JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בכתב היד הזה אנו דנים בשיטה חדשה לדגימה ולניתוח של המיקרוביום של התריסריון. שיטה זו מספקת תיאור מדויק של המגוון וההרכב המיקרוביאלי בתריסריון ויכולה להיות שימושית לחקירה נוספת של המיקרוביום של התריסריון.

Abstract

שינויים במיקרוביום נמצאו בקורלציה עם הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של מערכות איברים רבות הן בבני אדם והן במודלים של עכברים. המיקרוביום של המעי נחקר בדרך כלל באמצעות אוספי דגימות צואה. הקלות בהשגת דגימות צואה הביאה למחקרים רבים שחשפו מידע הנוגע למערכת העיכול הלומינלית הדיסטלית. עם זאת, מעט מחקרים התייחסו לחשיבות המיקרוביום במעי הפרוקסימלי. בהתחשב בכך שהתריסריון הוא אתר עיקרי לעיכול וספיגה, המיקרוביום שלו רלוונטי לתזונה ולמחלות כבד ומצדיק מחקר נוסף. כאן אנו מפרטים שיטה חדשה לדגימת המיקרוביום של המעי הפרוקסימלי והרירי בנבדקים אנושיים העוברים אנדוסקופיה עליונה על ידי השגת שאיבת תריסריון וביופסיות. רכישת דגימות היא קלה ואינה מושפעת מממצאים כגון היענות הכנה למטופל, כפי שעשוי להיות המקרה בקבלת דגימות מעי גס במהלך קולונוסקופיה. התוצאות הראשוניות מראות כי המיקרוביום הלומינלי והרירי שונים באופן משמעותי, מה שקשור ככל הנראה לתנאי הסביבה ולתפקודי המחסום. לכן, שילוב של שאיבת תריסריון וביופסיות חושף תמונה מקיפה יותר של המיקרוביום בתריסריון. ביופסיות מתקבלות מהמקטעים היורדים והאופקיים של התריסריון, הקרובים מבחינה אנטומית לכבד ולעץ המרה. זה חשוב בחקר התפקיד של הביולוגיה של חומצות המרה וציר המעי-כבד במחלות כבד. ניתן להשתמש בביופסיות ובשאיבה לריצוף RNA ריבוזומלי 16S, מטבולומיקה ויישומים דומים אחרים.

Introduction

המיקרוביום של המעי הפך לתחום עניין גובר בשנים האחרונות. כיום מבינים שאוכלוסיית החיידקים המגוונת במעיים יכולה להיות שונה על סמך מגוון גורמים, כולל גנטיקה, תזונה, תרופות והשפעות סביבתיות1. מחקרים זיהו גם פרופילים מיקרוביאליים ייחודיים הקשורים למחלות שונות במערכת העיכול, כגון השמנת יתר, מחלות מעי דלקתיות ומחלות כבד 2,3. רוב המחקרים מתמקדים בפרופיל המיקרוביום של המעי הגס באמצעות ניתוח דגימות צואה ורירית דיסטלית4. למרות שהריכוז הגבוה ביותר של חיידקי מעיים שוכן במעי הגס (1012 חיידקים לגרם), בכל זאת קיימת קהילה מורכבת של חיידקים השוכנים בתריסריון (103 / גרם), ג'ג'ונום (104 / גרם) ואילאום (107 / גרם) הממלאים תפקיד מפתח בחילוף החומרים והספיגה במערכת העיכול5.

