Probenentnahme und Analyse des Zwölffingerdarm-Mikrobioms

Zusammenfassung

In diesem Manuskript diskutieren wir eine neuartige Methode zur Probenahme und Analyse des Zwölffingerdarm-Mikrobioms. Diese Methode liefert eine genaue Abbildung der mikrobiellen Diversität und Zusammensetzung im Zwölffingerdarm und könnte für weitere Untersuchungen des zwölffingerdarmen Mikrobioms nützlich sein.

Zusammenfassung

Verschiebungen im Mikrobiom wurden mit der Physiologie und Pathophysiologie vieler Organsysteme sowohl beim Menschen als auch bei Mausmodellen korreliert. Das Darmmikrobiom wird in der Regel durch die Entnahme von Stuhlproben untersucht. Die Leichtigkeit, Stuhlproben zu entnehmen, hat zu vielen Studien geführt, die Informationen über den distalen luminalen Gastrointestinaltrakt enthüllt haben. Allerdings haben sich nur wenige Studien mit der Bedeutung des Mikrobioms im proximalen Darm befasst. Angesichts der Tatsache, dass der Zwölffingerdarm ein wichtiger Ort für die Verdauung und Resorption ist, ist sein Mikrobiom für die Ernährung und Lebererkrankungen relevant und rechtfertigt weitere Untersuchungen. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode zur Probenahme des proximalen luminalen und mukosalen Darmmikrobioms bei menschlichen Probanden, die sich einer oberen Endoskopie unterziehen, durch Entnahme von Duodenalaspirat und Biopsien. Die Probenbeschaffung ist einfach und wird nicht durch Artefakte wie die Einhaltung der Präparation durch den Patienten beeinflusst, wie dies bei der Entnahme von Dickdarmproben während der Koloskopie der Fall sein kann. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass sich das luminale und das mukossale Mikrobiom signifikant unterscheiden, was wahrscheinlich mit den Umweltbedingungen und Barrierefunktionen zusammenhängt. Eine Kombination aus Zwölffingerdarmaspirat und Biopsien ergibt daher ein umfassenderes Bild des Mikrobioms im Zwölffingerdarm. Die Biopsien werden aus den absteigenden und horizontalen Segmenten des Zwölffingerdarms gewonnen, die anatomisch nahe an der Leber und dem Gallenbaum liegen. Dies ist wichtig, um die Rolle der Gallensäurebiologie und der Darm-Leber-Achse bei Lebererkrankungen zu untersuchen. Biopsien und Aspirat können für die ribosomale 16S-RNA-Sequenzierung, Metabolomik und andere ähnliche Anwendungen verwendet werden.

Einleitung

Das Darmmikrobiom ist in den letzten Jahren zu einem Bereich geworden, der zunehmend von Interesse ist. Es ist heute bekannt, dass sich die vielfältige Bakterienpopulation im Darm aufgrund einer Vielzahl von Faktoren unterscheiden kann, darunter Genetik, Ernährung, Medikamente und Umwelteinflüsse¹. Studien haben auch einzigartige mikrobielle Profile identifiziert, die mit verschiedenen Magen-Darm-Erkrankungen wie Fettleibigkeit, entzündlichen Darmerkrankungen und Lebererkrankungen verbunden sind ^2,3. Die Mehrzahl der Studien konzentriert sich auf die Profilierung des Mikrobioms des Dickdarms durch die Analyse von Stuhl- und distalen Schleimhautproben⁴. Obwohl sich die höchste Konzentration an Darmbakterien im Dickdarm befindet (10¹² Bakterien/Gramm), gibt es dennoch eine komplexe Gemeinschaft von Mikroben, die sich im Zwölffingerdarm (10³/g), im Jejunum (10⁴/g) und im Ileum (10⁷/g) befinden und eine Schlüsselrolle im Verdauungsstoffwechsel und in der Absorption spielen⁵.

Der Dünndarm dient als primärer Ort für den Nährstoffabbau und die Nährstoffaufnahme im Magen-Darm-Trakt. Kommensale Bakterien, die den Dünndarm auskleiden, spielen eine grundlegende Rolle bei der Unterstützung des chemischen Abbaus von Nahrungssubstraten und bei der Freisetzung bioaktiver Verbindungen, die die Nährstoffaufnahme unterstützen⁶. Diese Wechselwirkungen tragen zu einer komplexen Umgebung von Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Aktivität im Dünndarm bei⁷. Eine Studie, in der die Dünndarmmikrobiota in Mausmodellen beobachtet wurde, ergab, dass keimfreie Mäuse, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden, eine beeinträchtigte Lipidabsorption aufwiesen, aber, wenn sie mit jejunalen Mikrobiota besiedelt waren, einen direkten Anstieg der Lipidabsorption aufwiesen⁶. Eine Pilotstudie am Menschen, in der die zwölffingerdarme Mikrobiota adipöser und gesunder Personen profiliert wurde, ergab, dass die zwölffingerdarme Mikrobiota adipöser Personen Veränderungen der Fettsäure- und Saccharoseabbauwege aufwies, die wahrscheinlich in einer ernährungsabhängigen Beziehung induziert wurden⁸. Darüber hinaus wurde eine Dysbiose in der Dünndarmmikrobiota bei mehreren Krankheiten festgestellt, darunter bakterielle Überwucherung des Dünndarms, Kurzdarmsyndrom, Pouchitis, umweltbedingte enterische Dysfunktion und Reizdarmsyndrom⁷.

Wir interessieren uns für den Zusammenhang zwischen dem Mikrobiom und verschiedenen Stadien chronischer Lebererkrankungen. Insbesondere dient der Zwölffingerdarm als erste Stelle des chemischen Abbaus und der Nahrungsaufnahme im Dünndarm. Darüber hinaus bringt der portale Leberkreislauf Nährstoffe und Metaboliten in die Leber, wo sie verarbeitet und in den Blutkreislauf reguliert werden. Die anatomische Nähe zwischen Darm und Leber schafft ein Milieu, das anfällig für entzündungsfördernde Reaktionen ist, die durch ein Versagen der Darmbarriere oder Veränderungen des Darmmikrobioms entstehen können⁹. Studien, die das Mikrobiom und das Fortschreiten der Lebererkrankung untersuchen, haben eine mikrobielle Dysbiose bei Patienten mit nichtalkoholischer Fettlebererkrankung (NAFLD), Steatohepatitis (NASH), alkoholischer Lebererkrankung und Leberzirrhose festgestellt^10,11. Während die Mehrzahl der Studien das Mikrobiom des Dickdarms charakterisiert, waren wir daran interessiert, das Mikrobiom des Dünndarms in Bezug auf Lebererkrankungen zu untersuchen. Mit der hier vorgestellten neuartigen Methode haben wir einzigartige duodenale mikrobielle Profile bei Patienten mit Leberzirrhose in Bezug auf die Diät¹² identifiziert.

Da die Charakterisierung des Dünndarmmikrobioms immer mehr an Interesse gewinnt, ist es notwendig, einheitliche Techniken zur Gewinnung von Proben zu entwickeln, die die Mikrobiota des Dünndarms genau repräsentieren. Es gibt jedoch Herausforderungen im Zusammenhang mit der Probenbeschaffung, die die Untersuchung der Umgebung des Dünndarmmikrobioms erschwert haben. Derzeitige Probenahmemethoden erfordern invasive Verfahren, die häufig einer Kontamination ausgesetzt sind, wie von Kastl et al.⁷ beschrieben. Im Folgenden stellen wir eine neuartige Methode zur Gewinnung von Zwölffingerdarmaspirat und Biopsien für die mikrobielle Analyse von Patienten mit Lebererkrankungen vor, die sich einer Ösophagogastroduodenoskopie unterziehen.

Protokoll

Zwölffingerdarmproben wurden im Veteran Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, im Cedars-Sinai Medical Center und im Ronald Reagan UCLA Medical Center entnommen, nachdem das klinische Protokoll für die Studie Microbiome, Microbial Markers and Liver Disease (M3LD) vom institutionellen Prüfungsausschuss des lokalen Ethikprüfungsausschusses akzeptiert worden war. Von allen teilnehmenden Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

1. Einwilligung der Teilnehmer

1. Wenden Sie sich an Probanden mit der Diagnose Leberzirrhose beliebiger Ätiologie mit Endoskopien, die für ein Varizenscreening oder portale Hypertonie zur Rekrutierung geplant sind. Patienten mit hepatozellulärem Karzinom (HCC) ausschließen.
2. Stellen Sie die Studie vor, stellen Sie sorgfältig sicher, dass die Teilnehmer sie verstehen, und fragen Sie den Teilnehmer, ob er sich freiwillig an der Studie beteiligen möchte. Füllen Sie eine Einwilligungserklärung aus, wenn sie damit einverstanden sind.
3. Stellen Sie sicher, dass eine ordnungsgemäß ausgebildete und akkreditierte medizinische Fachkraft die Endoskopie durchführt.

2. Entnahme von Proben

1. Betäuben Sie den Patienten mit 50 mg Fentanyl und 2 mg Midazolam. Erhöhen Sie die Dosierung nach Bedarf, bis der Patient mäßig anästhesiert ist und das Endoskop vertragen kann.
2. Führen Sie ein Endoskop (z. B. Pentax EG29-i10) in die Speiseröhre des Patienten ein und bewegen Sie sich in Richtung Pylorus.
   HINWEIS: Die Größe des Endoskops hängt von der Physiologie des Patienten ab. Verwenden Sie das Endoskop nicht für eine Aspiration vor der Probenentnahme, um eine Kontamination des Endoskopkanals mit Magen- oder Oropharynxsekreten zu vermeiden.
3. Besorgen Sie sich einen Objektträger und eine stumpfe 18-Gauge-Spritzennadel, um sich auf die Probenentnahme vorzubereiten. Bereiten Sie ein steriles Pad vor, das zum Übertragen von Biopsien vom Objektträger auf Kryoröhrchen verwendet wird.
4. Wenn das Endoskop am zweiten Teil des Zwölffingerdarms distal der Vater-Ampulle ankommt, aspirieren Sie die vorhandene Flüssigkeit durch einen sterilen Einweg-Aspirationskatheter, der durch den Arbeitskanal des oberen Endoskops geführt wird, und sammeln Sie sie in einem 40-ml-Einweg-Probenbehälter. Spülen Sie bis zu 30 mL zusätzliches steriles Wasser mit einer Spritze in den Zwölffingerdarm und saugen Sie die Flüssigkeit in eine Flüssigkeitsprobenfalle ab, um insgesamt 15 mL zu sammeln.
5. Entfernen Sie sofort den Aspiratbehälter, der an der Saugkomponente des Katheters befestigt ist, und verschließen Sie ihn. Legen Sie den Behälter in eine Thermoskanne über Eis und in einen Probentransportbeutel für den Transfer zum Aufbereitungslabor.
6. Führen Sie eine 2,8-mm-Einweg-Biopsiezange in den Anschluss an der Seite des Endoskops ein, um Gewebeproben für die Forschung zu entnehmen. Führen Sie 2 zufällige Durchgänge der Pinzette im zweiten Teil des Zwölffingerdarms durch und sammeln Sie in jedem Durchgang zwei Bissen Gewebe.
7. Verwenden Sie eine stumpfe 18-Gauge-Spritzennadel, um Gewebeproben aus der Pinzette auf den Objektträger zu entnehmen, bevor Sie die Proben in vier separate leere 2-ml-Kryoröhrchen übertragen. Schrauben Sie die Kappen fest auf.
8. Setzen Sie alle 4 fest verschlossenen Kryoröhrchen in einen leeren Behälter, z. B. einen Urinbecher, ein und erstellen Sie ein Bad, bestehend aus 20 mL Ethanol und Trockeneis, um die Biopsien schockfrosten.
9. Legen Sie die Biopsie-Kryoröhrchen in einen isolierten Styroporbehälter auf ein Bett aus Trockeneis und überführen Sie die Proben zur Langzeitlagerung in einen -80 °C-Gefrierschrank, um die Proben zu konservieren.

3. Aspirat-Verarbeitung

1. Übertragen Sie die Bioproben nach der Entnahme sofort zur Verarbeitung an ein BSL2- oder höheres Labor.
2. Drehen Sie den Behälter mit der Aspiratflüssigkeit viermal vorsichtig um und aliquotieren Sie dann etwa 1,5 ml der Flüssigkeit in 2-ml-Kryoröhrchen.
3. Lagern Sie die Proben bei -80 °C, bis eine Chargenanalyse durchgeführt werden kann.

4. Fragebogenverwaltung und Erhebung klinischer Daten

1. Bitten Sie die Teilnehmer, Fragebögen auszufüllen, um Informationen über Ernährung, Demografie, Rauch-/Alkoholgewohnheiten, Erkrankungen/Medikamente und Lebensqualität zu erhalten¹³.
2. Überprüfen Sie medizinische Diagramme, um klinische Daten zu erfassen, einschließlich klinischer Labore, Bildgebungsdaten, Medikamente und medizinischer Komplikationen.

5. DNA-Extraktion

1. Führen Sie die DNA-Extraktion sofort nach der Entnahme der Zwölffingerdarmbiopsien durch und aspirieren Sie bei -80 °C aus der Lagerung. Für die Extraktion von DNA aus Zwölffingerdarmbiopsieproben sind keine vorbereitenden Schritte erforderlich.
2. Führen Sie die DNA-Extraktion und -Sequenzierung für alle Proben am selben Tag durch, um das Risiko eines Batch-Effekts bei der Analyse zu verringern. Richten Sie eine Bibliothek speziell für die gesammelten Proben ein, bevor die Proben sequenziert werden können.
3. Verwenden Sie ein DNA-Microprep-Kit, um DNA aus Zwölffingerdarmbiopsieproben gemäß dem Protokoll des Herstellers^{zu extrahieren 14}.
4. Geben Sie die maximale Probenmenge gemäß den Protokollrichtlinien in ein Lyseröhrchen mit 750 μl Lyselösung und einem Trockenvolumen von 0,7 mL aus 2 mm Glasperlen.
5. Befestigen Sie die Lyseröhrchen in einem Rührbesen mit einem Röhrchenhalter und lassen Sie den Schlägel mindestens fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit laufen. Die Zeit variiert je nach Rührwerk und der zu analysierenden Probe.
6. Zentrifugieren Sie die Lyseröhrchen in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 x g für 1 min.
7. Bis zu 400 μl Überstand durch ein gefiltertes Sammelröhrchen geben und erneut bei 8000 x g für 1 min zentrifugieren.
8. 1200 μl Bindungspuffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zum Filtrat geben und gründlich mischen, bis eine homogene Masse entsteht.
9. 800 μl der Mischung werden in eine Spin-Säule und eine Röhrchenbaugruppe überführt. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss.
10. Stellen Sie die Spin-Säule auf ein neues Zentrifugenröhrchen mit 400 μl DNA-Waschpuffer und mischen Sie sie gründlich, bis sie homogen ist. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss.
11. Wiederholen Sie Schritt 5.10 zweimal, mit 700 μl und dann 200 μl DNA-Waschpuffer pro Waschgang.
12. Geben Sie 20 μl Elutionspuffer in ein neues Zentrifugenröhrchen in die Spin-Säule. Eine Minute lang inkubieren, dann 1 Minute lang bei 10.000 x g zentrifugieren, um die DNA zu eluieren. Verwerfen Sie die Spalte.
13. Filtern Sie die DNA erneut. Die DNA ist nun bereit für die PCR-Amplifikation.

6. DNA-Amplifikation

1. Durchführung einer PCR-Amplifikation der V4-Region des ribosomalen 16S-RNA-Gens durch 250 × 2-Paired-End-Sequenzierung auf aMiSeq-, HiSeq- oder NovaSeq-Sequenzer¹⁵.
2. Erstellen Sie eine 96-Well-Platten-Grundierungsplatte. Erstellen Sie einen Mastermix aus 165 μl ILHS_515f konservierten Forward-Primer (100 mM Stamm) und 2970 μl molekularbiologischem Wasser. Geben Sie 28,5 μl dieser Mischung in jede Vertiefung.
3. Fügen Sie 1,5 μl des entsprechenden Reverse-Primers aus der 96-Well-Platte mit barcodierten IL_806r einzigartigen Primern (100 μM Material) hinzu. Diese Barcodes identifizieren eindeutige Patientenproben.
4. Erstellen Sie einen Mastermix aus Wasser (23,1 μl x 3,3 x Anzahl der Proben), PCR-Puffer (3 μl x 3,3 x Anzahl der Proben), dNTPs (0,6 μl x 3,3 x Anzahl der Proben) und JumpStart Taq DNA-Polymerase (0,3 μl x 3,3 x Anzahl der Proben).
   HINWEIS: Die 16S-DNA-Amplifikation sollte in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden.
5. Geben Sie 81 μl Mastermix in jede Vertiefung der ersten 96-Well-Platte. Geben Sie 6 μl DNA und 3 ml Primermischung in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine P200-Mehrkanalpipette, um die Wells zu mischen, und pipettieren Sie dann 30 μl in die entsprechende Vertiefung jeder der beiden anderen PCR-Platten. Verschließen Sie die Platte.
6. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen des Thermocyclers: 94 °C x 3 min; 35 Zyklen: 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 min, 72 °C x 1,5 min. Nach 35 Zyklen: 72 °C x 10 min, 94 °C x 5 min, 4 °C auf unbestimmte Zeit.

7. Bereinigung und Einrichtung der Bibliothek

1. Verwenden Sie ein PCR- oder DNA-Cleanup-Kit, um die PCR-Produkte zu reinigen. Eluieren Sie die DNA mit 30 μl (DEPC-behandeltem) Wasser in PCR-Qualität.
2. Verwenden Sie ein Spektralphotometer mit UV-sichtbarem Spektrum, das in der Lage ist, PCR-Proben zu quantifizieren.
3. Öffnen Sie die Spektralphotometer-Software auf dem Desktop-Computer. Klicken Sie auf Nukleinsäure.
4. Wischen Sie den Port mit destilliertem Wasser ab. 1 μl 1x PCR-Puffer/Wasser in den Port geben und kalibrieren.
5. Geben Sie die Proben-ID ein und pipettieren Sie 1 μl Probe auf den Anschluss.
6. Schließen Sie den Port und drücken Sie Messen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen, wenn Sie Proben auf den Anschluss geben.
7. Wischen Sie die Probe mit Labortüchern und destilliertem Wasser ab und bereiten Sie dann die nächste Probe vor. Zeichnen Sie die Werte mit jeder Stichprobe auf. Der Computer sollte auch automatisch speichern.
8. Kombinieren Sie 250 ng jedes amplifizierten PCR-Produkts in 1 Röhrchen. Dies ist die DNA-Bibliothek.
9. Liefern Sie die Bibliothek zusammen mit den Lesevorgängen 1 und 2 sowie den Indexsequenzierungsprimern zur Sequenzierung an ein Sequenzierlabor.
   HINWEIS: Wenn kein lokales Labor verfügbar ist, kann für diesen Schritt ein kommerzielles Sequenzierungslabor verwendet werden.

8. Formatierung der Daten

1. Das Sequenzieren von Daten liefert Ergebnisse in Vorwärts- und Rückwärts-.fastq-Dateien. Konvertieren Sie diese Daten in ein Datenblatt und bereinigen Sie sie, damit die Informationen für nachgelagerte Anwendungen analysiert werden können.
2. Öffnen Sie die Programmiersoftware R. Befolgen Sie die Anweisungen und den Code in der ergänzenden Codierungsdatei, um die DADA2-Pipeline zu durchlaufen und die DNA-Sequenzierungsdaten¹⁶ zu bereinigen. Laden Sie die SILVA-Referenzdatenbank für die Taxonomiezuweisung herunter, nachdem die Sequenzen die Pipeline^{durchlaufen haben 17}.
3. Laden Sie kurz das DADA2-Paket in R. Definieren Sie einen Pfad, in dem alle .fastq-Dateien im selben Verzeichnis gespeichert werden, und extrahieren Sie die Dateien in R.
4. Lesen Sie die Namen der Fastq-Dateien und gleichen Sie die Listen der Vorwärts- und Rückwärts-Fastq-Dateien ab.
5. Überprüfen Sie die Qualität der Forward Reads und Reverse Reads.
   HINWEIS: Nukleotidsequenzen können abgeschnitten werden, um qualitativ hochwertige Sequenzen zu erhalten.
6. Filtern und trimmen Sie die fastq-Dateien. Verwenden Sie die learnErrors-Methode, um das parametrische Fehlermodell zu lernen, das DADA2 verwendet. Darin werden die beobachteten und erwarteten Fehlerraten für jede mögliche Nukleotidsubstitution (A → C, A → T, A → G usw.) angezeigt.
7. Wenden Sie den Stichprobenrückschlussalgorithmus an, um die Anzahl der eindeutigen Sequenzen in jeder Stichprobe zu bestimmen, und untersuchen Sie das Objekt der dada-Klasse weiter, um die Anzahl der echten eindeutigen Varianten pro Stichprobe zu ermitteln.
8. Führen Sie die Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge zusammen, um vollständige und entrauschte Sequenzen zu erhalten.
9. Erstellen Sie eine ASV-Tabelle (Amplicon Sequence Variant).
10. Entfernen Sie Chimären aus der ASV-Tabelle. Chimäre Sequenzen sind eine einzelne Sequenz, die aus zwei häufigeren Elternsequenzen resultiert.
11. Verfolgen Sie die Gesamtzahl der Lesevorgänge, die die Pipeline durchlaufen haben. DADA2 verwendet SILVA, um jeder eindeutigen Sequenz eine Taxonomie zuzuweisen. Die Genauigkeit kann analysiert werden, indem eine Gemeinschaft bekannter Bakteriensequenzen in die DADA2-Pipeline aufgenommen und DADA2-Sequenzvarianten mit der erwarteten Zusammensetzung der Gemeinschaft verglichen werden.
    HINWEIS: Die DNA-Sequenzierungsdaten sind nun bereinigt und bereit für die Analyse auf der Grundlage des spezifischen Umfangs und der Ziele des Forschungsprojekts.

Ergebnisse

Populationsunterschiede zwischen mukosalem und luminalem Mikrobiom des proximalen Darms
Frühere Studien haben Unterschiede in den mikrobiellen Populationen von luminalen und mukosalen Dickdarmproben festgestellt ^4,5,18. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass Duodenalaspirat- und Biopsieproben sowohl die luminale als auch die mukosale Mikrobiota im proximalen Darm messen k?...

Diskussion

Studien des Mikrobioms sind unglaublich wichtig, da dieses komplexe Ökosystem eine entscheidende Rolle bei der Energiehomöostase, den immunologischen Reaktionen und dem Stoffwechsel spielt¹⁹. Es gibt regionale Unterschiede im Mikrobiom, die die unterschiedlichen physiologischen Funktionen verschiedener Regionen des Magen-Darm-Trakts widerspiegeln können, was sich auf unterschiedliche Krankheitszustände auswirken kann²⁰. Das fäkale Mikr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity