십이지장 마이크로바이옴(Duodenal Microbiome)의 표본 수집 및 분석

요약

이 원고에서는 십이지장 마이크로바이옴을 샘플링하고 분석하는 새로운 방법에 대해 논의합니다. 이 방법은 십이지장의 미생물 다양성과 구성을 정확하게 묘사하며 십이지장 마이크로바이옴에 대한 추가 조사에 유용할 수 있습니다.

초록

마이크로바이옴의 변화는 인간과 마우스 모델 모두에서 많은 장기 시스템의 생리학 및 병태생리학과 상관관계가 있습니다. 장내 마이크로바이옴은 일반적으로 배설물 표본 수집을 통해 연구되어 왔습니다. 대변 샘플을 쉽게 얻을 수 있기 때문에 원위 내강 위장관에 관한 정보를 밝힌 많은 연구가 이루어졌습니다. 그러나 근위부 장에서 미생물 군집의 중요성을 다룬 연구는 거의 없습니다. 십이지장이 소화와 흡수의 주요 부위라는 점을 감안할 때, 십이지장의 마이크로바이옴은 영양 및 간 질환과 관련이 있으며 추가 조사가 필요합니다. 여기에서는 십이지장 흡인 및 생검을 통해 상부 내시경 검사를 받는 인간 피험자에서 근위 내강 및 점막 장내 마이크로바이옴을 샘플링하는 새로운 방법에 대해 자세히 설명합니다. 검체 채취는 용이하며 대장내시경 검사 중 결장 검체를 채취하는 경우와 같이 환자 준비 순응도와 같은 인공물의 영향을 받지 않습니다. 예비 결과에 따르면 내강 마이크로바이옴과 점막 마이크로바이옴이 크게 다르며, 이는 환경 조건 및 장벽 기능과 관련이 있을 수 있습니다. 따라서 십이지장 흡인과 생검을 조합하면 십이지장 내 미생물 군집에 대한 보다 포괄적인 그림을 볼 수 있습니다. 생검은 십이지장의 하강하는 부분과 수평한 부분에서 얻어지며, 이는 해부학적으로 간과 담도계에 가깝습니다. 이는 간 질환에서 담즙산 생물학과 장-간 축의 역할을 연구하는 데 중요합니다. 생검 및 흡인은 16S 리보솜 RNA 염기서열분석, 대사체학 및 기타 유사한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

서문

장내 마이크로바이옴은 최근 몇 년 동안 관심이 높아진 분야가 되었습니다. 이제 장내 다양한 박테리아 개체군은 유전학, 식단, 약물 및 환경적 영향을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다는 것이 이해되고 있습니다¹. 또한 연구를 통해 비만, 염증성 장 질환, 간 질환과 같은 다양한 위장 질환과 관련된 고유한 미생물 프로파일을 확인했습니다 ^2,3. 대부분의 연구는 분변 및 원위 점막 샘플 분석을 통해 대장의 마이크로바이옴을 프로파일링하는 데 초점을 맞추고 있습니다⁴. 장내 세균의 농도가 가장 높은 곳은 결장(10¹² bacteria/g)이지만, 그럼에도 불구하고 소화기 대사와 흡수에 중요한 역할을 하는 십이지장(10³/g), 제주눔(jejunum, 10⁴/g), 회장(10⁷/g)에 서식하는 복잡한 미생물 군집이 존재한다⁵.

소장은 위장관에서 영양소가 분해되고 흡수되는 주요 부위 역할을 합니다. 소장을 둘러싸고 있는 공생균(共公公)은 식품 기질의 화학적 분해와 영양소 흡수를 돕는 생리 활성 화합물의 방출을 돕는 근본적인 역할을 한다⁶. 이러한 상호 작용은 소장에서 미생물-미생물 및 숙주-미생물 활동의 복잡한 환경에 기여합니다⁷. 쥐 모델에서 소장 미생물총(microbiota)을 관찰한 연구에 따르면, 고지방 식단을 섭취한 무균 마우스는 지질 흡수가 손상되었지만, 제주날 미생물총(jejunal microbiota)에 군집화되었을 때 지질 흡수가 직접적으로 증가했다⁶. 비만인 사람과 건강한 사람의 십이지장 미생물총(duodenal microbiota)을 프로파일링한 인간 파일럿 연구에서는 비만인 사람의 십이지장 미생물총(duodenal microbiota)이 지방산과 자당 분해 경로에 변화를 일으켰으며, 이는 식이 의존적 관계에서 유발되었을 가능성이 있음을 발견했다⁸. 또한, 소장 미생물총(microbiota)의 세균 불균형(dysbiosis)은 소장 세균 과다 증식, 단장 증후군, 주머니염, 환경성 장 기능 장애, 과민성 대장 증후군(vulitable bowel syndrome) 등 여러 질병에서 확인되었다⁷.

우리는 마이크로바이옴과 만성 간 질환의 여러 단계 사이의 관계에 관심이 있습니다. 구체적으로 말하자면, 십이지장은 소장에서 화학적 분해와 영양 흡수의 첫 번째 부위 역할을 합니다. 또한 문맥 간 순환은 영양소와 대사 산물을 간으로 가져와 혈류로 처리되고 조절됩니다. 장과 간 사이의 해부학적 근접성은 장 장벽의 실패나 장내 마이크로바이옴의 변화로 인해 발생할 수 있는 전염증 반응에 취약한 환경을 조성한다⁹. 마이크로바이옴 및 간 질환 진행을 조사한 연구에서는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 지방간염(NASH), 알코올성 간 질환 및 간경변 환자에서 미생물 세균 불균형이 확인되었습니다^10,11. 대부분의 연구가 대장의 마이크로바이옴을 특성화하고 있지만, 우리는 간 질환과 관련된 소장 마이크로바이옴을 조사하는 데 관심이 있었습니다. 여기에 제시된 새로운 방법을 활용함으로써, 우리는 다이어트¹²와 관련하여 간경변 환자에서 독특한 십이지장 미생물 프로파일을 확인했다.

소장 마이크로바이옴의 특성화가 계속해서 증가하는 관심 분야가 됨에 따라 소장 마이크로바이옴을 정확하게 나타내는 샘플을 얻기 위한 균일한 기술을 개발해야 합니다. 그러나 검체 조달과 관련된 문제가 있어 소장 마이크로바이옴 환경에 대한 연구를 복잡하게 만들었습니다. 현재의 샘플링 방법은 Kastl et al⁷에 요약된 바와 같이 종종 오염에 노출되는 침습적 절차를 필요로 합니다. 여기에서는 식도위십이지장내시경 검사를 받는 간 질환 환자로부터 미생물 분석을 위한 십이지장 흡인 및 생검을 얻는 새로운 방법에 대해 자세히 설명합니다.

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프로토콜

십이지장 샘플은 지역 윤리 검토 위원회의 기관 검토 위원회에서 Microbiome, Microbial Markers and Liver Disease(M3LD) 연구에 대한 임상 프로토콜이 수락된 후 Veteran Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, Cedars-Sinai Medical Center 및 Ronald Reagan UCLA Medical Center에서 얻었습니다. 참여한 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다.

1. 참가자의 동의

1. 병인에 관계없이 간경변 진단을 받은 피험자에게 정맥류 선별 검사 또는 모집을 위한 문맥 고혈압을 위해 내시경 검사가 예정되어 있는 피험자에게 접근합니다. 간세포암(HCC) 환자는 제외합니다.
2. 연구를 소개하고, 참가자가 주의 깊게 이해했는지 확인하고, 참가자에게 연구에 자원하고 싶은지 물어봅니다. 동의하는 경우 정보에 입각한 동의서를 작성하십시오.
3. 적절하게 교육을 받고 자격을 갖춘 의료 전문가가 내시경 검사를 수행하도록 합니다.

2. 표본 수집

1. 펜타닐 50mg과 미다졸람 2mg으로 환자를 마취합니다. 환자가 적당히 마취되고 내시경을 견딜 수 있을 때까지 필요에 따라 복용량을 늘립니다.
2. 내시경(예: Pentax EG29-i10)을 환자의 식도에 삽입하고 유문 쪽으로 진행합니다.
   참고: 내시경 크기는 환자의 생리학에 따라 다릅니다. 샘플 수집 전에 흡인을 위해 내시경을 사용하지 마십시오.amp내시경 채널이 위 또는 구인두 분비물로 오염되는 것을 방지하기 위해.
3. 현미경 슬라이드를 구하고 18 게이지 주사기 바늘을 무딘 상태로 만들어 표본 조달을 준비합니다. 현미경 슬라이드에서 냉동 용액으로 생검을 전송하는 데 사용할 멸균 패드를 준비합니다.
4. 내시경이 Vater의 앰풀라 원위부 십이지장의 두 번째 부분에 도착하면 상부 내시경의 작동 채널을 통과한 멸균 일회용 흡인 카테터를 통해 존재하는 모든 유체를 흡인하고 40mL 일회용 검체 용기에 수집합니다. 주사기를 통해 최대 30mL의 추가 멸균수를 십이지장으로 세척하고 유체를 유체 표본 트랩으로 흡인하여 총 15mL를 수집합니다.
5. 카테터의 흡입 구성 요소에 부착된 흡인 용기를 즉시 제거하고 캡을 씌웁니다. 용기를 보온병에 넣고 얼음 위에 올려 놓고 표본 운송 백에 넣어 처리 실험실로 옮깁니다.
6. 2.8mm 일회용 생검 집게를 내시경 측면의 포트에 삽입하여 연구를 위한 조직 표본을 제거합니다. 십이지장의 두 번째 부분 내에서 집게를 무작위로 2회 통과하여 각 패스에서 조직을 두 번 수집합니다.
7. 뭉툭한 18 게이지 주사기 바늘을 사용하여 겸자에서 조직 샘플을 추출하고 현미경 슬라이드로 이동한 후 샘플을 4개의 빈 2mL 극저온판으로 옮깁니다. 캡을 단단히 조입니다.
8. 단단히 뚜껑을 씌운 4개의 극저온 음료를 모두 소변 컵과 같은 빈 용기에 삽입하고 20mL의 에탄올과 드라이아이스로 구성된 수조를 만들어 생검을 급속 동결합니다.
9. 생검 냉동 보존제를 단열 스티로폼 용기에 담아 드라이아이스 베드 위에 놓고 검체를 -80°C 냉동고에 옮겨 장기 보관하여 검체를 보존합니다.

3. 흡인 처리

1. 생체 표본 수집 후 즉시 생물 표본을 BSL2 이상의 실험실로 옮겨 처리합니다.
2. 흡인 유체 용기를 부드럽게 4회 뒤집은 다음 약 1.5mL의 유체를 2mL 극저온으로 분취합니다.
3. 배치 분석을 수행할 수 있을 때까지 검체를 -80°C에서 보관하십시오.

4. 설문지 관리 및 임상 데이터 수집

1. 참가자들에게 식단, 인구 통계, 흡연/음주 습관, 건강 상태/약물 및 삶의 질에 대한 정보를 도출하기 위해 설문지를 작성하도록 요청하십시오¹³.
2. 의료 차트를 검토하여 임상 실험실, 영상 데이터, 약물 및 의학적 합병증을 포함한 임상 데이터를 캡처합니다.

5. DNA 적출

1. 십이지장 생검을 제거하는 즉시 DNA 추출을 수행하고 -80°C에서 보관에서 흡인합니다. 십이지장 생검 검체에서 DNA를 추출하기 위한 준비 단계는 필요하지 않습니다.
2. 같은 날 모든 샘플에 대해 DNA 추출 및 염기서열분석을 수행하여 분석에서 배치 효과의 위험을 줄입니다. 샘플의 염기서열을 분석하기 전에 수집된 샘플에 특정한 라이브러리를 설정합니다.
3. DNA 마이크로프렙 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜¹⁴에 따라 십이지장 생검 검체에서 DNA를 추출합니다.
4. 750μL의 용해 용액과 0.7mL의 건조 부피의 2mm 유리 구슬이 들어 있는 용해 튜브에 프로토콜 지침에 따라 최대 양의 샘플을 추가합니다.
5. 튜브 홀더를 사용하여 비드 비터에 용해 튜브를 고정하고 최소 5분 동안 최대 속도로 비터를 작동시킵니다. 시간은 비드 비터와 분석 중인 샘플에 따라 달라집니다.
6. 마이크로 원심분리기에서 10,000 x g의 속도로 1분 동안 용해 튜브를 원심분리합니다.
7. 여과된 수집 튜브를 통해 최대 400μL의 상층액을 전달하고 8000 x g에서 1분 동안 다시 원심분리합니다.
8. 마이크로 원심분리 튜브의 여과액에 1200μL의 결합 완충액을 추가하고 균질해질 때까지 철저히 혼합합니다.
9. 혼합물 800μL를 스핀 컬럼 및 튜브 어셈블리로 전달합니다. 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 플로우 스루를 폐기합니다.
10. 400μL의 DNA 세척 완충액이 있는 새 원심분리 튜브에 스핀 컬럼을 놓고 균질해질 때까지 철저히 혼합합니다. 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 플로우 스루를 폐기합니다.
11. 세척당 700 μL 및 200 μL DNA 세척 버퍼를 사용하여 5.10단계를 두 번 반복합니다.
12. 20μL의 용리 완충액을 새 원심분리 튜브의 스핀 컬럼에 추가합니다. 1분 동안 배양한 다음 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용리합니다. 열을 버립니다.
13. DNA를 다시 필터링합니다. 이제 DNA가 PCR 증폭을 할 준비가 되었습니다.

6. DNA 증폭

1. aMiSeq, HiSeq 또는 NovaSeq 염기서열분석기¹⁵에서 250 × 2 paired-end sequencing으로 16S 리보솜 RNA 유전자의 V4 영역을 PCR 증폭합니다.
2. 96웰 플레이트 프라이머 플레이트를 만듭니다. 165 μL의 ILHS_515f 보존된 전방 프라이머(100 mM 스톡)와 2970 μL의 분자생물학 등급 물의 마스터 믹스를 만듭니다. 이 혼합물 28.5μL를 각 웰에 추가합니다.
3. 바코드가 지정된 고유한 프라이머(100μM 스톡)의 96웰 플레이트에서 1.5μL의 해당 역방향 프라이머IL_806r 추가합니다. 이 바코드는 고유한 환자 샘플을 식별합니다.
4. 물(23.1 μL x 3.3 x 시료 수), PCR 완충액(3 μL x 3.3 x 시료 수), dNTP(0.6 μL x 3.3 x 시료 수) 및 JumpStart Taq DNA 중합효소(0.3 μL x 3.3 x 시료 수)의 마스터 믹스를 만듭니다.
   참고: 16S DNA 증폭은 3회에 걸쳐 수행해야 합니다.
5. 첫 번째 96웰 플레이트의 각 웰에 81μL의 마스터 믹스를 추가합니다. 각 웰에 6μL의 DNA와 3mL의 프라이머 혼합물을 추가합니다. P200 멀티채널 피펫을 사용하여 웰을 혼합한 다음 30 μL를 다른 두 PCR 플레이트 각각의 해당 웰에 피펫팅합니다. 접시를 밀봉하십시오.
6. 다음 열 순환기 설정을 사용하십시오: 94 °C x 3 분; 35 사이클: 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 분, 72 °C x 1.5 분 35 사이클 후: 72 °C x 10 분, 94 °C x 5 분, 4 °C 무기한.

7. 정리 및 라이브러리 설정

1. PCR 또는 DNA 클린업 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 30μL의 PCR 등급(DEPC 처리) 물로 DNA를 용리합니다.
2. PCR 샘플을 정량화할 수 있는 UV 가시광선 스펙트럼 분광 광도계를 사용하십시오.
3. 컴퓨터 바탕 화면에서 분광 광도계 소프트웨어를 엽니다. Nucleic Acid(핵산)를 클릭합니다.
4. 증류수로 포트를 닦습니다. 1μL의 1x PCR 완충액/물을 포트에 추가하고 보정합니다.
5. 시료 ID를 입력하고 1μL의 시료를 포트에 피펫팅합니다.
6. 포트를 닫고 측정을 누르십시오.
   알림: s를 추가할 때 기포를 피하십시오.amp포트에 les.
7. 실험실 물티슈와 증류수로 샘플을 닦아낸 후 다음 샘플을 준비합니다. 각 샘플과 함께 값을 기록합니다. 컴퓨터도 자동 저장해야 합니다.
8. 각 증폭된 PCR 산물 250ng을 튜브 1개에 결합합니다. 이것이 DNA 라이브러리입니다.
9. 염기서열분석을 위해 판독 1 및 2 및 인덱스 염기서열분석 프라이머와 함께 라이브러리를 염기서열분석 실험실로 전달합니다.
   참고: 현지 실험실을 이용할 수 없는 경우 이 단계에 상용 염기서열분석 실험실을 활용할 수 있습니다.

8. 데이터 포맷

1. 데이터 시퀀싱은 정방향 및 역방향 .fastq 파일로 결과를 제공합니다. 이 데이터를 데이터 시트로 변환하고 정리하여 다운스트림 애플리케이션에 대한 정보를 분석할 수 있습니다.
2. R 프로그래밍 소프트웨어를 엽니다. 추가 코딩 파일에 나열된 지침과 코드에 따라 DADA2 파이프라인을 진행하고 DNA 염기서열분석 데이터¹⁶을 정리합니다. 염기서열이 파이프라인¹⁷을 통과한 후 분류 할당에 대한 SILVA 참조 데이터베이스를 다운로드합니다.
3. 간단히 말해서, R에서 DADA2 패키지를 로드합니다. 모든 .fastq 파일이 동일한 디렉토리에 저장되는 경로를 정의하고 파일을 R로 추출합니다.
4. fastq 파일의 이름을 읽고 정방향 및 역방향 fastq 파일의 목록을 일치시킵니다.
5. 정방향 읽기와 역방향 읽기의 품질을 검사합니다.
   참고: 뉴클레오티드 염기서열은 고품질 염기서열을 유지하기 위해 절단될 수 있습니다.
6. fastq 파일을 필터링하고 다듬습니다. learnErrors 메서드를 사용하여 DADA2가 사용하는 파라메트릭 오차 모델을 학습합니다. 이는 각 가능한 뉴클레오티드 치환(A → C, A → T, A → G 등)에 대해 관찰된 오류율과 예상되는 오류율을 보여줍니다.
7. 샘플 추론 알고리즘을 적용하여 각 샘플의 고유한 염기서열 수를 확인하고 dada-class 객체를 추가로 검사하여 샘플당 실제 고유 변이의 수에 도달합니다.
8. 정방향 읽기와 역방향 읽기를 병합하여 완전한 시퀀스와 잡음이 제거된 시퀀스를 얻을 수 있습니다.
9. 앰플리콘 염기서열 변이체(ASV) 테이블을 구성합니다.
10. ASV 테이블에서 키메라를 제거합니다. 키메라 시퀀스는 두 개의 더 풍부한 부모 시퀀스에서 생성된 단일 시퀀스입니다.
11. 파이프라인을 통과한 총 읽기 수를 추적합니다. DADA2는 SILVA를 사용하여 각각의 고유한 염기서열에 분류법을 할당합니다. 정확도는 DADA2 파이프라인에 알려진 박테리아 염기서열 군집을 포함하고 DADA2 염기서열 변이체를 군집의 예상 구성과 비교하여 분석할 수 있습니다.
    참고: 이제 DNA 염기서열 분석 데이터가 정리되어 연구 프로젝트의 특정 범위와 목표에 따라 분석할 준비가 되었습니다.

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결과

근위 장의 점막과 내강 마이크로바이옴 간의 개체군 차이
이전 연구에서는 내강 및 점막 결장 표본의 미생물 개체군에서 차이를 발견했습니다 ^4,5,18. 예비 결과는 십이지장 흡인 및 생검 검체가 근위 장에서 내강 및 점막 미생물총(microbiota)을 모두 측정할 수 있음을 보여줍니다. 또한, 이...

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토론

마이크로바이옴에 대한 연구는 매우 중요한데, 이 복잡한 생태계는 에너지 항상성, 면역학적 반응 및 신진대사에 중요한 역할을 하기 때문입니다¹⁹. 위장관의 다양한 영역의 뚜렷한 생리적 기능을 반영할 수 있는 지역별 마이크로바이옴 차이가 존재하며, 이는 다양한 질병 상태에 영향을 미칠 수 있습니다²⁰. 분변 마이크로바이옴이 가?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity