Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Resumo

Muitas características da eussocialidade dos insetos dependem da comunicação dentro da colônia e da divisão do trabalho. A manipulação genética de genes-chave reguladores em embriões de formigas via microinjeção e mutagênese mediada por CRISPR fornece insights sobre a natureza do comportamento altruísta em insetos eussociais.

Resumo

As características únicas dos insetos eussociais, como o comportamento social e a divisão reprodutiva do trabalho, são controladas por seu sistema genético. Para abordar como os genes regulam os traços sociais, desenvolvemos formigas mutantes através da entrega do complexo CRISPR em embriões jovens durante seu estágio sincicial. Aqui, fornecemos um protocolo de mutagênese mediada por CRISPR em Harpegnathos saltator, uma espécie de formiga ponerina que exibe impressionante plasticidade fenotípica. As formigas H. saltator são prontamente criadas em um ambiente de laboratório. Os embriões são coletados para microinjeção com proteínas Cas9 e RNAs guia sintetizados in vitro (sgRNAs) usando agulhas de quartzo caseiras. Os embriões pós-injeção são criados fora da colônia. Após o surgimento da primeira larva, todos os embriões e larvas são transportados para uma caixa de ninho com alguns trabalhadores de enfermagem para posterior desenvolvimento. Este protocolo é adequado para induzir mutagênese para análise da fisiologia específica da casta e do comportamento social em formigas, mas também pode ser aplicado a um espectro mais amplo de himenópteros e outros insetos.

Introdução

A evolução da eussocialidade em insetos, nomeadamente os das ordens Hymenoptera e Blattodea (anteriormente Isoptera), resultou em traços comportamentais únicos e muitas vezes sofisticados que se manifestam tanto a nível individual como a nível de colónia. A divisão reprodutiva do trabalho, uma característica que caracteriza os grupos mais avançados de insetos sociais, geralmente envolve sistemas de castas compostos de vários grupos comportamentalmente e muitas vezes morfologicamente distintos. Essa diversidade comportamental e morfológica entre as castas é controlada não apenas por seu sistema genético, mas também, muitas vezes, pelo ambiente 1,2,3,4^, tornando os insetos eussociais sujeitos atraentes para pesquisas genéticas e epigenéticas.

A capacidade de manipular o sistema genético de insetos eussociais provou ser um desafio, pois muitas espécies não acasalam e se reproduzem em ambientes de laboratório. A maioria dos insetos eussociais também possui pouquíssimos indivíduos reprodutivos em uma colônia, limitando o número de descendentes que podem ser produzidos e, consequentemente, limitando o tamanho da amostra para manipulação genética⁵. Além disso, muitos insetos eussociais têm longos tempos de geração em comparação com insetos comumente utilizados para estudos genéticos (como Drosophila), aumentando a dificuldade de estabelecer linhagens genéticas⁵. Algumas espécies eussociais, no entanto, podem gerar uma grande proporção de indivíduos reprodutivamente ativos em uma colônia, o que alivia os desafios e oferece oportunidades para estabelecer linhas mutantes ou transgênicas.

No caso da espécie de formiga ponerina, Harpegnathos saltator, todas as operárias podem se tornar reprodutivamente ativas após a morte de uma rainha ou isolamento social. Esses trabalhadores são chamados de "gamergates" e podem ser usados para gerar novas colônias⁶. Além disso, pode haver mais de um gamergate presente em uma colônia, aumentando assim a produção de descendentes ^5,7,8. Até o momento, linhagens mutantes e/ou transgênicas foram desenvolvidas na abelha europeia, Apis mellifera, e nas espécies de formigas, H. saltator, Ooceraea biroi e Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Análises genéticas em abelhas e formigas sociais abriram o caminho para uma melhor compreensão da eussocialidade, proporcionando uma série de oportunidades para estudar genes e seus impactos no comportamento de insetos eussociais e na fisiologia específica da casta.

Aqui, fornecemos um protocolo para modificação genética através do sistema CRISPR/Cas9 em H. saltator. Especificamente, essa técnica foi utilizada para gerar uma mutação germinativa em orco, o gene que codifica o co-receptor obrigatório de todos os receptores odorantes (ORs)¹⁰. Os genes OR foram notavelmente expandidos em insetos himenópteros eussociais¹⁶, e o orco desempenha um papel essencial no olfato de insetos; na sua ausência, as OR não se reúnem ou funcionam normalmente. Mutações do gene orco, portanto, perturbam a sensação olfativa, o desenvolvimento neural e os comportamentos sociais associados ^9,10.

