개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

요약

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

사회적 행동 및 생식 분업과 같은 진사회적 곤충의 독특한 특성은 유전 시스템에 의해 제어됩니다. 유전자가 사회적 형질을 조절하는 방법을 다루기 위해 우리는 CRISPR 복합체를 세포 융합 단계에서 어린 배아에 전달하여 돌연변이 개미를 개발했습니다. 여기에서 우리는 현저한 표현형 가소성을 나타내는 포네린 개미 종인 Harpegnathos saltator에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. H. 소금 개미는 실험실 환경에서 쉽게 사육됩니다. 배아는 Cas9 단백질로 미세 주입하기 위해 수집되고 집에서 만든 석영 바늘을 사용하여 시험관 내에서 합성 된 작은 가이드 RNA (sgRNA)가 수집됩니다. 주입 후 배아는 식민지 외부에서 사육됩니다. 첫 번째 유충이 출현 한 후, 모든 배아와 유충은 추가 개발을 위해 몇 명의 간호 종사자와 함께 둥지 상자로 옮겨집니다. 이 프로토콜은 개미의 카스트 특이적 생리학 및 사회적 행동 분석을 위한 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하지만 더 넓은 범위의 hymenopteran 및 기타 곤충에도 적용될 수 있습니다.

서문

곤충의 진사회성, 즉 Hymenoptera와 Blattodea (이전의 Isoptera)의 진화는 개인과 식민지 수준 모두에서 나타나는 독특하고 종종 정교한 행동 특성을 초래했습니다. 가장 진보 된 사회 곤충 그룹을 특징 짓는 특성 인 생식 분업은 종종 여러 행동 적으로 그리고 종종 형태 학적으로 독특한 그룹으로 구성된 카스트 제도를 포함합니다. 카스트 간의 이러한 행동 및 형태 학적 다양성은 유전 체계뿐만 아니라 종종 환경 ^1,2,3,4에 의해 통제되어 진생 곤충을 유전 및 후성 유전 학적 연구에 매력적인 주제로 만듭니다.

진사회적 곤충의 유전 시스템을 조작하는 능력은 많은 종들이 실험실 환경에서 짝짓기 및 번식하지 않기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다. 대부분의 eusocial 곤충은 또한 식민지에 생식 개체가 거의 없기 때문에 생산할 수있는 자손의 수를 제한하고 결과적으로 유전자 조작을위한 표본 크기를 제한합니다⁵. 또한, 많은 진사회적 곤충은 유전 연구에 일반적으....

프로토콜

1. 하르페냐토스 염제 식민지의 정기적인 유지 관리

1. 야생형 콜로니를 22-25°C의 개미 사육실에서 투명한 플라스틱 상자에 보관하고 12시간 빛: 12시간 어두운(12L:12D) 조명 일정의 광주기를 유지합니다.
   1. 작은 상자 (9.5 x 9.5 cm²)를 사용하여 개별 작업자 또는 소규모 식민지를 양육하십시오. 중간 크기의 상자(19 x 13.5cm 2) 또는 큰 상자(27 x 19cm²)를 사용하여 더 큰 군체를 사육합니다(그림 1).
   2. 둥지 상자를 만들려면 석고를 사용하여 상자 바닥을 만드십시오. 젖은 석고가 중간 및 큰 상자에서 건조되면 거품 블록을 상자 뒤쪽에서 몇 센티미터 깊이와 몇 센티미터 깊이의 석고에 눌러 낮은 둥지 영역을 지정합니다. 석고가 마르면 지정된 둥지 부분을 정사각형 유리 조각으로 덮으십시오.
      참고: 작은 상자에서는 아래쪽 둥지 영역을 지정할 필요가 없습니다. 개미가 지정된 낮은 둥지 영역을 사용하는 것을 게을리하는 경우 사각형의 빨간색 셀로판으로 유리를 덮는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이것은 H. saltator 가 야생에서 사용하는 둥지와 유사한 어두....

결과

여기에 제공된 프로토콜을 사용하여 Harpegnathos saltator 배아에서 게놈 편집이 성공적으로 수행되었습니다. 이러한 결과는 중합효소 연쇄 반응 및 주입된 배아에서 추출한 DNA의 pGEM 클로닝과 DNA 시퀀싱을 통해 검증되었습니다. 이 프로토콜을 사용한 체세포 돌연변이 유발의 효율은 약 40 %에 도달했습니다. F1 돌연변이 수컷은 야생형 암컷과 교배되어 이형 접합체 F2 암?.......

토론

개미, 벌, 말벌, 흰개미를 포함한 곤충들 사이에서 우사회성의 진화는 새로운 행동 및 형태학적 특성의 출현을 가져왔으며, 그 중 많은 부분이 환경 및 유전^{적 요인의} 조합에 의해 영향을 받는 것으로 이해됩니다1,2,3,4. 불행히도, 유전학 분야의 연구 모델로서의 eusocial 곤충의 매력과 유용성은이 그룹?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030