המעי הדק משמש כאתר העיקרי לפירוק וספיגה של חומרים מזינים במערכת העיכול. חיידקים קומנסליים המרפדים את המעי הדק ממלאים תפקיד מהותי בסיוע בפירוק כימי של מצעי מזון ובשחרור תרכובות ביו-אקטיביות המסייעות בספיגת חומרים מזינים6. אינטראקציות אלה תורמות לסביבה מורכבת של פעילות חיידקים-מיקרואורגניזמים ומיקרוב-מארח במעי הדק7. מחקר שצפה במיקרוביוטה של המעי הדק במודלים של עכברים מצא כי עכברים נטולי חיידקים שניזונו מתזונה עתירת שומן פגעו בספיגת השומנים, אך כאשר התיישבו עם מיקרוביוטה של ג'ג'ונל, הייתה להם עלייה ישירה בספיגת השומנים6. מחקר פיילוט בבני אדם שאפיין את המיקרוביוטה של התריסריון של אנשים שמנים ובריאים מצא כי למיקרוביוטה של התריסריון של אנשים שמנים היו שינויים במסלולי פירוק חומצות שומן וסוכרוז, ככל הנראה כתוצאה ממערכת יחסים תלויה בתזונה8. יתר על כן, דיסביוזה במיקרוביוטה של המעי הדק זוהתה במספר מחלות כולל צמיחת יתר של חיידקי המעי הדק, תסמונת המעי הקצר, דלקת כיס, תפקוד מעי סביבתי ותסמונת המעי הרגיז7.

אנו מתעניינים בקשר בין המיקרוביום לשלבים שונים של מחלת כבד כרונית. באופן ספציפי, התריסריון משמש כאתר הראשון של פירוק כימי וספיגה תזונתית במעי הדק. בנוסף, זרימת הכבד הפורטלית מביאה חומרים מזינים ומטבוליטים לכבד, שם הם מעובדים ומווסתים לזרם הדם. הקרבה האנטומית בין המעי לכבד יוצרת סביבה רגישה לתגובות פרו-דלקתיות שעלולות להיווצר עקב כשל במחסום המעי או שינויים במיקרוביום המעי9. מחקרים שבדקו את התקדמות המיקרוביום ומחלות הכבד זיהו דיסביוזה חיידקית בחולים עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), דלקת כבד שומני (NASH), מחלת כבד אלכוהולית ושחמת 10,11. בעוד שרוב המחקרים מאפיינים את המיקרוביום של המעי הגס, היינו מעוניינים לחקור את המיקרוביום של המעי הדק ביחס למחלות כבד. על ידי שימוש בשיטה החדשנית המוצגת כאן, זיהינו פרופילים מיקרוביאליים ייחודיים בתריסריון בחולים עם שחמת כבד ביחס לתזונה12.

ככל שאפיון המיקרוביום של המעי הדק ממשיך להפוך לתחום עניין מוגבר, יש צורך לפתח טכניקות אחידות להשגת דגימות המייצגות במדויק את המיקרוביוטה של המעי הדק. עם זאת, ישנם אתגרים הקשורים לרכישת דגימות שסיבכו את חקר סביבת המיקרוביום של המעי הדק. שיטות הדגימה הנוכחיות דורשות הליכים פולשניים שלעתים קרובות נתונים לזיהום, כפי שמתואר על ידי Kastl et al7. כאן אנו מפרטים שיטה חדשה להשגת שאיבת תריסריון וביופסיות לניתוח מיקרוביאלי מחולים עם מחלת כבד העוברים אספגוגסטרופודודנוסקופיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

דגימות תריסריון נלקחו במערכת הבריאות לענייני חיילים משוחררים בלוס אנג'לס רבתי, במרכז הרפואי סידרס-סיני ובמרכז הרפואי רונלד רייגן UCLA לאחר שהפרוטוקול הקליני למחקר המיקרוביום, סמנים מיקרוביאליים ומחלות כבד (M3LD) התקבל על ידי ועדת הביקורת המוסדית של ועדת הביקורת האתית המקומית. התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המטופלים המשתתפים.

1. הסכמת המשתתפים

  1. גש לנבדקים עם אבחנה של שחמת כבד מכל אטיולוגיה עם אנדוסקופיות שנקבעו לבדיקת דליות או יתר לחץ דם פורטלי לגיוס. לא לכלול חולים עם קרצינומה הפטו-תאית (HCC).
  2. הציגו את המחקר, וודאו היטב את הבנת המשתתפים ושאלו את המשתתף אם הוא מעוניין להתנדב במחקר. מלא טופס הסכמה מדעת אם הם מסכימים.
  3. ודא שאיש מקצוע רפואי מיומן ומוסמך כראוי מבצע את האנדוסקופיה.

2. איסוף דגימות

  1. להרדים את המטופל עם 50 מ"ג פנטניל ו-2 מ"ג מידזולם. הגדל את המינון לפי הצורך עד שהמטופל מורדם בינוני ויכול לסבול את האנדוסקופ.
  2. הכנס אנדוסקופ (למשל, פנטקס EG29-i10) לוושט של המטופל והתקדם לעבר הפילורוס.
    הערה: גודל האנדוסקופ ישתנה בהתאם לפיזיולוגיה של המטופל. אל תשתמש באנדוסקופ לשאיפה כלשהי לפני איסוף הדגימה כדי למנוע זיהום תעלת האנדוסקופ בהפרשות קיבה או לוע.
  3. השג שקופית מיקרוסקופ ומחט מזרק קהה 18 מד כדי להתכונן לרכישת דגימות. הכן כרית סטרילית שתשמש להעברת ביופסיות משקופית המיקרוסקופ לקריוביאלים.
  4. כאשר הסקופ מגיע לחלק השני של התריסריון הדיסטלי לאמפולה של וטר, שאפו כל נוזל הקיים דרך קטטר שאיפה חד פעמי סטרילי המועבר דרך תעלת העבודה של האנדוסקופ העליון ואסוף אותו למיכל דגימה חד פעמי של 40 מ"ל. שטפו עד 30 מ"ל מים סטריליים נוספים על ידי מזרק לתריסריון ושאבו את הנוזל למלכודת דגימת נוזל כדי לאסוף בסך הכל 15 מ"ל.
  5. הסר מיד וסגור את מיכל השאיבה המחובר לרכיב היניקה של הצנתר. הכניסו את המיכל לתרמוס מעל קרח ולשקית הובלת דגימות להעברה למעבדת העיבוד.
  6. הכנס מלקחיים חד פעמיים של ביופסיה בגודל 2.8 מ"מ לפתח בצד האנדוסקופ כדי להסיר דגימות רקמה למחקר. בצע 2 מעברים אקראיים של המלקחיים בתוך החלק השני של התריסריון, ואסף שתי עקיצות רקמה בכל מעבר.
  7. השתמש במחט מזרק קהה 18 מד כדי לחלץ דגימות רקמה מהמלקחיים ועל שקופית המיקרוסקופ לפני העברת הדגימות לארבעה קריוביאלים ריקים נפרדים של 2 מ"ל. הברג היטב את הכובעים.
  8. הכנס את כל 4 הקריוביאלים המכוסים היטב למיכל ריק, כגון כוס שתן, וצור אמבטיה, המורכבת מ-20 מ"ל אתנול וקרח יבש, כדי להקפיא את הביופסיות.
  9. מניחים את הביופסיה קריוביאלית במיכל קלקר מבודד על מצע של קרח יבש ומעבירים את הדגימות למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך כדי לשמר את הדגימות.

3. עיבוד שאיבה

  1. לאחר איסוף הדגימות הביולוגיות, העבירו מיד את הדגימות הביולוגיות למעבדת BSL2 ומעלה לעיבוד.
  2. הפוך בעדינות את מיכל נוזל השאיבה ארבע פעמים, ולאחר מכן הוציא כ-1.5 מ"ל מהנוזל ל-2 מ"ל קריוביאלים.
  3. אחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לבצע ניתוח אצווה.

4. ניהול שאלונים ואיסוף נתונים קליניים

  1. בקשו מהמשתתפים למלא שאלונים כדי לקבל מידע על תזונה, דמוגרפיה, הרגלי עישון/אלכוהול, מצבים רפואיים/תרופות ואיכות חיים13.
  2. סקור תרשימים רפואיים כדי ללכוד נתונים קליניים כולל מעבדות קליניות, נתוני הדמיה, תרופות וסיבוכים רפואיים.

5. מיצוי DNA

  1. בצע מיצוי DNA מיד עם הוצאת ביופסיות התריסריון ושאב מהאחסון ב-80 מעלות צלזיוס. אין צורך בשלבי הכנה כדי לחלץ DNA מדגימות ביופסיה של התריסריון.
  2. בצע מיצוי וריצוף DNA עבור כל הדגימות באותו יום כדי להפחית את הסיכון לאפקט אצווה בניתוח. הגדר ספרייה ספציפית לדגימות שנאספו לפני שניתן יהיה לרצף את הדגימות.
  3. השתמש בערכת מיקרו-הכנה ל-DNA כדי לחלץ DNA מדגימות ביופסיה של התריסריון, לפי פרוטוקולהיצרן 14.
  4. הוסף את הכמות המקסימלית של דגימה לפי הנחיות הפרוטוקול לצינור ליזה המכיל 750 מיקרוליטר של תמיסת ליזה ונפח יבש של 0.7 מ"ל של חרוזי זכוכית 2 מ"מ.
  5. אבטח את צינורות הליזיס במקצף חרוזים עם מחזיק צינור והפעל את המקצף במהירות מרבית למשך חמש דקות לפחות. הזמן ישתנה בהתאם למקצף החרוזים והדגימה המנותחת.
  6. צנטריפוגה את צינורות הליזיס במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת.
  7. העבירו עד 400 מיקרוליטר של סופרנטנט דרך צינור איסוף מסונן וצנטריפוגה שוב ב-8000 x גרם למשך דקה אחת.
  8. מוסיפים 1200 מיקרוליטר של מאגר מקשר לפילטר בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבבים היטב עד לקבלת תערובת אחידה.
  9. מעבירים 800 מיקרוליטר מהתערובת למכלול עמוד ספין וצינור. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את הזרימה.
  10. הנח את עמוד הסיבוב על צינור צנטריפוגה חדש עם 400 מיקרוליטר של מאגר שטיפת DNA וערבב היטב עד לקבלת תערובת אחידה. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את הזרימה.
  11. חזור על שלב 5.10 פעמיים, עם מאגר כביסה של 700 מיקרוליטר ולאחר מכן 200 מיקרוליטר DNA לכל כביסה.
  12. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה לעמודת הסיבוב בצינור צנטריפוגה חדש. דגירה למשך דקה אחת, ואז צנטריפוגה ב-10,000 x g למשך דקה אחת כדי לחסל את ה-DNA. מחק את העמודה.
  13. סנן שוב את ה-DNA. ה-DNA מוכן כעת להגברת PCR.

6. הגברת DNA

  1. בצע הגברת PCR של אזור V4 של גן ה-RNA הריבוזומלי 16S על ידי ריצוף קצה זוגי של 250 × 2 ברצף aMiSeq, HiSeq או NovaSeq15.
  2. צור צלחת פריימר עם 96 בארות. צור תערובת מאסטר של 165 מיקרוליטר של פריימר קדמי משומר ILHS_515f (מלאי 100 מ"מ) ו-2970 מיקרוליטר של מים בדרגת ביולוגיה מולקולרית. הוסף 28.5 מיקרוליטר מהתערובת הזו לכל באר.
  3. הוסף 1.5 מיקרוליטר של פריימר הפוך מתאים מלוח 96 הבארות של פריימרים ייחודיים IL_806r ברקודים (מלאי 100 מיקרומטר). ברקודים אלה יזהו דגימות ייחודיות של מטופלים.
  4. צור תערובת מאסטר של מים (23.1 μL x 3.3 x מספר דגימות), מאגר PCR (3 μL x 3.3 x מספר דגימות), dNTPs (0.6 μL x 3.3 x מספר דגימות), ו-JumpStart Taq DNA פולימראז (0.3 μL x 3.3 x מספר דגימות).
    הערה: יש לבצע הגברת DNA 16S בשלוש עותקים.
  5. הוסף 81 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר בצלחת 96 הבאר הראשונה. הוסף 6 מיקרוליטר DNA ו -3 מ"ל תערובת פריימר לכל באר. השתמש בפיפטה רב-ערוצית P200 כדי לערבב את הבארות, ולאחר מכן פיפטה 30 מיקרוליטר לבאר המתאימה של כל אחת משתי לוחות ה-PCR האחרים. אטום את הצלחת.
  6. השתמש בהגדרות המחזור התרמי הבאות: 94 מעלות צלזיוס x 3 דקות; 35 מחזורים: 94 מעלות צלזיוס x 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס x 1 דקה, 72 מעלות צלזיוס x 1.5 דקות. לאחר 35 מחזורים: 72 מעלות צלזיוס x 10 דקות, 94 מעלות צלזיוס x 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.

