Recolección de muestras y análisis del microbioma duodenal

Resumen

En este manuscrito, discutimos un método novedoso para muestrear y analizar el microbioma duodenal. Este método proporciona una descripción precisa de la diversidad y composición microbiana en el duodeno y podría ser útil para una mayor investigación del microbioma duodenal.

Resumen

Los cambios en el microbioma se han correlacionado con la fisiología y la fisiopatología de muchos sistemas de órganos, tanto en humanos como en modelos de ratones. El microbioma intestinal se ha estudiado típicamente a través de colecciones de muestras fecales. La facilidad de obtención de muestras fecales ha dado lugar a muchos estudios que han revelado información sobre el tracto gastrointestinal luminal distal. Sin embargo, pocos estudios han abordado la importancia del microbioma en el intestino proximal. Dado que el duodeno es un sitio importante para la digestión y la absorción, su microbioma es relevante para la nutrición y la enfermedad hepática y justifica una mayor investigación. En este artículo detallamos un método novedoso para muestrear el microbioma intestinal luminal proximal y mucoso en sujetos humanos sometidos a endoscopia superior mediante la obtención de aspirado duodenal y biopsias. La obtención de muestras es fácil y no se ve afectada por artefactos como la adherencia preparatoria del paciente, como podría ser el caso de la obtención de muestras de colon durante la colonoscopia. Los resultados preliminares muestran que los microbiomas luminales y mucosos difieren significativamente, lo que probablemente esté relacionado con las condiciones ambientales y las funciones de barrera. Por lo tanto, una combinación de aspirado duodenal y biopsias revela una imagen más completa del microbioma en el duodeno. Las biopsias se obtienen de los segmentos descendente y horizontal del duodeno, que están anatómicamente cerca del hígado y del árbol biliar. Esto es importante para estudiar el papel de la biología de los ácidos biliares y el eje intestino-hígado en la enfermedad hepática. Las biopsias y el aspirado se pueden utilizar para la secuenciación del ARN ribosómico 16S, la metabolómica y otras aplicaciones similares.

Introducción

El microbioma intestinal se ha convertido en un área de mayor interés en los últimos años. Ahora se entiende que la diversa población bacteriana en el intestino puede diferir en función de una variedad de factores, incluida la genética, la dieta, la medicación^{y las} influencias ambientales. Los estudios también han identificado perfiles microbianos únicos relacionados con diversas enfermedades gastrointestinales, como la obesidad, la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad hepática ^2,3. La mayoría de los estudios se centran en el perfil del microbioma del intestino grueso mediante el análisis de muestras de mucosa fecal y distal⁴. Aunque la mayor concentración de bacterias intestinales reside en el colon (10¹² bacterias/gramo), existe una compleja comunidad de microbios que residen en el duodeno (10³/g), el yeyuno (10⁴/g) y el íleon (10⁷/g) que desempeña un papel clave en el metabolismo digestivo y la absorción⁵.

El intestino delgado sirve como el sitio principal de descomposición y absorción de nutrientes en el tracto gastrointestinal. Las bacterias comensales que recubren el intestino delgado desempeñan un papel fundamental en la descomposición química de los sustratos alimentarios y en la liberación de compuestos bioactivos que ayudan en^{la absorción} de nutrientes. Estas interacciones contribuyen a un entorno complejo de actividad microbio-microbio y huésped-microbio en el intestino delgado⁷. Un estudio que observó la microbiota del intestino delgado en modelos murinos descubrió que los ratones libres de gérmenes alimentados con una dieta rica en grasas tenían una absorción de lípidos alterada, pero, cuando estaban colonizados con microbiota yeyunal, tenían un aumento directo de la absorción de lípidos⁶. Un estudio piloto en humanos que analizó la microbiota duodenal de individuos obesos y sanos descubrió que la microbiota duodenal de individuos obesos presentaba alteraciones en las vías de descomposición de los ácidos grasos y la sacarosa, probablemente inducidas en una relación dependiente de la dieta⁸. Además, la disbiosis en la microbiota del intestino delgado se ha identificado en varias enfermedades, como el sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado, el síndrome del intestino corto, la pouchitis, la disfunción entérica ambiental y el síndrome del intestino irritable⁷.

Estamos interesados en la relación entre el microbioma y las diferentes etapas de la enfermedad hepática crónica. Específicamente, el duodeno sirve como el primer sitio de descomposición química y absorción nutricional en el intestino delgado. Además, la circulación hepática portal lleva nutrientes y metabolitos al hígado, donde se procesan y regulan en el torrente sanguíneo. La proximidad anatómica entre el intestino y el hígado crea un entorno susceptible a las respuestas proinflamatorias que pueden surgir debido a un fallo en la barrera intestinal o alteraciones en el microbioma intestinal⁹. Los estudios que investigan el microbioma y la progresión de la enfermedad hepática han identificado disbiosis microbiana en pacientes con enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis (EHNA), enfermedad hepática alcohólica y cirrosis^10,11. Si bien la mayoría de los estudios caracterizan el microbioma del colon, estábamos interesados en investigar el microbioma del intestino delgado en relación con la enfermedad hepática. Mediante la utilización del método novedoso presentado aquí, hemos identificado perfiles microbianos duodenales únicos en pacientes con cirrosis hepática en relación con la dieta¹².

Dado que la caracterización del microbioma del intestino delgado sigue convirtiéndose en un área de creciente interés, es necesario desarrollar técnicas uniformes para obtener muestras que representen con precisión la microbiota del intestino delgado. Sin embargo, existen desafíos asociados con la obtención de muestras que han complicado el estudio del entorno del microbioma del intestino delgado. Los métodos de muestreo actuales requieren procedimientos invasivos que a menudo están sujetos a contaminación, como lo describen Kastl et al⁷. En este trabajo detallamos un método novedoso para la obtención de aspirado duodenal y biopsias para análisis microbiano de pacientes con enfermedad hepática sometidos a esofagogastroduodenoscopia.

Protocolo

Las muestras duodenales se obtuvieron en el Sistema de Atención Médica de Asuntos de Veteranos del Área Metropolitana de Los Ángeles, el Centro Médico Cedars-Sinai y el Centro Médico Ronald Reagan de UCLA después de que el protocolo clínico para el estudio Microbioma, Marcadores Microbianos y Enfermedad Hepática (M3LD) fuera aceptado por la junta de revisión institucional del comité de revisión de ética local. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes participantes.

1. Consentimiento de los participantes

1. Abordar sujetos con diagnóstico de cirrosis hepática de cualquier etiología con endoscopias programadas para el cribado de várices o hipertensión portal para su reclutamiento. Excluir a los pacientes con carcinoma hepatocelular (CHC).
2. Presente el estudio, asegúrese cuidadosamente de que el participante lo comprenda y pregúntele si le gustaría ser voluntario en el estudio. Complete un formulario de consentimiento informado si están de acuerdo.
3. Asegúrese de que la endoscopia sea realizada por un profesional médico debidamente capacitado y acreditado.

2. Colección de especímenes

1. Anestesiar al paciente con 50 mg de fentanilo y 2 mg de midazolam. Aumente la dosis según sea necesario hasta que el paciente esté moderadamente anestesiado y pueda tolerar el endoscopio.
2. Inserte un endoscopio (por ejemplo, Pentax EG29-i10) en el esófago del paciente y avance hacia el píloro.
   NOTA: El tamaño del endoscopio variará según la fisiología del paciente. No utilice el endoscopio para ninguna aspiración antes de la recolección de la muestra para evitar contaminar el canal del endoscopio con secreciones gástricas u orofaríngeas.
3. Obtenga un portaobjetos de microscopio y una aguja de jeringa roma de calibre 18 para prepararse para la obtención de muestras. Prepare una almohadilla estéril que se utilizará para transferir las biopsias del portaobjetos del microscopio a los crioviales.
4. Cuando el endoscopio llegue a la segunda porción del duodeno distal a la ampolla de Vater, aspire cualquier líquido presente a través de un catéter de aspiración desechable estéril que pasa a través del canal de trabajo del endoscopio superior y recójalo en un recipiente de muestra desechable de 40 mL. Enjuague hasta 30 mL de agua estéril adicional con una jeringa en el duodeno y aspire el líquido en una trampa de muestras de fluido para recolectar un total de 15 mL.
5. Retire y tape inmediatamente el recipiente de aspirado conectado al componente de succión del catéter. Coloque el recipiente en un termo sobre hielo y en una bolsa de transporte de muestras para transferirlo al laboratorio de procesamiento.
6. Inserte una pinza de biopsia de un solo uso de 2,8 mm en el puerto del lateral del endoscopio para extraer muestras de tejido para la investigación. Realice 2 pasadas aleatorias de las pinzas dentro de la segunda porción del duodeno, recogiendo dos mordidas de tejido en cada pasada.
7. Utilice una aguja de jeringa roma de calibre 18 para extraer muestras de tejido de las pinzas y colocarlas en el portaobjetos del microscopio antes de transferir las muestras a cuatro crioviales vacíos separados de 2 ml. Enrosque firmemente las tapas.
8. Inserte los 4 crioviales bien tapados en un recipiente vacío, como un recipiente de orina, y cree un baño, que consta de 20 ml de etanol y hielo seco, para congelar rápidamente las biopsias.
9. Coloque los crioviales de biopsia en un recipiente aislado de espuma de poliestireno sobre un lecho de hielo seco y transfiera las muestras a un congelador de -80 °C para su almacenamiento a largo plazo para preservar las muestras.

3. Procesamiento de aspirado

1. Después de la recolección de muestras biológicas, transfiera inmediatamente las muestras biológicas a un laboratorio BSL2 o superior para su procesamiento.
2. Invierta suavemente el recipiente de líquido aspirado cuatro veces, y luego alícuota aproximadamente 1,5 mL del líquido en crioviales de 2 mL.
3. Almacene las muestras a -80 °C hasta que se pueda realizar el análisis del lote.

4. Administración del cuestionario y recogida de datos clínicos

1. Pida a los participantes que completen cuestionarios para obtener información sobre la dieta, los datos demográficos, los hábitos de tabaquismo/alcohol, las condiciones médicas/medicamentos y la calidad de vida¹³.
2. Revise las historias clínicas para capturar datos clínicos, incluidos laboratorios clínicos, datos de imágenes, medicamentos y complicaciones médicas.

5. Extracción de ADN

1. Realizar la extracción de ADN inmediatamente después de retirar las biopsias duodenales y aspirar del almacenamiento a -80 °C. No se requieren pasos preparatorios para extraer el ADN de las muestras de biopsia duodenal.
2. Realice la extracción y secuenciación de ADN de todas las muestras el mismo día para disminuir el riesgo de un efecto de lote en el análisis. Configure una biblioteca específica para los especímenes recolectados antes de que se puedan secuenciar las muestras.
3. Utilice un kit de micropreparación de ADN para extraer ADN de muestras de biopsia duodenal, según el protocolo¹⁴ del fabricante.
4. Añada la cantidad máxima de muestra según las directrices del protocolo a un tubo de lisis que contenga 750 μL de solución de lisis y un volumen seco de 0,7 mL de perlas de vidrio de 2 mm.
5. Asegure los tubos de lisis en un batidor de perlas con un soporte para tubos y haga funcionar el batidor a máxima velocidad durante al menos cinco minutos. El tiempo variará según el batidor de cuentas y la muestra que se esté analizando.
6. Centrifugar los tubos de lisis en una microcentrífuga a 10.000 x g durante 1 min.
7. Transfiera hasta 400 μL de sobrenadante a través de un tubo de recolección filtrado y vuelva a centrifugar a 8000 x g durante 1 min.
8. Añadir 1200 μL de tampón aglutinante al filtrado en un tubo de microcentrífuga y mezclar bien hasta que quede homogéneo.
9. Transfiera 800 μL de la mezcla a un conjunto de columna de centrifugación y tubo. Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
10. Coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de centrífuga con 400 μL de tampón de lavado de ADN y mezcle bien hasta que quede homogéneo. Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.
11. Repita el paso 5.10 dos veces, con 700 μL y luego 200 μL de tampón de lavado de ADN por lavado.
12. Añada 20 μL de tampón de elución a la columna de centrifugación en un nuevo tubo de centrífuga. Incubar durante un minuto, luego centrifugar a 10,000 x g durante 1 min para eluir el ADN. Deseche la columna.
13. Vuelve a filtrar el ADN. El ADN ya está listo para la amplificación por PCR.

6. Amplificación del ADN

1. Realice la amplificación por PCR de la región V4 del gen de ARN ribosómico 16S mediante secuenciación de 250 × 2 extremos emparejados en el secuenciador aMiSeq, HiSeq o NovaSeq¹⁵.
2. Cree una placa de cebado de 96 pocillos. Cree una mezcla maestra de 165 μL de imprimación directa conservada ILHS_515f (100 mM de stock) y 2970 μL de agua de grado de biología molecular. Agregue 28,5 μL de esta mezcla a cada pocillo.
3. Añada 1,5 μL de cebador inverso correspondiente de la placa de 96 pocillos de imprimadores únicos IL_806r con código de barras (100 μM de caldo). Estos códigos de barras identificarán muestras únicas de pacientes.
4. Cree una mezcla maestra de agua (23,1 μL x 3,3 x número de muestras), tampón de PCR (3 μL x 3,3 x número de muestras), dNTP (0,6 μL x 3,3 x número de muestras) y ADN polimerasa JumpStart Taq (0,3 μL x 3,3 x número de muestras).
   NOTA: La amplificación del ADN 16S debe realizarse por triplicado.
5. Agregue 81 μL de mezcla maestra a cada pocillo en la primera placa de 96 pocillos. Agregue 6 μL de ADN y 3 mL de mezcla de cebador a cada pocillo. Utilice una pipeta multicanal P200 para mezclar los pocillos y, a continuación, pipetee 30 μL en el pocillo correspondiente de cada una de las otras dos placas de PCR. Selle la placa.
6. Utilice los siguientes ajustes del termociclador: 94 °C x 3 min; 35 ciclos: 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 min, 72 °C x 1,5 min. Después de 35 ciclos: 72 °C x 10 min, 94 °C x 5 min, 4 °C indefinidamente.

7. Limpieza y configuración de la biblioteca

1. Emplee un kit de limpieza de PCR o ADN para purificar los productos de PCR. Eluir el ADN con 30 μL de agua de grado PCR (tratada con DEPC).
2. Utilice un espectrofotómetro de espectro UV-visible que tenga la capacidad de cuantificar muestras de PCR.
3. Abra el software del espectrofotómetro en el escritorio de la computadora. Haga clic en ácido nucleico.
4. Limpie el puerto con agua destilada. Agregue 1 μL de 1x tampón PCR/agua al puerto y calibre.
5. Introduzca el ID de la muestra y pipetee 1 μL de muestra en el puerto.
6. Cierre el puerto y presione Medir.
   NOTA: Evite las burbujas de aire al agregar muestras en el puerto.
7. Limpie la muestra con toallitas de laboratorio y agua destilada, y luego prepare la siguiente muestra. Registre los valores con cada muestra. La computadora también debe guardarse automáticamente.
8. Combine 250 ng de cada producto de PCR amplificado en 1 tubo. Esta es la biblioteca de ADN.
9. Entregue la biblioteca, junto con las lecturas 1 y 2 y los cebadores de secuenciación de índice a un laboratorio de secuenciación para su secuenciación.
   NOTA: Si no se dispone de un laboratorio local, se puede utilizar un laboratorio de secuenciación comercial para este paso.

8. Formato de datos

1. Los datos de secuenciación proporcionan resultados en archivos .fastq directos e inversos. Convierta estos datos en una hoja de datos y límpiela para que la información pueda analizarse para aplicaciones posteriores.
2. Abra el software de programación R. Siga las instrucciones y el código enumerados en el archivo de codificación suplementario para continuar a través de la canalización DADA2 y limpiar los datos de secuenciación de ADN¹⁶. Descargue la base de datos de referencia SILVA para la asignación de taxonomía después de que las secuencias se hayan pasado a través de la tubería¹⁷.
3. Brevemente, cargue el paquete DADA2 en R. Defina una ruta en la que todos los archivos .fastq se guarden en el mismo directorio y extraiga los archivos en R.
4. Lea los nombres de los archivos fastq y haga coincidir las listas de archivos fastq hacia adelante y hacia atrás.
5. Inspeccione la calidad de las lecturas directas e inversas.
   NOTA: Las secuencias de nucleótidos se pueden truncar para mantener secuencias de alta calidad.
6. Filtra y recorta los archivos fastq. Use el método learnErrors para aprender el modelo de error paramétrico que usa DADA2. Esto mostrará las tasas de error observadas y esperadas para cada posible sustitución de nucleótidos (A → C, A → T, A → G, etc.).
7. Aplique el algoritmo de inferencia de muestra para determinar el número de secuencias únicas en cada muestra e inspeccione más a fondo el objeto de clase dada para llegar al número de variantes únicas verdaderas por muestra.
8. Combine las lecturas hacia adelante y hacia atrás para obtener secuencias completas y sin ruido.
9. Construya una tabla de variantes de secuencia de amplicones (ASV).
10. Eliminar las quimeras de la tabla del ASV. Las secuencias quiméricas son una sola secuencia resultante de dos secuencias madre más abundantes.
11. Realice un seguimiento del número total de lecturas que han pasado por la canalización. DADA2 usará SILVA para asignar taxonomía a cada secuencia única. La precisión se puede analizar incluyendo una comunidad de secuencias de bacterias conocidas en la tubería de DADA2 y comparando las variantes de la secuencia de DADA2 con la composición esperada de la comunidad.
    NOTA: Los datos de secuenciación de ADN ahora están limpios y listos para el análisis en función del alcance y los objetivos específicos del proyecto de investigación.

Resultados

Diferencias poblacionales entre el microbioma mucoso y luminal del intestino proximal
Estudios previos han encontrado diferencias en las poblaciones microbianas de muestras de colon luminal y mucosa ^4,5,18. Los resultados preliminares muestran que las muestras de aspirado y biopsia duodenal pueden medir tanto la microbiota luminal como la mucosa en el intestino proximal. Adem...

Discusión

Los estudios del microbioma son increíblemente importantes, ya que este complejo ecosistema tiene un papel fundamental en la homeostasis de la energía, las respuestas inmunológicas y el metabolismo^. Existen diferencias regionales en el microbioma que pueden reflejar las distintas funciones fisiológicas de varias regiones del tracto gastrointestinal, lo que puede afectar a diferentes estados de enfermedad²⁰. El microbioma fecal es el má...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity