胚胎注射用于CRISPR介导的诱变在蚂蚁Harpegnathos盐化剂中

摘要

昆虫真社会性的许多特征依赖于殖民地内的交流和分工。通过显微注射和CRISPR介导的诱变对蚂蚁胚胎中关键调控基因的遗传操作为真社会昆虫利他行为的本质提供了见解。

摘要

真社会性昆虫的独特性状，如社会行为和生殖分工，受其遗传系统控制。为了解决基因如何调节社会性状的问题，我们通过在合胞阶段将CRISPR复合物递送到年轻胚胎中来开发突变蚂蚁。在这里，我们提供了Harpegnathos saltator中CRISPR介导的诱变方案， Harpegnathos盐酸盐是一种具有显着表型可塑性的ponerine ant物种。 盐蚂蚁 很容易在实验室环境中饲养。收集胚胎用于用Cas9蛋白显微注射，并使用自制石英针在 体外 合成小向导RNA（sgRNA）。注射后胚胎在菌落外饲养。在第一批幼虫出现后，所有胚胎和幼虫都被运送到一个巢箱中，由一些护理人员进行进一步发育。该协议适用于诱导诱变，以分析蚂蚁的种姓特异性生理和社会行为，但也可以应用于更广泛的膜翅目动物和其他昆虫。

引言

昆虫的真社会性进化，即膜翅目和Blottodea目（以前称为等翅目）的进化，导致了独特且通常复杂的行为特征，这些特征在个体和群体水平上都表现出来。生殖分工是最先进的社会昆虫群体的特征，通常涉及由几个行为上和通常形态上不同的群体组成的种姓系统。种姓之间的这种行为和形态多样性不仅受其遗传系统的控制，而且通常^{受环境控制}1，²，³，^4，使真社会昆虫成为遗传和表观遗传研究的有吸引力的对象。

操纵真社会昆虫遗传系统的能力已被证明具有挑战性，因为许多物种不在实验室环境中交配和繁殖。大多数真社会昆虫在一个群体中的生殖个体也很少，限制了可以产生的后代数量，从而限制了遗传操作的样本量⁵。此外，与通常用于遗传研究的昆虫（如 果蝇）相比，许多真社会昆虫的生成时间较长，增加了建立^遗传系的难度5。然而，一些真社会物种可以在殖民地中产生很大比例的生殖活跃个体，这减轻了挑战并为建立突变或转基因系提供了机会。

就蚂蚁种类Harpegnathos saltator而言，所有女性工人都可以在蜂王死亡或社会孤立时变得生殖活跃。这些工人被称为"玩家门"，可用于生成新的殖民地⁶。此外，一个群体中可能存在多个玩家门，从而增加后代产量⁵，^7，8。到目前为止，已经在欧洲蜜蜂Apis mellifera和蚂蚁物种H. saltator，Ooceraea biroi和Solenopsis invicta⁹，^10，11，¹²，¹³，^14，15中开发了突变和/或转基因品系。.对群居蜜蜂和蚂蚁的遗传分析为更好地理解真社会性铺平了道路，为研究基因及其对真社会昆虫行为和种姓特定生理学的影响提供了一系列机会。

在这里，我们提供了一个通过H . saltator中的CRISPR / Cas9系统进行基因修饰的方案。具体来说，该技术用于在orco中产生种系突变， orco是编码所有气味受体（OR）的专性共受体的基因¹⁰。 OR 基因在膜翅目真社会昆虫中显著扩增¹⁶， orco 在昆虫嗅觉中起重要作用;如果没有它，手术室不会正常组装或运行。因此， orco 基因的突变会破坏嗅觉，神经发育和相关的社会^行为9，10。

在该协议中，使用显微注射将Cas9蛋白和小向导RNA（sgRNA）引入蚂蚁胚胎中，以诱导靶基因的诱变。在这里，我们将详细描述显微注射程序以及有关菌落和注射胚胎护理的说明。这些方法适用于诱导 盐蚂 蚁中各种不同基因的诱变，并且可以应用于更广泛的膜翅目昆虫。

研究方案

1. 定期维护 哈伯纳索斯盐菌 菌落

1. 在22-25°C和12小时光照:12小时黑暗（12L:12D）照明时间表的蚂蚁饲养室的透明塑料盒中保持H . saltator 的野生型菌落。
   1. 使用小箱子（9.5 x 9.5 cm²）饲养个体工蜂或小蜂群。使用中等箱子（19 x 13.5 cm 2）或大箱子（27 x 19 cm²）来培养较大的菌落（图1）。
   2. 要创建巢箱，请使用石膏为巢箱铺地板。当湿石膏在介质和大盒子中干燥时，将泡沫块压入石膏中，深度为几厘米，距离盒子背面几厘米，以指定较低的巢穴区域。石膏干燥后，用一块方形玻璃覆盖指定的巢穴区域。
      注意:在小盒子中，无需指定较低的巢穴区域。如果蚂蚁忽略了使用指定的下巢区域，则用一块方形的红色玻璃纸覆盖玻璃杯可能会有所帮助。这给人的印象是一个黑暗的地下空间，类似于 H. saltator 在野外使用的巢穴，并可能鼓励它们将育雏移动到指定区域。
2. 每周两次用活蟋蟀喂养殖民地。
   注意:菌落的喂食量应足以在下次喂食之前消耗掉所有蟋蟀。每周用常规蚁群的工人预先蜇伤的蟋蟀喂养任何孤立的蚂蚁和突变蚁群 2-3 次。
3. 使用洗手瓶定期将水涂抹在石膏巢箱地板上。
   注意:石膏应足够湿润，摸起来不会有灰尘，但应该足够干燥，以便所有添加的水都被石膏吸收。重要的是不要过度浇水。平均而言，巢箱每周需要添加一次少量水。
4. 每当喂食时，清除垃圾和死人。将所有废物和死蚂蚁在-30°C下冷冻过夜，然后将这些材料作为普通垃圾处理。
5. 定期向菌落中添加一小撮干锯末;这有助于幼虫化蛹，并帮助工人保持巢箱清洁。

2.石英玻璃显微注射针的制备

1. 使用微量移液器拉拔玻璃显微注射针。
2. 选择要拉动的玻璃杯。确保所使用的玻璃已存放在无尘和清洁的环境中。
   注意:这里使用外径为1.0毫米，内径为0.5毫米，长度为7.5厘米的薄壁丝状石英玻璃来生产显微注射针。如果注射软体胚胎，硼硅酸盐针头也可能适用，但硼硅酸盐针头无法穿透硬绒毛膜。
3. 设置拉拔器的参数设置。使用两步过程为盐 化嗜盐者 胚胎拉显微注射针:第一步的参数包括热量575，细丝3，速度35，延迟145和拉力75;第二步的参数包括425的热量，0的灯丝，15的速度，128的延迟和200的拉力。在第二步之后，确保所得针具有2 mm锥度和0.5μm的尖端（图2）。
   注意:这组参数以及其他针型的参数可以在操作手册¹⁷ 中找到。移液器拉拔器手册通常为各种技术提供推荐参数。可能需要进行一些试验和错误来确定哪些参数可以产生满足特定需求的最佳针头。短锥度是盐化嗜盐剂注射的理想选择，因为它可以穿透盐化嗜盐者胚胎的硬绒毛膜。如果注射软胚胎，例如已经去皮的胚胎（例如果蝇），大约 10 毫米的较长锥度可能会产生更好的结果。移液器拉拔器的操作手册通常提供适合不同需求的拉针的具体参数。在处理玻璃丝和拉针时戴手套很重要。如果不戴手套，裸手的油可能会转移到玻璃上。
4. 设置参数后，使用微量移液器拉动用于显微注射的针头。确保针头在使用前保持在无尘和清洁的环境中。
   注意:建议使用新鲜拉动的显微注射针。如果使用预拉针，应将其妥善存放在盒子中，以防止针尖损坏和潜在污染。不建议将经过长期储存的针头用于胚胎注射。

3.微量注射器的制备

1. 使用显微注射器将所需的材料注射到蚂蚁胚胎中。
2. 制备Cas9蛋白和 体外 合成的小向导RNA（sgRNA）的显微注射混合物¹⁰。将混合物放在冰上，直到需要装入显微注射针头。不使用时，将显微注射混合物储存在-80°C。
   注意:不同物种的浓度不同。高浓度可能导致高死亡率，而低浓度可能会降低效率。我们使用 0.2 μg/μL Cas9 蛋白和 0.2 μg/μL sgRNA 进行 H. 盐剂 胚胎注射。我们的sgRNA的设计遵循先前建立的方案¹⁸。基因序列是从DNA数据库中获得的。 H. saltator 的基因组序列先前也报道过^19，20。
3. 调整 盐化杆菌 胚胎的注射参数:注射压力为140百帕（hPa），恒定压力为70 hPa，时间为0.4秒。调整恒定压力，使材料仅沿一个方向流动。仅当没有材料从针头流入胚胎时，才调整注射压力和时间。
   注意:如果注射不同类型的胚胎，可能改变的主要参数是恒定压力，它负责确保胚胎中的液体不会流回针头。此协议中不控制音量。设置微量注射器的参数足以获得一致的注射。
4. 使用微量加载器移液器吸头将显微注射针头装入 2 μL 混合物。慢慢地这样做，以确保混合物中不会形成气泡。
   注意:如果形成气泡，可能难以保持一致的显微注射。
5. 沿着胶带的边缘折断，仅折断针尖，使其仍保持窄锥度。确保针头断裂到足以打开尖端的程度，但不要太过严重，以至于锥度断裂。
   注意:重要的是，如果针头断裂后开口太宽，则在施加注射压力之前，用户将看到液体在安装到加压微量注射器时从针头中流出。一些显微注射方案建议通过用剪刀剪断尖端来断针。不建议使用此方法，因为剪刀可能会导致针尖破碎。用破碎的针头注射胚胎将具有极大的破坏性。
6. 将针头安装到显微操纵器上

4. 胚胎注射

1. 从合胞期选择胚胎进行显微注射:细胞核分裂而没有细胞分裂的发育时间。
   注意:这是通过显微注射进行基因组编辑开发过程中的理想时间，如之前在 果蝇²¹中发现的那样。 H. saltator 胚胎通过合胞期，并在卵子沉积¹⁰后约36小时达到细胞化。如果使用较年轻的胚胎进行注射，则可实现更高的效率。
2. 将胚胎放在粘在玻璃显微镜载玻片上的一段双面胶带上。确保胚胎很好地固定在胶带上，以防止注射过程中移动。将胚胎垂直放置，使胚胎的侧侧位于胶带的边缘（图3）。将载玻片和衬里的胚胎放在指定的显微注射工作站的显微镜载物台上。
   注意:建议将胚胎布置成可以通过在载物台上移动载玻片而不是每次注射时调整针头位置来进行连续注射。这样可以更有效地进行连续进样。
3. 使用显微操纵器将针头与要注射的第一个胚胎对齐（图4a）。
4. 在显微镜下沿其背/腹轴横向刺穿针头进入第一个胚胎。
5. 注入显微注射混合物。寻找胚胎的轻微运动，表明由于注射的液体而导致内部压力增加。此外，注意胚胎外膜上含有可见组织和/或脂质痕迹的小液滴的形成（图4b）。
   注意:液滴中存在微量组织和/或脂质表明针已成功刺穿胚胎的绒毛膜和卵黄膜。如果不存在这些材料的痕迹，则注射未成功进行，应重复注射。几秒钟后，液滴将被胚胎重新吸收，不再可见。
6. 立即轻轻地从胚胎中取出针头，然后通过调整显微镜载玻片的位置进行下一个针头。重复直到所有胚胎都被注射。
7. 成功注射载玻片上的所有胚胎后，将载玻片转移到潮湿的盒子中1小时，以使胚胎有时间从注射过程中恢复，然后再从载玻片中取出。

5. 注射胚胎的饲养

1. 在潮湿的盒子中孵育1小时后，使用轻量级镊子轻轻地将注射的胚胎从胶带中取出，并将它们转移到装有少量70%乙醇的管中。将试管倒置几次，将胚胎转移到试管底部。重复乙醇洗涤一次，然后用高压灭菌的水洗涤三次。
2. 使用小而柔软的画笔，将所有注射的胚胎转移到含有2%抗生素 - 抗真菌剂的1%琼脂平板上。倒入琼脂平板冷却后，通过使用细胞扩散器在平板表面铺展，施用抗生素 - 抗真菌剂。用封口膜密封琼脂平板以防止琼脂干燥。
   注意:注射后不要试图将注射的胚胎返回菌落，因为工人可能会破坏大多数注射的胚胎。因此，通过允许胚胎在正常菌落环境之外的琼脂平板上发育来优化存活。
3. 将琼脂平板在25°C孵育约4周。定期检查剖面线。
4. 一旦第一个胚胎孵化成幼虫，将所有胚胎和幼虫放回巢箱，由一些年轻的护士来照顾幼崽。使用被较大的野生型菌落预先蜇伤的蟋蟀喂食，去除废物，并按照第 1 节中讨论的相同方案加水。
   注意:小盒子（9.5 x 9.5 cm²）是此类菌落的理想选择。H. saltator 在圈养中繁殖良好。因此，突变胚胎可以养到成年。突变成虫的分离诱导过渡到生殖玩家门阶段。受控杂交用于与杂合或纯合个体建立突变菌落（图5）。

结果

使用此处提供的协议，成功地在 Harpegnathos盐胚胎 中进行基因组编辑。这些结果通过聚合酶链反应和pGEM克隆从注射胚胎中提取的DNA进行验证，然后进行DNA测序。使用该协议的体细胞诱变效率达到约40%。F1突变雄性与野生型雌配以产生杂合的F2雌性，如果不交配，则产生F3雄性。突变的F3雄性与杂合雌配以产生F4纯合突变雌性。通过这些F4纯合子女性个体的质谱进一步确?...

讨论

昆虫（包括蚂蚁，蜜蜂，黄蜂和白蚁）之间真社会性的进化导致了新的行为和形态特征的出现，其中许多被认为受到环境和^{遗传因素的组合}影响1，²，^3，4。不幸的是，真社会昆虫作为遗传学领域研究模型的吸引力和有用性受到与该群体中诱变相关的困难的阻碍。这种障碍是由于生殖分工而发生的，这...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030