7. ניקוי והגדרת ספרייה

  1. השתמש בערכת ניקוי PCR או DNA כדי לטהר את מוצרי ה-PCR. יש להוציא את ה-DNA עם 30 מיקרוליטר של מים בדרגת PCR (שטופלו ב-DEPC).
  2. השתמש בספקטרופוטומטר ספקטרום גלוי UV שיש לו את היכולת לכמת דגימות PCR.
  3. פתח את תוכנת הספקטרופוטומטר בשולחן העבודה של המחשב. לחץ על חומצת גרעין.
  4. נגב את היציאה במים מזוקקים. הוסף 1 מיקרוליטר של מאגר/מים 1x PCR ליציאה וכיול.
  5. הזן את מזהה הדגימה ופיפטה 1 מיקרוליטר של דגימה ליציאה.
  6. סגור את היציאה ולחץ על מדידה.
    הערה: הימנע מבועות אוויר בעת הוספת דוגמאות ליציאה.
  7. נגב את הדגימה עם מגבוני מעבדה ומים מזוקקים, ולאחר מכן הכן את הדגימה הבאה. רשום ערכים עם כל דוגמה. המחשב צריך גם לשמור אוטומטית.
  8. שלב 250 ננוגרם מכל מוצר PCR מוגבר בשפופרת אחת. זוהי ספריית הדנ"א.
  9. העבר את הספרייה, יחד עם קריאות 1 ו-2 ואת פריימרים לריצוף האינדקס למעבדת ריצוף לצורך ריצוף.
    הערה: אם מעבדה מקומית אינה זמינה, ניתן להשתמש במעבדת ריצוף מסחרית לשלב זה.

