析できます。
    注:DNAシーケンシングデータはクリーニングされ、研究プロジェクトの特定の範囲と目標に基づいて分析する準備が整いました。

結果

近位腸の粘膜マイクロバイオームと管腔マイクロバイオームの人口差
以前の研究では、管腔結腸標本と粘膜結腸標本の微生物集団に違いがあることがわかっています^4,5,18。予備的な結果は、十二指腸吸引標本と生検標本が近位腸管の管腔微生物叢と粘膜微生物叢の両方を測定でき?...

ディスカッション

この複雑な生態系は、エネルギー恒常性、免疫応答、および代謝に重要な役割を果たしているため、マイクロバイオームの研究は非常に重要です¹⁹。地域的なマイクロバイオームの違いは、消化管のさまざまな領域の異なる生理学的機能を反映している可能性があり、さまざまな病状に影響を与える可能性があります²⁰。糞便マイ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity