十二指肠微生物组的标本采集和分析

摘要

在这份手稿中，我们讨论了一种对十二指肠微生物组进行采样和分析的新方法。该方法准确描述了十二指肠中的微生物多样性和组成，可用于进一步研究十二指肠微生物组。

摘要

微生物组的变化与人类和小鼠模型中许多器官系统的生理学和病理生理学相关。肠道微生物组通常通过粪便标本采集进行研究。获得粪便样本的便利性导致许多研究揭示了有关远端管腔胃肠道的信息。然而，很少有研究提到微生物组在近端肠道中的重要性。鉴于十二指肠是消化和吸收的主要部位，其微生物组与营养和肝脏疾病有关，值得进一步研究。在这里，我们详细介绍了一种通过获得十二指肠抽吸物和活检对接受上消化道内窥镜检查的人类受试者的近端管腔和粘膜肠道微生物组进行采样的新方法。标本获取很容易，不受患者准备依从性等伪影的影响，就像在结肠镜检查期间获取结肠样本一样。初步结果表明，管腔和粘膜微生物组差异显著，这可能与环境条件和屏障功能有关。因此，十二指肠抽吸物和活检相结合可以更全面地了解十二指肠中的微生物组。活检从十二指肠的降段和水平段获得，这些段在解剖学上靠近肝脏和胆道树。这对于研究胆汁酸生物学和肠-肝轴在肝病中的作用非常重要。活检和抽吸可用于 16S 核糖体 RNA 测序、代谢组学和其他类似应用。

引言

近年来，肠道微生物组已成为人们越来越感兴趣的领域。现在了解到，肠道中不同的细菌种群可能因多种因素而异，包括遗传、饮食、药物和环境影响¹。研究还确定了与不同胃肠道疾病（如肥胖、炎症性肠病和肝病）相关的独特微生物特征 ^2,3。大多数研究侧重于通过分析粪便和远端粘膜样本来分析大肠的微生物组⁴。尽管肠道细菌的最高浓度存在于结肠中（10¹² 个细菌/克），但仍然存在一个复杂的微生物群落居住在十二指肠 （10³/g）、空肠 （10⁴/g） 和回肠 （10⁷/g），在消化代谢和吸收中起关键作用⁵。

小肠是胃肠道营养分解和吸收的主要部位。小肠内壁的共生菌在帮助食物底物的化学分解和释放有助于营养吸收的生物活性化合物方面发挥着重要作用⁶。这些相互作用导致小肠中微生物-微生物和宿主-微生物活性的复杂环境⁷。一项在小鼠模型中观察小肠微生物群的研究发现，喂食高脂肪饮食的无菌小鼠脂质吸收受损，但当空肠微生物群定植时，脂质吸收直接增加⁶。一项分析肥胖和健康个体十二指肠微生物群的人类试点研究发现，肥胖个体的十二指肠微生物群在脂肪酸和蔗糖分解途径中发生改变，可能是在饮食依赖性关系中诱导的⁸。此外，在多种疾病中已发现小肠微生物群失调，包括小肠细菌过度生长、短肠综合征、贮袋炎、环境肠道功能障碍和肠易激综合征⁷。

我们对微生物组与慢性肝病不同阶段之间的关系感兴趣。具体来说，十二指肠是小肠中化学分解和营养吸收的第一个部位。此外，门静脉肝循环将营养物质和代谢物带到肝脏，在那里它们被加工和调节到血液中。肠道和肝脏之间的解剖学接近创造了一个容易受到促炎反应的环境，这些反应可能是由于肠道屏障失效或肠道微生物组的改变而引起的⁹。调查微生物组和肝病进展的研究发现，非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD）、脂肪性肝炎 （NASH）、酒精性肝病和肝硬化患者存在微生物菌群失调^10,11。虽然大多数研究都描述了结肠微生物组的特征，但我们对研究与肝病相关的小肠微生物组感兴趣。通过利用此处介绍的新方法，我们在与饮食相关的肝硬化患者中确定了独特的十二指肠微生物特征¹²。

随着小肠微生物组的表征继续成为人们越来越感兴趣的领域，有必要开发统一的技术来获得准确代表小肠微生物群的样品。然而，与标本获取相关的挑战使小肠微生物组环境的研究变得复杂。目前的采样方法需要侵入性程序，这些程序通常会受到污染，如 Kastl 等人⁷ 所述。在这里，我们详细介绍了一种从接受食管胃十二指肠镜检查的肝病患者获取十二指肠抽吸物和活检以进行微生物分析的新方法。

研究方案

在微生物组、微生物标志物和肝病 （M3LD） 研究的临床方案被当地伦理审查委员会的机构审查委员会接受后，在退伍军人事务大洛杉矶医疗保健系统、Cedars-Sinai 医疗中心和罗纳德·里根加州大学洛杉矶分校医学中心获得了十二指肠样本。获得所有参与患者的书面知情同意书。

1. 参与者的同意

1. 接近诊断为任何病因的肝硬化的受试者，并计划进行内窥镜检查进行静脉曲张筛查或门静脉高压症进行招募。排除肝细胞癌 （HCC） 患者。
2. 介绍研究，仔细确保参与者理解，并询问参与者是否愿意自愿参加研究。如果他们同意，请填写知情同意书。
3. 确保由经过适当培训且有资质的医疗专业人员进行内窥镜检查。

2. 标本采集

1. 用 50 毫克芬太尼和 2 毫克咪达唑仑麻醉患者。根据需要增加剂量，直到患者中度麻醉并且可以耐受内窥镜。
2. 将内窥镜（例如宾得 EG29-i10）插入患者的食管并朝着幽门前进。
   注意： 内窥镜尺寸将根据患者的生理机能而有所不同。在样本采集前，请勿使用内窥镜进行任何抽吸，以免胃或口咽分泌物污染内窥镜通道。
3. 获取显微镜载玻片和钝 18 号注射器针头，为标本采购做准备。准备一个无菌垫，用于将活检从显微镜载玻片转移到冷冻管中。
4. 当内窥镜到达 Vater 壶腹远端十二指肠的第二部分时，通过通过上内窥镜工作通道的无菌一次性抽吸导管吸出存在的任何液体，并将其收集到 40 mL 一次性标本容器中。通过注射器将最多 30 mL 的额外无菌水冲洗到十二指肠中，然后将液体吸入液体标本收集阱中，以收集总共 15 mL。
5. 立即取下并盖上连接到导管抽吸部件的抽吸容器。将容器放入冰上的保温瓶中，然后放入样本运输袋中，以转移到冲洗实验室。
6. 将 2.8 毫米一次性活检钳插入内窥镜侧面的端口，取出组织标本进行研究。在十二指肠的第二部分内随机使用镊子进行 2 次通过，每次通过收集两口组织。
7. 使用钝的 18 号注射器针头从镊子中取出组织样品并放到显微镜载玻片上，然后将样品转移到四个单独的空 2 mL 冻存管中。拧紧瓶盖。
8. 将所有 4 个密封盖的冷冻管插入空容器（例如尿杯）中，并制作一个由 20 mL 乙醇和干冰组成的浴，以快速冷冻活检。
9. 将活检冷冻管放在干冰床上的绝缘聚苯乙烯泡沫塑料容器中，然后将标本转移到 -80 °C 冰箱中长期储存以保存标本。

3. 吸液 处理

1. 生物样本采集后，立即将生物样本转移到 BSL2 或更高级别的实验室进行处理。
2. 轻轻倒置吸液容器四次，然后将大约 1.5 mL 液体分装到 2 mL 冻存管中。
3. 将标本储存在 -80 °C，直到可以进行批量分析。

4. 问卷管理和临床数据收集

1. 要求参与者完成问卷调查，以获取有关饮食、人口统计、吸烟/饮酒习惯、医疗状况/药物和生活质量的信息¹³.
2. 查看医疗图表以捕获临床数据，包括临床实验室、成像数据、药物和医疗并发症。

5. DNA 提取

1. 取出十二指肠活检后立即进行 DNA 提取，并在 -80 °C 下从储存中吸出。 从十二指肠活检标本中提取 DNA 不需要准备步骤。
2. 在同一天对所有样品进行 DNA 提取和测序，以降低分析中出现批次效应的风险。在对样品进行测序之前，设置特定于收集的样本的文库。
3. 根据制造商的方案¹⁴，使用 DNA 显微制备试剂盒从十二指肠活检标本中提取 DNA。
4. 根据方案指南，将最大量样品添加到含有 750 μL 裂解液和 0.7 mL 干体积的 2 mm 玻璃珠的裂解管中。
5. 将裂解管固定在带有试管架的微珠打浆器中，并以最大速度运行打浆器至少 5 分钟。时间将根据微珠打浆机和被分析的样品而有所不同。
6. 将裂解管在微量离心机中以 10,000 x g 离心 1 分钟。
7. 通过过滤的收集管转移多达 400 μL 的上清液，然后再次以 8000 x g 离心 1 分钟。
8. 在微量离心管中的滤液中加入 1200 μL 结合缓冲液，并充分混合直至均匀。
9. 将 800 μL 混合物转移至离心柱和试管组件中。以 10,000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
10. 将离心柱放在装有 400 μL DNA 洗涤缓冲液的新离心管上，并充分混合直至均匀。以 10,000 x g 离心 1 分钟。丢弃流出物。
11. 重复步骤 5.10 两次，每次洗涤加入 700 μL，然后加入 200 μL DNA 洗涤缓冲液。
12. 将 20 μL 洗脱缓冲液添加到新离心管中的离心柱中。孵育 1 分钟，然后以 10,000 x g 离心 1 分钟以洗脱 DNA。丢弃该列。
13. 再次过滤 DNA。DNA 现在可用于 PCR 扩增。

6. DNA 扩增

1. 在 aMiSeq、HiSeq 或 NovaSeq 测序仪¹⁵ 上，通过 250 × 2 双端测序，对 16S 核糖体 RNA 基因的 V4 区进行 PCR 扩增。
2. 创建 96 孔板引物板。制备 165 μL ILHS_515f 保守正向引物（100 mM 储备液）和 2970 μL 分子生物学级水的预混液。向每个孔中加入 28.5 μL 此混合物。
3. 从 96 孔板的条形码IL_806r独特引物（100 μM 储备液）中加入 1.5 μL 相应的反向引物。这些条形码将识别独特的患者样本。
4. 制备水（23.1 μL x 3.3 x 样品数量）、PCR 缓冲液（3 μL x 3.3 x 样品数量）、dNTP（0.6 μL x 3.3 x 样品数量）和 JumpStart Taq DNA 聚合酶（0.3 μL x 3.3 x 样品数量）的预混液。
   注：16S DNA 扩增应一式三份进行。
5. 向第一个 96 孔板的每个孔中加入 81 μL 预混液。向每个孔中加入 6 μL DNA 和 3 mL 引物混合物。使用 P200 多通道移液器混合孔，然后将 30 μL 移液到其他两个 PCR 板的相应孔中。密封板。
6. 使用以下热循环仪设置：94 °C x 3 分钟;35 个循环：94 °C x 45 s、50 °C x 1 分钟、72 °C x 1.5 分钟。35 次循环后：72 °C x 10 分钟，94 °C x 5 分钟，4 °C 无限期。

7. 清理和库设置

1. 使用 PCR 或 DNA 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。用 30 μL PCR 级（经 DEPC 处理）水洗脱 DNA。
2. 使用能够定量 PCR 样品的紫外-可见光谱分光光度计。
3. 在计算机桌面上打开分光光度计软件。单击 Nucleic Acid。
4. 用蒸馏水擦拭端口。向端口中加入 1 μL 1x PCR 缓冲液/水并校准。
5. 输入样品 ID 并将 1 μL 样品移液到端口上。
6. 关闭端口并点击 测量.
   注：将样品添加到端口时避免气泡。
7. 用实验室湿巾和蒸馏水擦去样品，然后制备下一个样品。记录每个样本的值。计算机也应自动保存。
8. 将 250 ng 每种扩增的 PCR 产物混合到 1 个试管中。这就是 DNA 文库。
9. 将文库连同读长 1 和 2 以及索引测序引物一起运送到测序实验室进行测序。
   注意：如果当地实验室不可用，则可以使用商业测序实验室进行此步骤。

8. 数据格式

1. 测序数据在正向和反向 .fastq 文件中提供结果。将此数据转换为数据表并进行清理，以便为下游应用分析信息。
2. 打开 R 编程软件。按照补充编码文件中列出的说明和代码继续通过 DADA2 管道并清理 DNA 测序数据¹⁶。在序列通过管道¹⁷ 后，下载用于分类分配的 SILVA 参考数据库。
3. 简而言之，在 R 中加载 DADA2 包。定义一个路径，所有 .fastq 文件都保存在同一目录中，并将文件提取到 R 中。
4. 读取 fastq 文件的名称并匹配正向和反向 fastq 文件的列表。
5. 检查正向读取和反向读取的质量。
   注：核苷酸序列可以截短以保持高质量序列。
6. 过滤和修剪 fastq 文件。使用 learnErrors 方法学习 DADA2 使用的参数误差模型。这将显示每种可能的核苷酸替换（A → C、A → T、A → G 等）的观测和预期错误率。
7. 应用样本推理算法来确定每个样本中唯一序列的数量，并进一步检查 dada 类对象以得出每个样本的真正唯一变体的数量。
8. 合并正向和反向读数以获得完整和去噪序列。
9. 构建扩增子序列变体 （ASV） 表。
10. 从 ASV 表中删除嵌合体。嵌合序列是由两个更丰富的亲本序列产生的单个序列。
11. 跟踪通过管道的读取总数。DADA2 将使用 SILVA 为每个唯一序列分配分类法。可以通过在 DADA2 管道中包括已知细菌序列群落并将 DADA2 序列变体与群落的预期组成进行比较来分析准确性。
    注意：DNA 测序数据现已清理干净，可以根据研究项目的具体范围和目标进行分析。

结果

近端肠道粘膜和管腔微生物组之间的群体差异
以前的研究发现管腔和粘膜结肠标本的微生物种群存在差异 ^4,5,18。初步结果表明，十二指肠抽吸物和活检标本可以测量近端肠道的管腔和粘膜微生物群。此外，我们发现这些微生物组种群彼此不同（图 1）。此外，抽吸物中的胆...

讨论

微生物组的研究非常重要，因为这个复杂的生态系统在能量稳态、免疫反应和新陈代谢中起着关键作用¹⁹。存在区域微生物组差异，这可能反映了胃肠道不同区域的不同生理功能，这可能会影响不同的疾病状态²⁰。粪便微生物组是最常研究的，但最近小肠微生物组也受到了调查 ^6,21。有必要制?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL cryovials	Corning	430659
96-well plates	Applied Biosystems	4306737
dNTPs	Sigma	D7295
Dry ice			Provided by institution
EG29-i10 endoscope	Pentax	N/A	Endoscope size may vary depending on patient physiology
Epoch microplate spectrophotometer	Biotek	N/A
Ethanol	Sigma Aldrich	676829
HiSeq 2500	Illumina	N/A
IL_806r reverse primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
ILHS_515f forward primer	IDT DNA technologies	custom	custom primers
JumpStart Taq DNA	Sigma	D4184
Mucus specimen trap	Busse Hospital Disposables	405	40 cc specimen trap with transport cap
Nanodrop Gen5 software	ThermoFisher Scientific
PCR buffer	Sigma	P2192
PCR cleanup kit	Zymo Research	D4204
Radial Jaw 4 Jumbo Forceps	Boston Scientific	M00513343	2.8mm Jaw OD
Vioscreen dietary questionnaire	VioCare	N/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep Kit	Zymo Research	D4300	25 ug binding capacity