8. עיצוב נתונים

  1. נתוני רצף מספקים תוצאות בקבצי .fastq קדימה ואחורה. המר נתונים אלה לגיליון נתונים ונקה כך שניתן יהיה לנתח את המידע עבור יישומים במורד הזרם.
  2. פתח את תוכנת התכנות R. עקוב אחר ההוראות והקוד המפורטים בקובץ הקידוד המשלים כדי להמשיך דרך צינור DADA2 ולנקות את נתוני ריצוף ה-DNA16. הורד את מסד הנתונים של העזר של SILVA עבור הקצאת הטקסונומיה לאחר שהרצפים הועברו דרך קו הצינור17.
  3. בקצרה, טען את חבילת DADA2 ב-R. הגדר נתיב שבו כל קבצי ה-.fastq נשמרים באותה ספרייה וחלץ את הקבצים ל-R.
  4. קרא את שמות קבצי ה- fastq והתאם את רשימות קבצי ה- fastq קדימה ואחורה.
  5. בדוק את איכות הקריאות קדימה והפוכה.
    הערה: ניתן לחתוך רצפי נוקלאוטידים כדי לשמור על רצפים באיכות גבוהה.
  6. סנן וחתוך את קבצי ה-fastq. השתמש בפעולת השירות learnErrors כדי ללמוד את מודל השגיאה הפרמטרי שבו משתמש DADA2. זה יציג את שיעורי השגיאה הנצפים והצפויים עבור כל החלפת נוקלאוטידים אפשרית (A → C, A → T, A → G וכו').
  7. החל את אלגוריתם ההסקה של הדגימה כדי לקבוע את מספר הרצפים הייחודיים בכל דגימה ובדוק עוד יותר את האובייקט מסוג dada כדי להגיע למספר הגרסאות הייחודיות האמיתיות לכל דגימה.
  8. מזג את הקריאות קדימה ואחורה כדי לקבל רצפים שלמים ונטולי רעש.
  9. בנה טבלת וריאנט רצף אמפליקון (ASV).
  10. הסר כימרות מטבלת ה- ASV. רצפים כימריים הם רצף יחיד הנובע משני רצפי אב שופעים יותר.
  11. עקוב אחר המספר הכולל של קריאות שעברו בקו הצינור. DADA2 ישתמש ב-SILVA כדי להקצות טקסונומיה לכל רצף ייחודי. ניתן לנתח את הדיוק על ידי הכללת קהילה של רצפי חיידקים ידועים בצנרת DADA2 והשוואת גרסאות רצף DADA2 להרכב הצפוי של הקהילה.
    הערה: נתוני ריצוף ה-DNA מנוקים כעת ומוכנים לניתוח בהתבסס על ההיקף והמטרות הספציפיות של פרויקט המחקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הבדלי אוכלוסייה בין המיקרוביום הרירי למיקרוביום הלומינלי של המעי הפרוקסימלי
מחקרים קודמים מצאו הבדלים באוכלוסיות המיקרוביאליות של דגימות המעי הגס הלומינלי והרירי 4,5,18. התוצאות הראשוניות מראות כי דגימות שא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקרים על המיקרוביום חשובים להפליא, מכיוון שלמערכת האקולוגית המורכבת הזו יש תפקיד קריטי בהומאוסטזיס אנרגטי, בתגובות אימונולוגיות ובחילוף החומרים19. קיימים הבדלים אזוריים במיקרוביום שעשויים לשקף את התפקודים הפיזיולוגיים המובהקים של אזורים שונים במערכת הע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים פיננסיים מתחרים לדווח עליהם.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לסרטן מספר RO1CA204145.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL cryovialsCorning430659
96-well platesApplied Biosystems4306737
dNTPsSigmaD7295
Dry iceProvided by institution
EG29-i10 endoscopePentaxN/AEndoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometerBiotekN/A
EthanolSigma Aldrich676829
HiSeq 2500IlluminaN/A
IL_806r reverse primerIDT DNA technologiescustomcustom primers
ILHS_515f forward primerIDT DNA technologiescustomcustom primers
JumpStart Taq DNASigmaD4184
Mucus specimen trapBusse Hospital Disposables40540 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 softwareThermoFisher Scientific
PCR bufferSigmaP2192
PCR cleanup kitZymo ResearchD4204
Radial Jaw 4 Jumbo ForcepsBoston ScientificM005133432.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaireVioCareN/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep KitZymo ResearchD430025 ug binding capacity

References

  1. Kau, A., Ahern, P., Griffin, N., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474, 327-336 (2011).
  2. Young, V. B. The intestinal microbiota in health and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 28 (1), 63-69 (2012).
  3. Kolodziejczyk, A. A., Zheng, D., Elinav, E. Diet-microbiota interactions and personalized nutrition. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 742-753 (2019).
  4. Tuddenham, S., Sears, C. L. The intestinal microbiome and health. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 464-470 (2015).
  5. Dieterich, W., Schink, M., Zopf, Y. Microbiota in the Gastrointestinal Tract. Medical Sciences (Basel). 6 (4), 116(2018).
  6. Martinez-Guryn, K., et al. Small Intestine Microbiota Regulate Host Digestive and Absorptive Adaptive Responses to Dietary Lipids. Cell Host Microbe. 23 (4), 458-469 (2018).
  7. Kastl, A. J., Terry, N. A., Wu, G. D., Albenberg, L. G. The Structure and Function of the Human Small Intestinal Microbiota: Current Understanding and Future Directions. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (1), 33-45 (2020).
  8. Angelakis, E., et al. A Metagenomic Investigation of the Duodenal Microbiota Reveals Links with Obesity. PLoS One. 10 (9), 0137784(2015).
  9. Yu, L. X., Schwabe, R. F. The gut microbiome and liver cancer: mechanisms and clinical translation. Nature Reviews. Gastroenterology and Hepatology. 14 (9), 527-539 (2017).
  10. Schnabl, B., Brenner, D. A. Interactions between the intestinal microbiome and liver diseases. Gastroenterology. 146 (6), 1513-1524 (2014).
  11. Shen, T. D., Pyrsopoulos, N., Rustgi, V. K. Microbiota and the liver. Liver Transplant. 24 (4), 539-550 (2018).
  12. Hussain, S. K., et al. Dietary Protein, Fiber and Coffee Are Associated with Small Intestine Microbiome Composition and Diversity in Patients with Liver Cirrhosis. Nutrients. 12, 1395(2020).
  13. Kristal, A. R., et al. Evaluation of web-based, self-administered, graphical food frequency questionnaire. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 114 (4), 613-621 (2014).
  14. Benhammou, J. N., et al. Novel Lipid Long Intervening Noncoding RNA, Oligodendrocyte Maturation-Associated Long Intergenic Noncoding RNA, Regulates the Liver Steatosis Gene Stearoyl-Coenzyme A Desaturase As an Enhancer RNA. Hepatology Communications. 3 (10), 1356-1372 (2019).
  15. Earth Microbiome Project. 16S Illumina Amplicon Protocol. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2020).
  16. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  17. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, 590-596 (2013).
  18. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  19. Nieuwdorp, M., Gilijamse, P. W., Pai, N., Kaplan, L. M. Role of the microbiome in energy regulation and metabolism. Gastroenterology. 146 (6), 1525-1533 (2014).
  20. Jacob, N., et al. Inflammation-independent TL1A-mediated intestinal fibrosis is dependent on the gut microbiome. Mucosal Immunology. 11 (5), 1466-1476 (2018).
  21. Fujimori, S. What are the effects of proton pump inhibitors on the small intestine. World Journal of Gastroenterology. 21 (22), 6817-6819 (2015).
  22. Garcia-Tsao, G., Abraldes, J. G., Berzigotti, A., Bosch, J. Portal hypertensive bleeding in cirrhosis: Risk stratification, diagnosis, and management: 2016 practice guidance by the American Association for the study of liver diseases. Hepatology. 65 (1), 310-335 (2016).
  23. Prodan, A., Tremaroli, V., Brolin, H., Zwinderman, A. H., Nieuwdorp, M., Levin, E. Comparing bioinformatic pipelines for microbial 16S rRNA amplicon sequencing. PLoS One. 15 (1), (2019).
  24. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  25. Li, G., et al. Diversity of Duodenal and Rectal Microbiota in Biopsy Tissues and Luminal Contents in Healthy Volunteers. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 1136-1145 (2015).
  26. de Groot, P. F., et al. Distinct fecal and oral microbiota composition in human type 1 diabetes, an observational study. PLoS One. 12 (12), (2017).
  27. Kong, X., et al. New and Preliminary Evidence on Altered Oral and Gut Microbiota in Individuals with Autism Spectrum Disorder (ASD): Implications for ASD Diagnosis and Subtyping Based on Microbial Biomarkers. Nutrients. 11 (9), 2128(2019).
  28. Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. The Pervasive Effects of an Antibiotic on the Human Gut Microbiota, as Revealed by Deep 16S rRNA Sequencing. PLOS Biology. 6 (11), 280(2008).
  29. Dethlefsen, L., Relman, D. A. Incomplete recovery and individualized responses of the human distal gut microbiota to repeated antibiotic perturbation. PNAS. 108 (1), 4554-4561 (2011).
  30. Williams, R. C., Showalter, R., Kern, F. In vivo effect of bile salts and cholestyramine on intestinal anaerobic bacteria. Gastroenterology. 69 (2), 483-491 (1975).
  31. Seto, C. T., Jeralod, P., Orenstein, R., Chia, N., DiBiase, J. K. Prolonged use of a proton pump inhibitor reduces microbial diversity: implications for Clostridium difficile susceptibility. Microbiome. 2 (42), (2014).
  32. De Luca, F., Shoenfeld, Y. The microbiome in autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 195 (1), 74-85 (2019).
  33. Belkaid, Y., Hand, T. W. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 157 (1), 121-141 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RNA 16S

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved