זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

Summary

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

Abstract

התכונות הייחודיות של חרקים אאוסוציאליים, כגון התנהגות חברתית וחלוקת עבודה רבייתית, נשלטות על ידי המערכת הגנטית שלהם. כדי לטפל באופן שבו גנים מווסתים תכונות חברתיות, פיתחנו נמלים מוטנטיות באמצעות העברה של קומפלקס קריספר לעוברים צעירים בשלב הסינסיטיאלי שלהם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול של מוטגנזה בתיווך קריספר במלח Harpegnathos, מין נמלה פונרין המציג פלסטיות פנוטיפית מרשימה. H . נמלים מלח מגודלים בקלות בסביבה מעבדתית. העוברים נאספים למיקרו-הזרקות עם חלבוני Cas9 ומסונתזים במבחנה של רנ"א קטנים (sgRNAs) באמצעות מחטי קוורץ תוצרת בית. עוברים לאחר הזרקה מגודלים מחוץ למושבה. לאחר הופעת הזחלים הראשונים, כל העוברים והזחלים מועברים לתיבת קן עם כמה עובדים סיעודיים להמשך פיתוח. פרוטוקול זה מתאים לגרימת מוטגנזה לניתוח פיזיולוגיה ספציפית לקאסטות והתנהגות חברתית בנמלים, אך ניתן ליישם אותו גם על ספקטרום רחב יותר של קרום הבתולים וחרקים אחרים.

Introduction

האבולוציה של האאוסוציאליות בחרקים, כלומר אלה של המסדרים Hymenoptera ו Blattodea (לשעבר Isoptera), הביאה תכונות התנהגותיות ייחודיות ולעתים קרובות מתוחכמות המתבטאות הן ברמת הפרט והן ברמת המושבה. חלוקת העבודה של הרבייה, תכונה המאפיינת את הקבוצות המתקדמות ביותר של חרקים חברתיים, כוללת לעתים קרובות מערכות קאסטות המורכבות מכמה קבוצות התנהגותיות ולעתים קרובות מורפולוגיות מובחנות. מגוון התנהגותי ומורפולוגי כזה בין קאסטות נשלט לא רק על ידי המערכת הגנטית שלהם, אלא גם לעתים קרובות על ידי הסביבה 1,2,3,4^, מה שהופך חרקים אאוסוציאליים לנושאים אטרקטיביים למחקר גנטי ואפיגנטי.

היכולת לתמרן את המערכת הגנטית של חרקים אאוסוציאליים הוכחה כמאתגרת מכיוון שמינים רבים אינם מזדווגים ומתרבים בסביבות מעבדה. לרוב החרקים האאו-סוציאליים יש גם מעט מאוד פרטים רבייה במושבה, מה שמגביל את מספר הצאצאים שניתן לייצר וכתוצאה מכך, מגביל את גודל המדגם למניפולציה גנטית⁵. בנוסף, לחרקים אאוסוציאליים רבים יש זמני דור ארוכים בהשוואה לחרקים המשמשים בדרך כלל למחקרים גנטיים (כגון דרוזופילה), מה שמוסיף לקושי לבסס קווים גנטיים⁵. עם זאת, מינים אאו-סוציאליים מסוימים יכולים ליצור חלק גדול של פרטים פעילים רבייה במושבה, מה שמקל על האתגרים ומספק הזדמנויות להקים קווים מוטנטיים או מהונדסים.

במקרה של מין נמלת הפונרין, Harpegnathos saltator, כל העובדות יכולות להיות פעילות רבייה עם מותה של מלכה או בידוד חברתי. עובדים אלה מכונים "גיימרגייטס" וניתן להשתמש בהם ליצירת מושבות חדשות⁶. יתר על כן, ייתכן שיש יותר מגיימרגייט אחד נוכח במושבה, ובכך להגדיל את ייצור הצאצאים ^5,7,8. עד כה פותחו קווים מוטנטיים ו/או מהונדסים בדבורת הדבש האירופית, Apis mellifera, ובמיני הנמלים, H. saltator, Ooceraea biroi ו-Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . ניתוחים גנטיים בדבורים ובנמלים חברתיות סללו את הדרך להבנה טובה יותר של אאוסוציאליות, וסיפקו מגוון הזדמנויות לחקר גנים והשפעתם על התנהגות חרקים אאו-סוציאליים ופיזיולוגיה ספציפית לקאסטות.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לשינוי גנטי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ב- H. saltator. באופן ספציפי, טכניקה זו שימשה ליצירת מוטציה germline ב orco, הגן המקודד את הקולטן המשותף המחייב של כל קולטני ריח (ORs)¹⁰. גנים של OR הורחבו להפליא בחרקים אאוסוציאליים של Hymenopteran¹⁶, ואורקו ממלא תפקיד חיוני בריח חרקים; בהיעדרו, ORs אינם מורכבים או מתפקדים כרגיל. מוטציות בגן אורקו משבשות אפוא את תחושת חוש הריח, את ההתפתחות העצבית ואת ההתנהגויות החברתיות הנלוות ^9,10.

בפרוטוקול זה, חלבוני Cas9 ורנ"א מנחים קטנים (sgRNAs) מוחדרים לעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה לצורך גרימת מוטגנזה של גן מטרה. כאן נתאר בפירוט את הליך המיקרו-הזרקה יחד עם הוראות לגבי הטיפול במושבות ובעוברים מוזרקים. שיטות אלה מתאימות לגרימת מוטגנזה במגוון גנים שונים בנמלים מסוג H. saltator , וניתן ליישם אותן על ספקטרום רחב יותר של חרקים קרום הבתולים.

Protocol

1. תחזוקה שוטפת של מושבות מלח Harpegnathos

1. שמור על מושבות פראיות מסוג H . saltator בקופסאות פלסטיק שקופות בחדר גידול נמלים בטמפרטורה של 22-25 מעלות צלזיוס וצילום של 12 שעות אור: לוח זמנים של תאורה חשוכה 12 שעות (12L:12D).
   1. השתמש בקופסאות קטנות (9.5 x 9.5 ס"מ²) כדי לגדל עובדים בודדים או מושבות קטנות. השתמש בקופסאות בינוניות (19 x 13.5 ס"מ 2) או בקופסאות גדולות (27 x 19 ס"מ²) כדי לגדל מושבות גדולות יותר (איור 1).
   2. ליצירת תיבות קינון, השתמשו בטיח ליצירת רצפות עבור התיבות. כאשר הטיח הרטוב מתייבש בקופסאות הבינוניות והגדולות, לחצו גוש קצף לתוך הטיח בעומק של כמה סנטימטרים וכמה סנטימטרים מהחלק האחורי של הקופסה כדי לייעד אזור קן תחתון. לאחר שהטיח התייבש, מכסים את אזור הקן המיועד בחתיכת זכוכית מרובעת.
      הערה: בקופסאות קטנות, אין צורך לציין אזור קן נמוך יותר. אם נמלים מזניחות את השימוש באזור הקן התחתון המיועד, זה עשוי לעזור לכסות את הזכוכית בחתיכה מרובעת של צלופן אדום. זה יוצר רושם של חלל תת-קרקעי חשוך הדומה לקנים ש-H. saltator משתמשים בהם בטבע ועשויים לעודד אותם להעביר את הגזע שלהם לאזור המיועד.
2. להאכיל מושבות עם צרצרים חיים פעמיים בשבוע.
   הערה: יש להאכיל מושבות מספיק כדי שהן יצרכו את כל הצרצרים לפני ההאכלה הבאה שלהן. האכילו נמלים מבודדות ומושבות נמלים מוטנטיות בצרצרים שנעקצו מראש על ידי עובדי מושבה רגילה 2-3 פעמים בשבוע.
3. יש למרוח מים באופן קבוע על ריצוף תיבת הטיח באמצעות בקבוק שטיפה.
   הערה: הטיח צריך להיות לח מספיק כדי שלא ירגיש מאובק למגע, אבל הוא צריך להיות יבש מספיק כדי שכל המים שנוספו ייספגו על ידי הטיח. חשוב שהקנים לא יושקו יתר על המידה. בממוצע, תיבות קינון יזדקקו לכמות קטנה של מים שנוספו פעם בשבוע.
4. בכל פעם שמתרחשת האכלה, הסר אשפה ואנשים מתים. הקפיאו את כל הפסולת והנמלים המתות למשך הלילה בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס לפני השלכת חומרים אלה כאשפה רגילה.
5. הוסף קמצוץ של נסורת מיובשת למושבות מעת לעת; זה עוזר לזחלים בזמן שהם עוברים גורים ועוזר לעובדים לשמור על תיבת הקן נקייה.

2. הכנת מחטי מיקרו הזרקה מזכוכית קוורץ

1. השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך מחטי מיקרו-הזרקה מזכוכית.
2. בחר את הזכוכית שיש למשוך. ודא שהזכוכית שבה נעשה שימוש אוחסנה בסביבה נקייה ונטולת אבק.
   הערה: כאן, זכוכית קוורץ נימה דקת דופן עם קוטר חיצוני של 1.0 מ"מ, קוטר פנימי של 0.5 מ"מ, ואורך של 7.5 ס"מ שימשה לייצור מחטי מיקרו-הזרקה. אם מזריקים עובר בעל גוף רך, מחטי בורוסיליקט עשויות להיות ישימות גם הן, אך מחטי בורוסיליקט אינן מסוגלות לחדור כוריון קשה.
3. הגדר את הגדרות הפרמטרים של המושך. השתמש בתהליך דו-שלבי כדי למשוך מחטי מיקרו-הזרקה לעוברי H. saltator : פרמטרים לשלב הראשון כוללים חום של 575, נימה של 3, מהירות של 35, עיכוב של 145, ומשיכה של 75; הפרמטרים של הצעד השני כוללים חום של 425, נימה של 0, מהירות של 15, עיכוב של 128, ומשיכה של 200. לאחר השלב השני, ודאו שלמחט המתקבלת יש מחדד בקוטר 2 מ"מ וקצה של 0.5 מיקרומטר (איור 2).
   הערה: קבוצה זו של פרמטרים, יחד עם פרמטרים עבור סוגי מחטים אחרים, ניתן למצוא במדריך ההפעלה¹⁷. מדריכים עבור מושכי פיפטה לעתים קרובות לספק פרמטרים מומלצים עבור מגוון רחב של טכניקות. ייתכן שיידרשו כמה ניסוי וטעייה כדי לקבוע אילו פרמטרים מייצרים את המחטים הטובות ביותר לצרכים ספציפיים. מחדד קצר הוא אידיאלי עבור זריקות H. saltator, כפי שהוא יכול לחדור את הכוריון הקשה של עוברי H. saltator. אם מזריקים לעובר רך, כמו זה שעבר דקורציה (למשל, דרוזופילה), התחדדות ארוכה יותר סביב 10 מ"מ עשויה להניב תוצאות טובות יותר. מדריכי הפעלה למשיכת פיפטה מספקים בדרך כלל פרמטרים ספציפיים למשיכת מחטים המתאימות לצרכים שונים. חשוב ללבוש כפפות בעת טיפול בחוטים זכוכית ומשיכת מחטים. שמנים מידיים חשופות עשויים לעבור לזכוכית אם לא לובשים כפפות.
4. לאחר קביעת הפרמטרים, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך מחטים למיקרו-הזרקה. יש לוודא שהמחטים נשמרות בסביבה נקייה ונטולת אבק עד לשימוש.
   הערה: מומלץ להשתמש במחטי מיקרו-הזרקה טריות. אם נעשה שימוש במחטים משוכות מראש, יש לאחסן אותן כראוי בקופסה כדי למנוע נזק של קצות המחט וזיהום פוטנציאלי. מחטים שעברו אחסון לטווח ארוך אינן מומלצות להזרקות עוברים.

3. הכנת מיקרו-אינז'קטור

1. השתמש במיקרו-מזרק כדי להזריק חומרים רצויים לעוברי נמלים.
2. הכינו את תערובת המיקרו-הזרקות של חלבוני Cas9 ו-RNAs מנחים קטנים מסונתזים במבחנה (sgRNA)¹⁰. שומרים את התערובת על קרח עד שהגיע הזמן לטעון מחט מיקרו-הזרקה. כאשר אינו בשימוש, יש לאחסן את תערובת המיקרו-הזרקות בטמפרטורה של -80°C.
   הערה: הריכוזים משתנים במינים שונים. ריכוז גבוה עלול לגרום לתמותה גבוהה, בעוד שריכוז נמוך עלול להפחית את היעילות. אנו משתמשים בחלבוני 0.2 מיקרוגרם/μL Cas9 ו-0.2 מיקרוגרם/μL sgRNAs להזרקת עובר H. saltator. תכנון ה-sgRNAs שלנו נעשה על פי פרוטוקול¹⁸ שנקבע בעבר. רצפי גנים התקבלו ממאגרי דנ"א. רצף הגנום של H. saltator דווח בעבר גם^{על 19,20}.
3. התאימו את פרמטרי ההזרקה לעוברי H. saltator : לחץ הזרקה של 140 הקטופסקל (hPa), לחץ קבוע של 70 hPa וזמן של 0.4 שניות. התאימו את הלחץ הקבוע כך שהחומר יזרום רק בכיוון אחד. התאימו את לחץ ההזרקה ואת הזמן רק אם אין חומר שזורם מהמחט לתוך העובר.
   הערה: אם מזריקים סוג אחר של עובר, הפרמטר העיקרי שעשוי להשתנות הוא לחץ קבוע, אשר אחראי להבטיח כי נוזל מהעובר לא לזרום בחזרה לתוך המחט. עוצמת הקול אינה נשלטת בפרוטוקול זה. הגדרת הפרמטרים של microinjector מספיק לקבלת זריקות עקביות.
4. טען מחט מיקרו-הזרקה עם 2 μL של התערובת באמצעות קצוות פיפטה microloader. עשו זאת באיטיות כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות בתערובת.
   הערה: אם נוצרות בועות, ייתכן שיהיה קשה לשמור על מיקרו-הזרקות עקביות.
5. לשבור רק את קצה המחט על ידי שבירה לאורך קצה הקלטת כך מתחדד צר עדיין נשמר. ודא שהמחט שבורה מספיק כדי שהקצה ייפתח, אבל לא עד כדי כך שהמחטט נשבר.
   הערה: חשוב לציין שאם פתח המחט רחב מדי לאחר השבירה, המשתמש יראה נוזל אוזל מהמחט כאשר הוא מותקן על המיקרו-אינז'קטור בלחץ לפני הפעלת לחץ ההזרקה. חלק מפרוטוקולי המיקרו-הזרקה ממליצים לשבור מחטים על ידי חיתוך הקצה במספריים. שיטה זו אינה מומלצת, שכן מספריים עלולים לגרום לקצה המחט להתנפץ. הזרקת עוברים עם מחט מרוסקת תהיה מזיקה מאוד.
6. הרכב את המחט למיקרומניפולטור

4. הזרקת עוברים

1. בחר עוברים למיקרו-הזרקה מהשלב הסינסיטיאלי: הזמן במהלך ההתפתחות שבו גרעינים מתחלקים ללא ציטוקיניזה.
   הערה: זהו הזמן האידיאלי במהלך הפיתוח לעריכת גנום על ידי מיקרו-הזרקה, כפי שהתגלה בעבר בדרוזופילה²¹. עוברי H. saltator עוברים את השלב הסינסיטיאלי ומגיעים לצלוליזציה כ-36 שעות לאחר שקיעת הביציות¹⁰. יעילות גבוהה יותר מושגת אם עוברים צעירים יותר משמשים להזרקות.
2. קו עוברים על פיסת סרט דו-צדדי דבוק למגלשה של מיקרוסקופ זכוכית. ודא כי העוברים מאובטחים היטב לקלטת כדי למנוע תנועה במהלך ההזרקה. הניחו את העוברים בכיוון אנכי, כך שהצד הצדדי של העובר נמצא בקצה הקלטת (איור 3). הניחו את המגלשה ואת העוברים המרופדים על במת המיקרוסקופ בתחנת עבודה ייעודית למיקרו-הזרקה.
   הערה: מומלץ לסדר את העוברים כך שניתן יהיה לבצע הזרקות עוקבות על ידי הזזת המגלשה על הבמה במקום להתאים את מיקום המחט עם כל הזרקה. זה מאפשר לבצע זריקות עוקבות בצורה יעילה יותר.
3. יישרו את המחט עם העובר הראשון שהוזרק באמצעות המיקרומניפולטור (איור 4a).
4. לנקב לרוחב את המחט לתוך העובר הראשון לאורך הציר הגבי/גחוני שלו תחת מיקרוסקופ.
5. להזריק את תערובת המיקרו הזרקות. חפש תנועה קלה של העובר, המציין עלייה בלחץ הפנימי עקב הנוזל המוזרק. בנוסף, שימו לב להיווצרות של טיפה קטנה המכילה עקבות גלויים של רקמה ו/או שומנים על הממברנה החיצונית של העובר (איור 4b).
   הערה: נוכחות של עקבות רקמה ו/או שומנים בטיפה מעידה על כך שהמחט ניקבה בהצלחה הן את קרום הכוריון והן את קרום ויטלין של העובר. אם עקבות של חומרים אלה אינם קיימים, ההזרקה לא בוצעה בהצלחה ויש לחזור עליה. לאחר מספר שניות, הטיפה תיספג מחדש על ידי העובר ולא תהיה עוד נראית לעין.
6. הסר בעדינות את המחט מהעובר מיד, והמשך לשלב הבא על ידי התאמת מיקום שקופית המיקרוסקופ. חוזרים על הפעולה עד להזרקת כל העוברים.
7. לאחר שכל העוברים בשקופית הוזרקו בהצלחה, העבירו את השקופית לקופסה לחה למשך שעה אחת כדי לתת לעוברים זמן להתאושש מתהליך ההזרקה לפני הוצאתם מהשקופית.

5. גידול עוברים מוזרקים

1. לאחר שעה של דגירה בקופסה לחה, להסיר בעדינות את העוברים המוזרקים מן הקלטת באמצעות מלקחיים במשקל נוצה, ולהעביר אותם צינור מלא כמות קטנה של 70% אתנול. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי להעביר את העוברים לתחתית הצינור. חזור על שטיפת האתנול פעם אחת, ואחריה שלוש שטיפות במים אוטומטיים.
2. באמצעות מכחול קטן ורך, העבירו את כל העוברים המוזרקים לצלחות אגר 1% עם 2% אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית. יש למרוח את האנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית לאחר שלוחות האגר שנשפכו התקררו על ידי התפשטות על פני השטח של הצלחת באמצעות מפזר תאים. אוטמים את צלחת האגר עם פרפילם כדי למנוע התייבשות אגר.
   הערה: אין לנסות להחזיר עוברים מוזרקים למושבה לאחר הזרקות מכיוון שעובדים עלולים להשמיד את רוב העוברים המוזרקים. לפיכך, ההישרדות מיטבית בכך שהיא מאפשרת לעוברים להתפתח על צלחות אגר מחוץ לסביבת מושבה רגילה.
3. לדגום את צלחות האגר ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ 4 שבועות. יש לבדוק באופן קבוע את הבקיעה.
4. לאחר שהעובר הראשון בקע לזחל, החזירו את כל העוברים והזחלים לתיבת קן עם כמה אחיות צעירות שיטפלו באבקועים. להאכיל באמצעות צרצרים שנעקצו מראש על ידי מושבה גדולה יותר מסוג בר, לפנות מוצרי פסולת ולהוסיף מים בהתאם לאותו פרוטוקול שנדון בסעיף 1.
   הערה: קופסאות קטנות (9.5 x 9.5 ס"מ²) אידיאליות למושבות כאלה. H. saltator מתרבה היטב בשבי. לכן, ניתן לגדל עוברים מוטנטיים לבגרות. בידוד של בוגרים מוטנטים גורם למעבר לשלב גיימרגייט הרבייה. צלבים מבוקרים משמשים ליצירת מושבות מוטנטיות עם פרטים הטרוזיגוטיים או הומוזיגוטיים (איור 5).

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול המסופק כאן, עריכת הגנום בעוברי מלח Harpegnathos בוצעה בהצלחה. תוצאות אלה אומתו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז ושיבוט pGEM של דנ"א המופק מעוברים מוזרקים ולאחר מכן ריצוף דנ"א. היעילות של מוטגנזה סומטית באמצעות פרוטוקול זה הגיעה לכ-40%. זכרים מוטנטים מסוג F1 הזדוו...

Discussion

האבולוציה של האאוסוציאליות בקרב חרקים, כולל נמלים, דבורים, צרעות וטרמיטים, הביאה להופעתן של תכונות התנהגותיות ומורפולוגיות חדשות, שרבות מהן מובנות כמושפעות משילוב של גורמים סביבתיים וגנטיים 1,2,3,4. למרבה הצער, האטרקטיבי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030