Neste protocolo, proteínas Cas9 e pequenos RNAs guia (sgRNAs) são introduzidos em embriões de formigas usando microinjeção com a finalidade de induzir a mutagênese de um gene alvo. Aqui, descreveremos o procedimento de microinjeção em detalhes, juntamente com instruções sobre o cuidado de colônias e embriões injetados. Esses métodos são apropriados para induzir mutagênese em uma variedade de genes diferentes em formigas H. saltator e podem ser aplicados a um espectro mais amplo de insetos himenópteros.

Protocolo

1. Manutenção regular das colónias de saltadores de Harpegnathos

1. Manter colônias selvagens de H. saltator em caixas de plástico transparente em uma sala de criação de formigas a 22-25 °C e um fotoperíodo de 12 horas de luz: 12 horas escuras (12L:12D) de programação de iluminação.
   1. Use pequenas caixas (9,5 x 9,5 cm²) para criar trabalhadores individuais ou pequenas colônias. Use caixas médias (19 x 13,5 cm 2) ou grandes (27 x 19 cm²) para criar colônias maiores (Figura 1).
   2. Para criar caixas de ninho, use gesso para fazer pisos para as caixas. Como o gesso molhado está secando nas caixas médias e grandes, pressione um bloco de espuma no gesso a alguns centímetros de profundidade e a poucos centímetros da parte de trás da caixa para designar uma região inferior do ninho. Uma vez que o gesso tenha secado, cubra a região designada do ninho com um pedaço quadrado de vidro.
      NOTA: Em caixas pequenas, não há necessidade de designar uma região de ninho inferior. Se as formigas estão negligenciando o uso da região inferior do ninho designada, pode ajudar a cobrir o vidro com um pedaço quadrado de celofane vermelho. Isso dá a impressão de um espaço subterrâneo escuro que se assemelha a ninhos que o H. saltator usa na natureza e pode incentivá-los a mover sua ninhada para a região designada.
2. Alimente as colônias com grilos vivos duas vezes por semana.
   NOTA: As colônias devem ser alimentadas o suficiente para que consumam todos os grilos antes da próxima alimentação. Alimente todas as formigas isoladas e colônias mutantes com grilos pré-picados por trabalhadores de uma colônia regular 2-3 vezes por semana.
3. Aplique água regularmente no piso da caixa de ninho de gesso usando uma garrafa de lavagem.
   NOTA: O gesso deve estar úmido o suficiente para que não pareça empoeirado ao toque, mas deve estar seco o suficiente para que toda a água adicionada seja absorvida pelo gesso. É importante que os ninhos não sejam regados excessivamente. Em média, as caixas de ninho precisarão de uma pequena quantidade de água adicionada uma vez por semana.
4. Sempre que ocorrer a alimentação, remova o lixo e os indivíduos mortos. Congele todos os resíduos e formigas mortas durante a noite a -30 °C antes de descartar esses materiais como lixo comum.
5. Adicione uma pitada de serragem seca às colônias periodicamente; isso ajuda as larvas à medida que passam por pupação e ajuda os trabalhadores a manter a caixa do ninho limpa.

2. Preparação de agulhas de microinjeção de vidro de quartzo

1. Use um extrator de micropipeta para puxar agulhas de microinjeção de vidro.
2. Selecione o vidro a ser puxado. Certifique-se de que o vidro que está sendo usado foi armazenado em um ambiente limpo e livre de poeira.
   NOTA: Aqui, vidro de quartzo filamentoso de paredes finas com um diâmetro externo de 1,0 mm, diâmetro interno de 0,5 mm e comprimento de 7,5 cm tem sido usado para produzir agulhas de microinjeção. Se injetar um embrião de corpo mole, as agulhas de borossilicato também podem ser aplicáveis, mas as agulhas de borossilicato não são capazes de penetrar no córion duro.
3. Defina as configurações de parâmetro do puxador. Use um processo de duas etapas para puxar agulhas de microinjeção para embriões de H. saltator : os parâmetros para a primeira etapa incluem calor de 575, filamento de 3, velocidade de 35, atraso de 145 e uma tração de 75; os parâmetros da segunda etapa incluem calor de 425, filamento de 0, velocidade de 15, atraso de 128 e uma tração de 200. Após a segunda etapa, certifique-se de que a agulha resultante tenha uma conicidade de 2 mm e uma ponta de 0,5 μm (Figura 2).
   NOTA: Este conjunto de parâmetros, juntamente com parâmetros para outros tipos de agulhas, pode ser encontrado no Manual de Operação¹⁷. Os manuais para puxadores de pipeta geralmente fornecem parâmetros recomendados para uma variedade de técnicas. Algumas tentativas e erros podem ser necessários para determinar quais parâmetros geram as melhores agulhas para necessidades específicas. Uma conicidade curta é ideal para injeções de H. saltator, pois pode penetrar no córion duro de embriões de H. saltator. Se injetar um embrião mole, como um que tenha sido decorionado (por exemplo, Drosophila), uma conicidade mais longa em torno de 10 mm pode produzir melhores resultados. Os manuais de operação para puxadores de pipeta geralmente fornecem parâmetros específicos para puxar agulhas adequadas para diferentes necessidades. É importante que as luvas sejam usadas ao manusear filamentos de vidro e puxar agulhas. Óleos de mãos nuas podem ser transferidos para o vidro se as luvas não forem usadas.
4. Uma vez que os parâmetros são definidos, use um extrator de micropipeta para puxar agulhas para microinjeção. Certifique-se de que as agulhas sejam mantidas em um ambiente limpo e livre de poeira até serem usadas.
   NOTA: Recomenda-se o uso de agulhas de microinjeção recém-puxadas. Se forem usadas agulhas pré-puxadas, elas devem ser armazenadas adequadamente em uma caixa para evitar danos nas pontas das agulhas e potencial contaminação. Agulhas que foram submetidas a armazenamento a longo prazo não são recomendadas para injeções de embriões.

3. Preparação do microinjetor

1. Use um microinjetor para injetar os materiais desejados em embriões de formigas.
2. Preparar a mistura de microinjeção de proteínas Cas9 e RNAs guia pequenos sintetizados in vitro (sgRNAs)¹⁰. Mantenha a mistura no gelo até a hora de carregar uma agulha de microinjeção. Quando não estiver a ser utilizada, conservar a mistura de microinjeção a -80 °C.
   NOTA: As concentrações variam em diferentes espécies. Alta concentração pode causar alta mortalidade, enquanto baixa concentração pode reduzir a eficiência. Utilizamos proteínas Cas9 de 0,2 μg/μL e sgRNAs de 0,2 μg/μL para injeção de embriões de H. saltator. O desenho de nossos sgRNAs seguiu um protocolo previamente estabelecido¹⁸. As sequências gênicas foram obtidas de bancos de dados de DNA. A sequência genômica de H. saltator também foi relatada anteriormente^19,20.
3. Ajustar os parâmetros de injeção para embriões de H. saltator : uma pressão de injeção de 140 hectopascal (hPa), uma pressão constante de 70 hPa e um tempo de 0,4 segundos. Ajuste a pressão constante de tal forma que o material flua apenas em uma direção. Ajuste a pressão e o tempo de injeção apenas se nenhum material estiver fluindo da agulha para o embrião.
   NOTA: Se injetar um tipo diferente de embrião, o parâmetro primário que pode mudar é a pressão constante, que é responsável por garantir que o fluido do embrião não flua de volta para a agulha. O volume não é controlado neste protocolo. Definir os parâmetros do microinjetor é suficiente para obter injeções consistentes.
4. Carregue uma agulha de microinjeção com 2 μL da mistura usando as pontas da pipeta do microcarregador. Faça isso lentamente para garantir que nenhuma bolha seja formada na mistura.
   NOTA: Se as bolhas se formarem, pode ser difícil manter microinjeções consistentes.
5. Quebre apenas a ponta da agulha quebrando ao longo da borda da fita de modo que uma conicidade estreita ainda seja mantida. Certifique-se de que a agulha esteja quebrada apenas o suficiente para que a ponta seja aberta, mas não tanto que a conicidade seja quebrada.
   NOTA: É importante ressaltar que, se a abertura da agulha for muito larga após a quebra, o usuário verá o líquido sair da agulha quando montado no microinjetor pressurizado antes da aplicação da pressão de injeção. Alguns protocolos de microinjeção aconselham quebrar agulhas cortando a ponta com uma tesoura. Este método não é aconselhável, pois a tesoura pode fazer com que a ponta da agulha se quebre. Injetar embriões com uma agulha quebrada será altamente prejudicial.
6. Monte a agulha no micromanipulador

4. Injeção de embriões

1. Selecionar embriões para microinjeção a partir do estágio sincicial: o tempo durante o desenvolvimento em que os núcleos se dividem sem citocinese.
   NOTA: Este é o momento ideal durante o desenvolvimento para a edição do genoma por microinjeção, como descoberto anteriormente em Drosophila²¹. Os embriões de H. saltator passam o estágio sincicial e atingem a celularização por volta de 36 h após a deposição do ovo¹⁰. Maior eficiência é alcançada se embriões mais jovens forem usados para injeções.
2. Forre embriões em um pedaço de fita dupla face preso a uma lâmina de microscópio de vidro. Certifique-se de que os embriões estão bem presos à fita para evitar o movimento durante a injeção. Coloque os embriões em uma orientação vertical, de modo que o lado lateral do embrião esteja na borda da fita (Figura 3). Coloque a lâmina e os embriões revestidos no palco do microscópio em uma estação de trabalho de microinjeção designada.
   NOTA: Recomenda-se que os embriões sejam dispostos de tal forma que injeções sucessivas possam ser realizadas movendo a lâmina no estágio, em vez de ajustar a posição da agulha a cada injeção. Isso permite que injeções sucessivas sejam realizadas de forma mais eficiente.
3. Alinhar a agulha com o primeiro embrião a ser injetado com o micromanipulador (Figura 4a).
4. Puncione lateralmente a agulha no primeiro embrião ao longo de seu eixo dorsal/ventral sob um microscópio.
5. Injete a mistura de microinjeção. Procure por um leve movimento do embrião, indicando um aumento na pressão interna devido ao líquido injetado. Além disso, observe a formação de uma pequena gotícula contendo vestígios visíveis de tecido e/ou lipídios na membrana externa do embrião (Figura 4b).
   NOTA: A presença de vestígios de tecido e/ou lipídios na gotícula indica que a agulha perfurou com sucesso a membrana coriônica e vitelina do embrião. Se vestígios desses materiais não estiverem presentes, a injeção não foi realizada com sucesso e deve ser repetida. Após alguns segundos, a gotícula será reabsorvida pelo embrião e não será mais visível.
6. Remova suavemente a agulha do embrião imediatamente e prossiga para a próxima, ajustando a posição da lâmina do microscópio. Repetir até que todos os embriões tenham sido injetados.
7. Uma vez que todos os embriões na lâmina tenham sido injetados com sucesso, transfira a lâmina para uma caixa úmida por 1 hora para dar aos embriões tempo para se recuperarem do processo de injeção antes de serem removidos da lâmina.

5. Criação de embriões injectados

1. Após 1 hora de incubação em uma caixa úmida, remova suavemente os embriões injetados da fita usando pinças de peso pena e transfira-os para um tubo cheio com uma pequena quantidade de etanol a 70%. Inverta o tubo várias vezes para transferir os embriões para o fundo do tubo. Repita a lavagem com etanol uma vez, seguida de três lavagens com água autoclavada.
2. Usando um pincel pequeno e macio, transfira todos os embriões injetados para placas de ágar a 1% com 2% de antibiótico-antimicótico. Aplique o antibiótico-antimicótico depois que as placas de ágar derramadas esfriarem, espalhando-se sobre a superfície da placa usando um espalhador de células. Sele a placa de ágar com parafilme para evitar a dessecação do ágar.
   NOTA: Não tente devolver embriões injetados a uma colónia após injeções, uma vez que os trabalhadores podem destruir a maioria dos embriões injetados. A sobrevivência é, portanto, otimizada, permitindo que os embriões se desenvolvam em placas de ágar fora de um ambiente de colônia normal.
3. Incubar as placas de ágar a 25 °C durante aproximadamente 4 semanas. Verifique regularmente se há eclosão.
4. Uma vez que o primeiro embrião tenha eclodido em uma larva, devolva todos os embriões e larvas a uma caixa de ninho com alguns jovens trabalhadores de enfermagem para cuidar dos filhotes. Alimentar usando grilos pré-picados por uma colônia maior do tipo selvagem, remover resíduos e adicionar água seguindo o mesmo protocolo discutido na Seção 1.
   NOTA: Pequenas caixas (9,5 x 9,5 cm²) são ideais para essas colônias. H. saltator se reproduz bem em cativeiro. Portanto, embriões mutantes podem ser criados até a idade adulta. O isolamento do(s) adulto(s) mutante(s) induz a transição para o estágio de gamergate reprodutivo. Cruzamentos controlados são utilizados para estabelecer colônias mutantes com indivíduos heterozigotos ou homozigotos (Figura 5).

Resultados

Usando o protocolo fornecido aqui, a edição do genoma em embriões de saltadores de Harpegnathos foi realizada com sucesso. Estes resultados foram validados através de reação em cadeia da polimerase e clonagem pGEM de DNA extraído de embriões injetados seguido de sequenciamento de DNA. A eficiência da mutagênese somática utilizando este protocolo atingiu aproximadamente 40%. Machos mutantes F1 foram acasalados com fêmeas do tipo selvagem para produzir fêmeas F2 hetero...

Discussão

A evolução da eussocialidade entre insetos, incluindo formigas, abelhas, vespas e cupins, resultou no aparecimento de novos traços comportamentais e morfológicos, muitos dos quais são entendidos como influenciados por uma combinação de fatores ambientais e genéticos 1,2,3,4. Infelizmente, a atratividade e a utilidade dos insetos eussociais como modelos de pesquisa no campo da genética ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030