개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

요약

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

사회적 행동 및 생식 분업과 같은 진사회적 곤충의 독특한 특성은 유전 시스템에 의해 제어됩니다. 유전자가 사회적 형질을 조절하는 방법을 다루기 위해 우리는 CRISPR 복합체를 세포 융합 단계에서 어린 배아에 전달하여 돌연변이 개미를 개발했습니다. 여기에서 우리는 현저한 표현형 가소성을 나타내는 포네린 개미 종인 Harpegnathos saltator에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. H. 소금 개미는 실험실 환경에서 쉽게 사육됩니다. 배아는 Cas9 단백질로 미세 주입하기 위해 수집되고 집에서 만든 석영 바늘을 사용하여 시험관 내에서 합성 된 작은 가이드 RNA (sgRNA)가 수집됩니다. 주입 후 배아는 식민지 외부에서 사육됩니다. 첫 번째 유충이 출현 한 후, 모든 배아와 유충은 추가 개발을 위해 몇 명의 간호 종사자와 함께 둥지 상자로 옮겨집니다. 이 프로토콜은 개미의 카스트 특이적 생리학 및 사회적 행동 분석을 위한 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하지만 더 넓은 범위의 hymenopteran 및 기타 곤충에도 적용될 수 있습니다.

서문

곤충의 진사회성, 즉 Hymenoptera와 Blattodea (이전의 Isoptera)의 진화는 개인과 식민지 수준 모두에서 나타나는 독특하고 종종 정교한 행동 특성을 초래했습니다. 가장 진보 된 사회 곤충 그룹을 특징 짓는 특성 인 생식 분업은 종종 여러 행동 적으로 그리고 종종 형태 학적으로 독특한 그룹으로 구성된 카스트 제도를 포함합니다. 카스트 간의 이러한 행동 및 형태 학적 다양성은 유전 체계뿐만 아니라 종종 환경 ^1,2,3,4에 의해 통제되어 진생 곤충을 유전 및 후성 유전 학적 연구에 매력적인 주제로 만듭니다.

진사회적 곤충의 유전 시스템을 조작하는 능력은 많은 종들이 실험실 환경에서 짝짓기 및 번식하지 않기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다. 대부분의 eusocial 곤충은 또한 식민지에 생식 개체가 거의 없기 때문에 생산할 수있는 자손의 수를 제한하고 결과적으로 유전자 조작을위한 표본 크기를 제한합니다⁵. 또한, 많은 진사회적 곤충은 유전 연구에 일반적으로 사용되는 곤충(예: 초파리)에 비해 생성 시간이 길기 때문에^{유전 계통을} 설정하는 데 어려움이 가중됩니다5. 그러나 일부 eusocial 종은 식민지에서 생식 활성 개체의 상당 부분을 생성 할 수 있으며, 이는 문제를 완화하고 돌연변이 또는 형질 전환 계통을 확립 할 수있는 기회를 제공합니다.

포네린 개미 종인 하르페냐토스 살타토르(Harpegnathos saltator)의 경우, 모든 여성 노동자는 여왕의 죽음이나 사회적 고립에 따라 생식 활동을 할 수 있습니다. 이러한 작업자를 "게이머게이트"라고 하며 새로운 식민지를 생성하는 데 사용할 수 있습니다⁶. 더욱이, 하나의 군집에 하나 이상의 게이머게이트가 존재할 수 있어서,^{자손 생산5,7,8}을 증가시킨다. 지금까지 돌연변이 및 / 또는 형질 전환 계통은 유럽 꿀벌 인 Apis mellifera와 개미 종, H. saltator, Ooceraea biroi 및 Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15에서 개발되었습니다. . 사회적 꿀벌과 개미의 유전자 분석은 유전자와 유전자가 진사회적 곤충 행동 및 카스트 특정 생리학에 미치는 영향을 연구할 수 있는 다양한 기회를 제공하여 진사회성에 대한 더 나은 이해를 향한 길을 열었습니다.

여기에서는 H. saltator의 CRISPR / Cas9 시스템을 통한 유전자 변형 프로토콜을 제공합니다. 특히,이 기술은 모든 냄새 수용체 (OR)의 절대 공동 수용체를 암호화하는 유전자 인 orco에서 생식선 돌연변이를 생성하는 데 사용되었습니다.¹⁰. OR 유전자는 hymenopteran eusocial 곤충¹⁶에서 현저하게 확장되었으며, orco는 곤충 후각에 필수적인 역할을합니다. 부재시 OR은 정상적으로 조립되거나 작동하지 않습니다. 따라서 orco 유전자의 돌연변이는 후각 감각, 신경 발달 및 관련 사회적 행동을 방해합니다 ^9,10.

이 프로토콜에서는 Cas9 단백질과 소형 가이드 RNA(sgRNA)를 표적 유전자의 돌연변이 유발을 유도할 목적으로 미세 주입을 사용하여 개미 배아에 도입합니다. 여기에서는 콜로니 및 주입 된 배아의 관리에 관한 지침과 함께 미세 주입 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이러한 방법은 H. saltator 개미의 다양한 유전자에서 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하며 더 넓은 스펙트럼의 hymenopteran 곤충에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 하르페냐토스 염제 식민지의 정기적인 유지 관리

1. 야생형 콜로니를 22-25°C의 개미 사육실에서 투명한 플라스틱 상자에 보관하고 12시간 빛: 12시간 어두운(12L:12D) 조명 일정의 광주기를 유지합니다.
   1. 작은 상자 (9.5 x 9.5 cm²)를 사용하여 개별 작업자 또는 소규모 식민지를 양육하십시오. 중간 크기의 상자(19 x 13.5cm 2) 또는 큰 상자(27 x 19cm²)를 사용하여 더 큰 군체를 사육합니다(그림 1).
   2. 둥지 상자를 만들려면 석고를 사용하여 상자 바닥을 만드십시오. 젖은 석고가 중간 및 큰 상자에서 건조되면 거품 블록을 상자 뒤쪽에서 몇 센티미터 깊이와 몇 센티미터 깊이의 석고에 눌러 낮은 둥지 영역을 지정합니다. 석고가 마르면 지정된 둥지 부분을 정사각형 유리 조각으로 덮으십시오.
      참고: 작은 상자에서는 아래쪽 둥지 영역을 지정할 필요가 없습니다. 개미가 지정된 낮은 둥지 영역을 사용하는 것을 게을리하는 경우 사각형의 빨간색 셀로판으로 유리를 덮는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이것은 H. saltator 가 야생에서 사용하는 둥지와 유사한 어두운 지하 공간의 인상을주고 새끼를 지정된 지역으로 옮기도록 장려 할 수 있습니다.
2. 일주일에 두 번 살아있는 귀뚜라미로 식민지를 먹이십시오.
   알림: 식민지는 다음 먹이를 먹기 전에 모든 귀뚜라미를 섭취 할 수있을만큼 충분히 먹여야합니다. 고립 된 개미와 돌연변이 개미 식민지에 매주 2-3 번 일반 식민지의 작업자가 미리 쏘인 귀뚜라미를 먹이십시오.
3. 세척 병을 사용하여 석고 둥지 상자 바닥에 정기적으로 물을 바르십시오.
   알림: 석고는 만졌을 때 먼지가 느껴지지 않을 정도로 촉촉해야 하지만 추가된 모든 물이 석고에 흡수될 만큼 충분히 건조해야 합니다. 둥지에 과도하게 물을주지 않는 것이 중요합니다. 평균적으로 둥지 상자는 일주일에 한 번 소량의 물을 추가해야합니다.
4. 수유가 발생할 때마다 쓰레기와 죽은 사람을 제거하십시오. 이러한 물질을 일반 쓰레기로 폐기하기 전에 모든 폐기물과 죽은 개미를 -30°C에서 밤새 동결하십시오.
5. 주기적으로 식민지에 말린 톱밥을 넣으십시오. 이것은 유충이 번데기를 겪을 때 돕고 작업자가 둥지 상자를 깨끗하게 유지하는 데 도움이됩니다.

2. 석영 유리 미세 주입 바늘의 제조

1. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 미세 주입 바늘을 당깁니다.
2. 당길 유리를 선택합니다. 사용 중인 유리가 먼지가 없고 깨끗한 환경에 보관되었는지 확인하십시오.
   참고: 여기에서는 외경 1.0mm, 내경 0.5mm, 길이 7.5cm의 얇은 벽 필라멘트 석영 유리를 사용하여 미세 주사 바늘을 생산했습니다. 연체 배아를 주사하는 경우 붕규산 바늘도 적용 할 수 있지만 붕규산 바늘은 단단한 융모막을 관통 할 수 없습니다.
3. 풀러의 매개변수 설정을 지정합니다. H. saltator 배아에 대한 미세 주입 바늘을 당기는 2 단계 프로세스를 사용하십시오 : 첫 번째 단계의 매개 변수에는 열 575, 필라멘트 3, 속도 35, 지연 145 및 당김 75가 포함됩니다. 두 번째 단계의 매개 변수는 열 425, 필라멘트 0, 속도 15, 지연 128 및 당김 200을 포함합니다. 두 번째 단계에 따라 결과 바늘의 테이퍼가 2mm이고 팁이 0.5μm인지 확인합니다(그림 2).
   알림: 이 매개변수 세트는 다른 바늘 유형에 대한 매개변수와 함께 사용 설명서¹⁷에서 찾을 수 있습니다. 피펫 풀러에 대한 매뉴얼은 종종 다양한 기술에 대한 권장 매개 변수를 제공합니다. 특정 요구에 가장 적합한 바늘을 생성하는 매개 변수를 결정하기 위해 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 짧은 테이퍼는 H. saltator 배아의 단단한 융모막을 관통 할 수 있기 때문에 H. saltator 주사에 이상적입니다. 디코리온화된 배아(예: 초파리)와 같은 부드러운 배아를 주입하는 경우 약 10mm 정도 더 긴 테이퍼가 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 피펫 풀러의 작동 설명서는 일반적으로 다양한 요구에 적합한 바늘을 당기는 특정 매개 변수를 제공합니다. 유리 필라멘트를 다루고 바늘을 당기는 동안 장갑을 착용하는 것이 중요합니다. 장갑을 착용하지 않으면 맨손의 기름이 유리로 옮겨 질 수 있습니다.
4. 매개변수가 설정되면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 미세 주입용 바늘을 당깁니다. 바늘을 사용할 때까지 먼지가없고 깨끗한 환경에 보관하십시오.
   알림: 새로 뽑은 미세 주사 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 미리 뽑은 바늘을 사용하는 경우 바늘 끝의 손상 및 잠재적 인 오염을 방지하기 위해 상자에 올바르게 보관해야합니다. 장기 보관을 거친 바늘은 배아 주사에 권장되지 않습니다.

3. 마이크로 인젝터의 제조

1. 마이크로 인젝터를 사용하여 개미 배아에 원하는 재료를 주입하십시오.
2. Cas9 단백질의 미세 주입 혼합물을 준비하고 시험관 내에서 합성된 소형 가이드 RNA(sgRNA)¹⁰. 미세 주사 바늘을 넣을 때까지 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 사용하지 않을 때는 미세 주입 혼합물을 -80 ° C에서 보관하십시오.
   참고: 농도는 종마다 다릅니다. 고농도는 높은 사망률을 유발할 수 있지만 낮은 농도는 효율성을 감소시킬 수 있습니다. 우리는 H. saltator 배아 주입을 위해 0.2 μg / μL Cas9 단백질과 0.2 μg / μL sgRNA를 사용합니다. 우리의 sgRNA의 설계는 이전에 확립 된 프로토콜¹⁸을 따랐습니다. 유전자 서열은 DNA 데이터베이스로부터 수득하였다. H. saltator의 게놈 서열도 이전에^19,20으로 보고되었습니다.
3. H. saltator 배아에 대한 주입 매개 변수를 조정하십시오 : 주입 압력 140 헥토 파스칼 (hPa), 일정 압력 70hPa 및 0.4 초의 시간. 재료가 한 방향으로 만 흐르도록 일정한 압력을 조정하십시오. 바늘에서 배아로 물질이 흐르지 않는 경우에만 주입 압력과 시간을 조정하십시오.
   알림: 다른 유형의 배아를 주입하는 경우 변경될 수 있는 주요 매개변수는 일정한 압력이며, 이는 배아의 체액이 바늘로 다시 흐르지 않도록 하는 역할을 합니다. 이 프로토콜에서는 볼륨이 제어되지 않습니다. 마이크로 인젝터의 매개 변수를 설정하면 일관된 주사를 얻기에 충분합니다.
4. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 혼합물 2μL를 마이크로주입 바늘에 넣습니다. 혼합물에 기포가 형성되지 않도록 천천히 수행하십시오.
   알림: 기포가 형성되면 일관된 미세 주입을 유지하기 어려울 수 있습니다.
5. 좁은 테이퍼가 유지되도록 테이프 가장자리를 따라 부러뜨려 바늘 끝만 부러뜨립니다. 바늘이 끝이 열릴 정도로 부러졌는지 확인하되 테이퍼가 부러질 정도는 아닙니다.
   알림: 중요한 것은 부러진 후 바늘의 구멍이 너무 넓으면 주입 압력을 가하기 전에 가압 된 마이크로 인젝터에 장착 할 때 바늘에서 액체가 흘러 나오는 것을 볼 수 있다는 것입니다. 일부 미세 주입 프로토콜은 가위로 팁을 잘라 바늘을 끊는 것이 좋습니다. 가위로 인해 바늘 끝이 부서 질 수 있으므로이 방법은 권장되지 않습니다. 부서진 바늘로 배아를 주입하는 것은 매우 해로울 것입니다.
6. 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착

4. 배아 주입

1. 세포 융합 단계에서 미세 주입을위한 배아를 선택하십시오 : 세포질 분열없이 핵이 분열하는 발달 기간.
   참고: 이것은 이전에 Drosophila²¹에서 발견된 바와 같이 미세 주입에 의한 게놈 편집을 위한 개발 중 이상적인 시기입니다. H. saltator 배아는 세포 융합 단계를 통과하고 난자 침착 후 약 36 시간 후에 세포화에 도달합니다¹⁰. 어린 배아가 주사에 사용되는 경우 더 높은 효율이 달성됩니다.
2. 양면 테이프 조각에 배아를 유리 현미경 슬라이드에 붙였습니다. 주사 중 움직임을 방지하기 위해 배아가 테이프에 잘 고정되어 있는지 확인하십시오. 배아의 측면이 테이프의 가장자리에 오도록 배아를 수직 방향으로 놓습니다 (그림 3). 슬라이드와 라이닝된 배아를 지정된 미세 주입 워크스테이션의 현미경 스테이지에 놓습니다.
   알림: 매 주사마다 바늘 위치를 조정하는 대신 스테이지에서 슬라이드를 움직여 연속 주사를 수행할 수 있도록 배아를 배열하는 것이 좋습니다. 이를 통해 연속 주입을보다 효율적으로 수행 할 수 있습니다.
3. 바늘을 미세 조작기를 사용하여 주입할 첫 번째 배아에 맞춥니다(그림 4a).
4. 현미경으로 등쪽 / 복부 축을 따라 첫 번째 배아에 바늘을 옆으로 뚫습니다.
5. 미세 주입 혼합물을 주입하십시오. 주입 된 액체로 인한 내부 압력의 증가를 나타내는 배아의 약간의 움직임을 찾으십시오. 또한 배아의 외막에 눈에 보이는 미량의 조직 및/또는 지질을 포함하는 작은 물방울이 형성되는지 관찰하십시오(그림 4b).
   참고: 물방울에 조직 및/또는 지질의 흔적이 있다는 것은 바늘이 배아의 융모막과 유리막 막을 성공적으로 뚫었음을 나타냅니다. 이러한 물질의 흔적이 없으면 주입이 성공적으로 수행되지 않았으므로 반복해야합니다. 몇 초 후, 물방울은 배아에 의해 재 흡수되어 더 이상 보이지 않습니다.
6. 즉시 배아에서 바늘을 부드럽게 제거하고 현미경 슬라이드의 위치를 조정하여 다음으로 진행하십시오. 모든 배아가 주입 될 때까지 반복하십시오.
7. 슬라이드의 모든 배아가 성공적으로 주입되면 슬라이드를 습한 상자에 1시간 동안 옮겨 배아가 슬라이드에서 제거되기 전에 주입 과정에서 회복할 시간을 줍니다.

5. 주입된 배아의 사육

1. 습한 상자에서 1 시간 동안 배양 한 후, 페더 급 집게를 사용하여 테이프에서 주입 된 배아를 부드럽게 제거하고 소량의 70 % 에탄올로 채워진 튜브로 옮깁니다. 배아를 튜브 바닥으로 옮기기 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다. 에탄올 세척을 한 번 반복 한 다음 오토 클레이브 물로 세 번 세척하십시오.
2. 작고 부드러운 붓을 사용하여 주입 된 모든 배아를 2 % 항생제 항진균제가 함유 된 1 % 한천 플레이트로 옮깁니다. 항생제-항진균제를 붓고 식힌 후 한천 플레이트를 세포 스프레더를 사용하여 플레이트 표면에 퍼뜨립니다. 한천 건조를 방지하기 위해 한천 플레이트를 파라 필름으로 밀봉하십시오.
   참고: 작업자가 대부분의 주입된 배아를 파괴할 수 있으므로 주사 후 주입된 배아를 식민지로 되돌리려고 시도하지 마십시오. 따라서 생존은 정상적인 식민지 환경 외부의 한천 판에서 배아가 발달하도록 허용함으로써 최적화됩니다.
3. 한천 플레이트를 대략 4주 동안 25°C에서 인큐베이션한다. 부화를 정기적으로 확인하십시오.
4. 첫 번째 배아가 유충으로 부화하면 모든 배아와 유충을 둥지 상자에 넣고 몇 명의 젊은 간호사와 함께 부화한 새끼를 돌봅니다. 더 큰 야생형 식민지에 미리 쏘인 귀뚜라미를 사용하여 먹이를 주고, 폐기물을 제거하고, 섹션 1에서 논의된 것과 동일한 프로토콜에 따라 물을 추가합니다.
   알림: 작은 상자 (9.5 x 9.5 cm²)는 이러한 식민지에 이상적입니다. H. saltator 는 포로 상태에서 잘 번식합니다. 따라서 돌연변이 배아는 성인으로 양육 될 수 있습니다. 돌연변이 성체의 분리는 생식 게이머게이트 단계로의 전환을 유도합니다. 통제 된 십자가는 이형 접합체 또는 동형 접합체 개체가있는 돌연변이 콜로니를 확립하는 데 사용됩니다 (그림 5).

결과

여기에 제공된 프로토콜을 사용하여 Harpegnathos saltator 배아에서 게놈 편집이 성공적으로 수행되었습니다. 이러한 결과는 중합효소 연쇄 반응 및 주입된 배아에서 추출한 DNA의 pGEM 클로닝과 DNA 시퀀싱을 통해 검증되었습니다. 이 프로토콜을 사용한 체세포 돌연변이 유발의 효율은 약 40 %에 도달했습니다. F1 돌연변이 수컷은 야생형 암컷과 교배되어 이형 접합체 F2 암?...

토론

개미, 벌, 말벌, 흰개미를 포함한 곤충들 사이에서 우사회성의 진화는 새로운 행동 및 형태학적 특성의 출현을 가져왔으며, 그 중 많은 부분이 환경 및 유전^{적 요인의} 조합에 의해 영향을 받는 것으로 이해됩니다1,2,3,4. 불행히도, 유전학 분야의 연구 모델로서의 eusocial 곤충의 매력과 유용성은이 그룹?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
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Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030