حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos

Summary

تعتمد العديد من خصائص eusociality للحشرات على التواصل داخل المستعمرة وتقسيم العمل. يوفر التلاعب الجيني للجينات التنظيمية الرئيسية في أجنة النمل عن طريق الحقن المجهري والطفرات بوساطة كريسبر نظرة ثاقبة لطبيعة السلوك الإيثاري في الحشرات الاجتماعية.

Abstract

يتم التحكم في السمات الفريدة للحشرات eusocial ، مثل السلوك الاجتماعي والتقسيم التناسلي للعمل ، من خلال نظامها الوراثي. لمعالجة كيفية تنظيم الجينات للسمات الاجتماعية ، قمنا بتطوير النمل الطافر عن طريق توصيل مركب كريسبر إلى أجنة صغيرة خلال مرحلتها المخلوية. هنا ، نقدم بروتوكولا للطفرات بوساطة كريسبر في Harpegnathos saltator ، وهو نوع من النمل ponerine الذي يظهر مرونة مظهرية مذهلة. يتم تربية النمل المملح H. بسهولة في بيئة معملية. يتم جمع الأجنة للحقن المجهري مع بروتينات Cas9 والحمض النووي الريبي الدليلي الصغير المركب في المختبر (sgRNAs) باستخدام إبر الكوارتز محلية الصنع. يتم تربية الأجنة بعد الحقن خارج المستعمرة. بعد ظهور اليرقة الأولى ، يتم نقل جميع الأجنة واليرقات إلى صندوق عش مع عدد قليل من عمال التمريض لمزيد من التطوير. هذا البروتوكول مناسب لإحداث طفرات لتحليل فسيولوجيا الطبقة والسلوك الاجتماعي في النمل ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا على مجموعة أوسع من غشاء البكارة والحشرات الأخرى.

Introduction

أدى تطور eusociality في الحشرات ، أي تلك الموجودة في رتب غشائيات الأجنحة و Blattodea (Isoptera سابقا) ، إلى سمات سلوكية فريدة ومتطورة في كثير من الأحيان تظهر على مستوى الفرد والمستعمرة. غالبا ما يتضمن التقسيم الإنجابي للعمل ، وهي سمة تميز المجموعات الأكثر تقدما من الحشرات الاجتماعية ، أنظمة طبقية تتكون من عدة مجموعات مميزة سلوكيا وغالبا ما تكون مورفولوجيا. يتم التحكم في هذا التنوع السلوكي والمورفولوجي بين الطوائف ليس فقط من خلال نظامها الجيني ، ولكن أيضا في كثير من الأحيان من خلال البيئة¹،²،³،^{4 ،} مما يجعل الحشرات eusocial مواضيع جذابة للبحوث الوراثية واللاجينية.

أثبتت القدرة على التلاعب بالنظام الجيني للحشرات الاجتماعية أنها صعبة لأن العديد من الأنواع لا تتزاوج وتتكاثر في البيئات المختبرية. تحتوي معظم الحشرات الاجتماعية أيضا على عدد قليل جدا من الأفراد التناسلية في مستعمرة ، مما يحد من عدد النسل الذي يمكن إنتاجه وبالتالي يحد من حجم العينة للتلاعب الجيني⁵. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الحشرات eusocial لها أوقات جيل طويلة مقارنة بالحشرات المستخدمة عادة في الدراسات الجينية (مثل ذبابة الفاكهة) ، مما يزيد من صعوبة إنشاء خطوط وراثية⁵. ومع ذلك ، يمكن لبعض الأنواع eusocial أن تولد نسبة كبيرة من الأفراد النشطين تناسليا في مستعمرة ، مما يخفف من التحديات ويوفر فرصا لإنشاء خطوط متحولة أو معدلة وراثيا.

في حالة أنواع النمل ponerine ، Harpegnathos saltator ، يمكن لجميع العاملات أن يصبحن نشطات في الإنجاب عند وفاة الملكة أو العزلة الاجتماعية. يشار إلى هؤلاء العمال باسم "gamergates" ويمكن استخدامهم لإنشاء مستعمرات جديدة⁶. علاوة على ذلك ، قد يكون هناك أكثر من بوابة لاعب واحدة موجودة في مستعمرة ، وبالتالي زيادة إنتاج النسل⁵،^7،8. حتى الآن ، تم تطوير سلالات متحولة و / أو معدلة وراثيا في نحل العسل الأوروبي ، Apis mellifera ، وفي أنواع النمل ، H. saltator ، Ooceraea biroi ، و Solenopsis invicta⁹،10،^11،12،13،^14،15 . مهدت التحليلات الجينية في النحل والنمل الاجتماعي الطريق نحو فهم أفضل لل eusociality ، وتوفير مجموعة من الفرص لدراسة الجينات وتأثيراتها على سلوك الحشرات eusocial وعلم وظائف الأعضاء الخاصة بالطبقة.

هنا ، نقدم بروتوكولا للتعديل الوراثي عبر نظام CRISPR / Cas9 في H. saltator. على وجه التحديد ، تم استخدام هذه التقنية لتوليد طفرة جرثومية في orco ، الجين الذي يشفر المستقبل المشترك الملزم لجميع مستقبلات الرائحة (ORs)¹⁰. تم توسيع جينات OR بشكل ملحوظ في الحشرات eusocial غشاء البكارة¹⁶ ، ويلعب orco دورا أساسيا في حاسة الشم الحشرية. في حالة عدم وجودها ، لا تتجمع غرف العمليات أو تعمل بشكل طبيعي. وبالتالي ، فإن طفرات جين orco تعطل الإحساس الشمي والتطور العصبي والسلوكيات الاجتماعية المرتبطة ^9,10.

في هذا البروتوكول ، يتم إدخال بروتينات Cas9 و RNAs الموجهة الصغيرة (sgRNAs) في أجنة النمل باستخدام الحقن المجهري لغرض إحداث طفرات في الجين المستهدف. هنا ، سنصف إجراء الحقن المجهري بالتفصيل جنبا إلى جنب مع التوجيهات المتعلقة برعاية المستعمرات والأجنة المحقونة. هذه الطرق مناسبة لإحداث الطفرات في مجموعة متنوعة من الجينات المختلفة في النمل المملح ويمكن تطبيقها على مجموعة أوسع من حشرات غشاء البكارة.

Protocol

1. الصيانة الدورية لمستعمرات مملح هاربغناثوس

1. الحفاظ على مستعمرات من النوع البري من H. saltator في صناديق بلاستيكية شفافة في غرفة تربية النمل عند 22-25 درجة مئوية وفترة ضوئية من 12 ساعة من الضوء: 12 ساعة مظلمة (12L: 12D) جدول الإضاءة.
   1. استخدم صناديق صغيرة (9.5 × 9.5 سم²) لتربية العمال الفرديين أو المستعمرات الصغيرة. استخدم الصناديق المتوسطة (19 × 13.5 سم 2) أو الصناديق الكبيرة (27 × 19 سم²) لتربية المستعمرات الأكبر (الشكل 1).
   2. لإنشاء صناديق عش ، استخدم الجص لعمل أرضيات للصناديق. عندما يجف الجص الرطب في الوسط والصناديق الكبيرة ، اضغط على كتلة رغوية في الجص بعمق بضعة سنتيمترات وبضعة سنتيمترات من الجزء الخلفي من الصندوق لتعيين منطقة عش أقل. بمجرد أن يجف الجص ، قم بتغطية منطقة العش المعينة بقطعة مربعة من الزجاج.
      ملاحظة: في الصناديق الصغيرة ، ليست هناك حاجة لتعيين منطقة عش أقل. إذا أهمل النمل استخدام منطقة العش السفلية المعينة ، فقد يساعد ذلك في تغطية الزجاج بقطعة مربعة من السيلوفان الأحمر. وهذا يعطي انطباعا بوجود مساحة مظلمة تحت الأرض تشبه الأعشاش التي يستخدمها H. saltator في البرية وقد يشجعها على نقل الحضنة إلى المنطقة المحددة.
2. إطعام المستعمرات مع الصراصير الحية مرتين في الأسبوع.
   ملاحظة: يجب تغذية المستعمرات بما يكفي لاستهلاك جميع الصراصير قبل التغذية التالية. إطعام أي النمل المعزولة ومستعمرات النمل متحولة مع الصراصير قبل لدغة من قبل عمال مستعمرة عادية 2-3 مرات كل أسبوع.
3. ضع الماء بانتظام على أرضيات صندوق عش الجص باستخدام زجاجة غسيل.
   ملاحظة: يجب أن يكون الجص رطبا بدرجة كافية بحيث لا يشعر بالغبار عند لمسه ، ولكن يجب أن يكون جافا بدرجة كافية بحيث يمتص الجص كل الماء المضاف. من المهم ألا تسقى الأعشاش بشكل مفرط. في المتوسط ، ستحتاج صناديق العش إلى إضافة كمية صغيرة من الماء مرة واحدة في الأسبوع.
4. كلما حدثت التغذية ، قم بإزالة القمامة والأفراد القتلى. قم بتجميد جميع النفايات والنمل الميت طوال الليل عند -30 درجة مئوية قبل التخلص من هذه المواد كقمامة عادية.
5. أضف قليلا من نشارة الخشب المجففة إلى المستعمرات بشكل دوري ؛ هذا يساعد اليرقات أثناء خضوعها للتشرنق ويساعد العمال على الحفاظ على نظافة صندوق العش.

2. تحضير إبر الحقن المجهري لزجاج الكوارتز

1. استخدم مجتذب ماصة لسحب إبر الحقن المجهري الزجاجية.
2. حدد الزجاج المراد سحبه. تأكد من أن الزجاج المستخدم قد تم تخزينه في بيئة نظيفة وخالية من الغبار.
   ملاحظة: هنا ، تم استخدام زجاج الكوارتز الخيطي رقيق الجدران بقطر خارجي 1.0 مم ، وقطر داخلي 0.5 مم ، وطول 7.5 سم لإنتاج إبر الحقن المجهري. في حالة حقن جنين رخو الجسم ، قد تكون إبر البورسليكات قابلة للتطبيق أيضا ، لكن إبر البورسليكات غير قادرة على اختراق المشيم الصلب.
3. اضبط إعدادات معلمة المجتذب. استخدم عملية من خطوتين لسحب إبر الحقن المجهري لأجنة H. saltator : تشمل معلمات الخطوة الأولى حرارة 575 ، وخيوط 3 ، وسرعة 35 ، وتأخير 145 ، وسحب 75 ؛ تشمل معلمات الخطوة الثانية حرارة 425 ، خيوط 0 ، سرعة 15 ، تأخير 128 ، وسحب 200. بعد الخطوة الثانية ، تأكد من أن الإبرة الناتجة لها تفتق 2 مم وطرف 0.5 ميكرومتر (الشكل 2).
   ملاحظة: يمكن العثور على هذه المجموعة من المعلمات ، جنبا إلى جنب مع المعلمات لأنواع الإبر الأخرى ، في دليل التشغيل¹⁷. غالبا ما توفر أدلة ساحبات الماصات المعلمات الموصى بها لمجموعة متنوعة من التقنيات. قد تكون هناك حاجة إلى بعض التجربة والخطأ لتحديد المعلمات التي تولد أفضل الإبر لاحتياجات محددة. يعتبر الاستدقاق القصير مثاليا لحقن H. saltator ، حيث يمكنه اختراق المشيمة الصلبة لأجنة H. saltator. في حالة حقن جنين رخو ، مثل الجنين الذي تم نزع تقطيعه (على سبيل المثال ، ذبابة الفاكهة) ، فإن الاستدقاق الأطول حوالي 10 مم قد يؤدي إلى نتائج أفضل. عادة ما توفر أدلة التشغيل لساحبات الماصة معلمات محددة لسحب الإبر المناسبة للاحتياجات المختلفة. من المهم ارتداء القفازات أثناء التعامل مع خيوط الزجاج وسحب الإبر. قد تنتقل الزيوت من الأيدي العارية إلى الزجاج إذا لم يتم ارتداء القفازات.
4. بمجرد تعيين المعلمات ، استخدم مجتذب micropipette لسحب الإبر للحقن المجهري. تأكد من حفظ الإبر في بيئة نظيفة وخالية من الغبار حتى يتم استخدامها.
   ملاحظة: يوصى باستخدام إبر الحقن المجهري المسحوبة حديثا. إذا تم استخدام الإبر المسحوبة مسبقا ، فيجب تخزينها بشكل صحيح في صندوق لمنع تلف أطراف الإبرة والتلوث المحتمل. لا ينصح بالإبر التي خضعت للتخزين طويل الأجل لحقن الأجنة.

3. إعداد حاقن دقيق

1. استخدم حاقن دقيق لحقن المواد المطلوبة في أجنة النمل.
2. تحضير خليط الحقن المجهري لبروتينات Cas9 والحمض النووي الريبي الدليلي الصغير المركب في المختبر (sgRNAs)¹⁰. احتفظ بالمزيج على الثلج حتى يحين وقت تحميل إبرة الحقن المجهري. عندما لا تكون قيد الاستخدام ، قم بتخزين خليط الحقن الدقيق في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: تختلف التركيزات في الأنواع المختلفة. قد يؤدي التركيز العالي إلى ارتفاع معدل الوفيات ، في حين أن التركيز المنخفض قد يقلل من الكفاءة. نستخدم 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من بروتينات Cas9 و 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي المرسال لحقن جنين H. saltator. اتبع تصميم sgRNAs الخاص بنا البروتوكول¹⁸ الذي تم إنشاؤه مسبقا. تم الحصول على تسلسل الجينات من قواعد بيانات الحمض النووي. كما تم الإبلاغ سابقا عن تسلسل جينوم H. saltator ^19,20.
3. اضبط معلمات الحقن لأجنة H. saltator : ضغط حقن 140 هيكتوباسكال (hPa) ، وضغط ثابت يبلغ 70 هيكتوباسكال ، وزمن 0.4 ثانية. اضبط الضغط المستمر بحيث تتدفق المادة في اتجاه واحد فقط. اضبط ضغط الحقن والوقت فقط في حالة عدم تدفق أي مادة من الإبرة إلى الجنين.
   ملاحظة: في حالة حقن نوع مختلف من الأجنة ، فإن المعلمة الأساسية التي قد تتغير هي الضغط الثابت ، وهو المسؤول عن ضمان عدم تدفق السائل من الجنين مرة أخرى إلى الإبرة. لا يتم التحكم في مستوى الصوت في هذا البروتوكول. يعد تحديد معلمات الحاقن الدقيق كافيا للحصول على حقن متسقة.
4. قم بتحميل إبرة الحقن المجهري ب 2 ميكرولتر من الخليط باستخدام أطراف ماصة اللودر الدقيق. افعل ذلك ببطء لضمان عدم تكوين فقاعات في الخليط.
   ملاحظة: إذا تشكلت الفقاعات ، فقد يكون من الصعب الحفاظ على الحقن المجهري المتسق.
5. اكسر طرف الإبرة فقط عن طريق كسر حافة الشريط بحيث لا يزال يتم الحفاظ على تفتق ضيق. تأكد من كسر الإبرة بما يكفي لفتح الطرف ، ولكن ليس كثيرا بحيث يتم قطع الاستدقاق.
   ملاحظة: الأهم من ذلك ، إذا كانت فتحة الإبرة واسعة جدا بعد كسرها ، فسيرى المستخدم السائل ينفد من الإبرة عند تركيبه على الحاقن الدقيق المضغوط قبل تطبيق ضغط الحقن. تنصح بعض بروتوكولات الحقن المجهري بكسر الإبر عن طريق قطع الطرف بالمقص. لا ينصح بهذه الطريقة ، لأن المقص قد يتسبب في تحطيم طرف الإبرة. سيكون حقن الأجنة بإبرة محطمة ضارا للغاية.
6. قم بتركيب الإبرة على المعالج الدقيق

4. حقن الأجنة

1. حدد الأجنة للحقن المجهري من المرحلة المخلوية: الوقت أثناء التطور الذي تنقسم فيه النوى دون التحريك الخلوي.
   ملاحظة: هذا هو الوقت المثالي أثناء التطوير لتحرير الجينوم عن طريق الحقن المجهري ، كما تم اكتشافه سابقا في ذبابة الفاكهة²¹. تمر أجنة H. saltator بالمرحلة المخلوية وتصل إلى الخلوي حوالي 36 ساعة بعد ترسب البويضة¹⁰. يتم تحقيق كفاءة أعلى إذا تم استخدام الأجنة الأصغر سنا للحقن.
2. خط الأجنة على قطعة من الشريط على الوجهين عالقة في شريحة المجهر الزجاجي. تأكد من تثبيت الأجنة جيدا على الشريط لمنع الحركة أثناء الحقن. ضع الأجنة في اتجاه رأسي ، بحيث يكون الجانب الجانبي للجنين على حافة الشريط (الشكل 3). ضع الشريحة والأجنة المبطنة على مرحلة المجهر في محطة عمل الحقن المجهري المخصصة.
   ملاحظة: يوصى بترتيب الأجنة بحيث يمكن إجراء الحقن المتتالية عن طريق تحريك الشريحة على المسرح بدلا من ضبط موضع الإبرة مع كل حقنة. هذا يسمح بإجراء الحقن المتتالية بشكل أكثر كفاءة.
3. قم بمحاذاة الإبرة مع الجنين الأول المراد حقنه باستخدام المعالج الدقيق (الشكل 4أ).
4. ثقب الإبرة بشكل جانبي في الجنين الأول على طول محوره الظهري / البطني تحت المجهر.
5. حقن خليط الحقن المجهري. ابحث عن حركة طفيفة للجنين ، مما يشير إلى زيادة الضغط الداخلي بسبب السائل المحقون. بالإضافة إلى ذلك ، راقب تكوين قطرة صغيرة تحتوي على أثر مرئي للأنسجة و / أو الدهون على الغشاء الخارجي للجنين (الشكل 4ب).
   ملاحظة: يشير وجود أثر للأنسجة و / أو الدهون في القطرة إلى أن الإبرة قد نجحت في ثقب كل من غشاء المشيمية والغشاء الزيتي للجنين. في حالة عدم وجود آثار لهذه المواد ، لم يتم إجراء الحقن بنجاح ويجب تكراره. بعد بضع ثوان ، سيتم إعادة امتصاص القطرة بواسطة الجنين ولن تكون مرئية بعد الآن.
6. قم بإزالة الإبرة برفق من الجنين على الفور ، وانتقل إلى التالي عن طريق ضبط موضع شريحة المجهر. كرر حتى يتم حقن جميع الأجنة.
7. بمجرد حقن جميع الأجنة الموجودة على الشريحة بنجاح ، انقل الشريحة إلى صندوق رطب لمدة 1 ساعة لإعطاء الأجنة وقتا للتعافي من عملية الحقن قبل إزالتها من الشريحة.

5. تربية الأجنة المحقونة

1. بعد 1 ساعة من الحضانة في صندوق رطب ، قم بإزالة الأجنة المحقونة برفق من الشريط باستخدام ملقط وزن الريشة ، ونقلها إلى أنبوب مملوء بكمية صغيرة من الإيثانول بنسبة 70٪. اقلب الأنبوب عدة مرات لنقل الأجنة إلى قاع الأنبوب. كرر غسل الإيثانول مرة واحدة ، متبوعا بثلاث غسلات بالماء المعقم.
2. باستخدام فرشاة طلاء صغيرة وناعمة ، انقل جميع الأجنة المحقونة إلى ألواح أجار 1٪ مع 2٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات. ضع المضاد الحيوي المضاد للبكتيريا بعد تبريد ألواح الآجار المصبوبة عن طريق الانتشار على سطح اللوحة باستخدام موزع الخلية. ختم لوحة أجار مع بارافيلم لمنع جفاف أجار.
   ملاحظة: لا تحاول إعادة الأجنة المحقونة إلى مستعمرة بعد الحقن لأن العمال قد يدمرون معظم الأجنة المحقونة. لذلك يتم تحسين البقاء على قيد الحياة من خلال السماح للأجنة بالتطور على ألواح أجار خارج بيئة المستعمرة العادية.
3. احتضان ألواح الآجار عند 25 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع تقريبا. تحقق بانتظام من الفقس.
4. بمجرد أن يفقس الجنين الأول إلى يرقة ، أعد جميع الأجنة واليرقات إلى صندوق عش مع عدد قليل من الممرضات الشابات لرعاية الصغار. قم بالتغذية باستخدام الصراصير التي تم لسعها مسبقا بواسطة مستعمرة أكبر من النوع البري ، وإزالة النفايات ، وإضافة الماء باتباع نفس البروتوكول الذي تمت مناقشته في القسم 1.
   ملاحظة: الصناديق الصغيرة (9.5 × 9.5 سم²) مثالية لمثل هذه المستعمرات. H. المملح يتكاثر بشكل جيد في الأسر. لذلك ، يمكن تربية الأجنة الطافرة حتى مرحلة البلوغ. يؤدي عزل البالغين المتحولين إلى الانتقال إلى مرحلة بوابة الألعاب الإنجابية. تستخدم الصلبان الخاضعة للرقابة لإنشاء مستعمرات متحولة مع أفراد متغايرين الزيجوت أو متماثلي الزيجوت (الشكل 5).

النتائج

باستخدام البروتوكول المقدم هنا ، تم إجراء تحرير الجينوم في أجنة Harpegnathos saltator بنجاح. تم التحقق من صحة هذه النتائج عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل واستنساخ pGEM للحمض النووي المستخرج من الأجنة المحقونة متبوعا بتسلسل الحمض النووي. وصلت كفاءة الطفرات الجسدية باستخدام ...

Discussion

أدى تطور eusociality بين الحشرات ، بما في ذلك النمل والنحل والدبابير والنمل الأبيض ، إلى ظهور سمات سلوكية ومورفولوجية جديدة ، يفهم أن الكثير منها يتأثر بمجموعة من العوامل البيئية والوراثية¹،²،^3،4. لسوء الحظ ، فإن جاذبية وفائد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030