アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

要約

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。

要約

社会的行動や生殖分業などの真社会性昆虫のユニークな形質は、その遺伝子システムによって制御されています。遺伝子が社会的形質をどのように制御するかを調べるために、私たちはCRISPR複合体を若い胚の合胞期に送達することを介して変異アリを開発しました。ここでは、顕著な表現型の可塑性を示すポネリンアリ種である ハルペグナトスソルテーターにおけるCRISPRを介した突然変異誘発のプロトコルを提供します。 H.ソルテーター アリは実験室環境で容易に飼育されます。胚は、Cas9タンパク質によるマイクロインジェクションのために収集され、自家製の石英針を使用して in vitro で合成された低分子ガイドRNA(sgRNA)です。注射後の胚はコロニーの外で飼育されます。最初の幼虫の出現後、すべての胚と幼虫は、さらなる発達のために数人の看護労働者と一緒に巣箱に運ばれます。このプロトコルは、アリのカースト特異的な生理学や社会的行動の分析のための突然変異誘発を誘発するのに適していますが、膜翅目や他の昆虫のより広いスペクトルにも適用できます。

概要

昆虫の真社会性の進化、すなわち膜翅目とブラットデア目(旧等翅目)の進化は、個体レベルとコロニーレベルの両方で現れる独特でしばしば洗練された行動形質をもたらしました。社会性昆虫の最も進んだグループを特徴付ける特性である生殖分業には、多くの場合、いくつかの行動的およびしばしば形態学的に特徴的なグループで構成されるカーストシステムが含まれます。カースト間のこのような行動的および形態学的多様性は、その遺伝システムだけでなく、しばしば環境によっても制御されており1,2,3,4、真社会性昆虫を遺伝的およびエピジェネティックな研究にとって魅力的な対象にしています。

真社会性昆虫の遺伝システムを操作する能力は、多くの種が実験室の設定で交尾および繁殖しないため、困難であることが証明されています。ほとんどの真社会性昆虫はまた、コロニー内に生殖個体が非常に少ないため、生産できる子孫の数が制限され、その結果、遺伝子操作のサンプルサイズが制限されます⁵。さらに、多くの真社会性昆虫は、遺伝学的研究に一般的に使用される昆虫( ショウジョウバエなど)と比較して発生時間が長く、遺伝子系統を確立することが困難になっています⁵。しかし、一部の真社会性種は、コロニー内で生殖活動的な個体の大部分を生成する可能性があり、これにより課題が軽減され、突然変異株またはトランスジェニック系統を確立する機会が提供されます。

ポネリンアリ種であるハルペグナトスソルテーターの場合、すべての女性労働者は、女王の死または社会的孤立時に生殖活動的になる可能性があります。これらのワーカーは「ゲーマーゲート」と呼ばれ、新しい^{コロニー6}を生成するために使用できます。さらに、コロニー内に複数のゲーマーゲートが存在する可能性があり、したがって子孫の生産が増加する^5、7、8。これまでに、ヨーロッパミツバチのApis mellifera、およびアリの種であるH. saltator、Ooceraea biroi、およびSolenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15で変異株および/またはトランスジェニック系統が開発されています。.社会性ミツバチとアリの遺伝子分析は、真社会性のより良い理解への道を開き、遺伝子とそれらが真社会性昆虫の行動とカースト固有の生理学に与える影響を研究する一連の機会を提供しました。

ここでは、H.ソルテーターのCRISPR/Cas9システムを介した遺伝子組み換えのプロトコルを提供します。具体的には、この手法を使用して、すべての匂い受容体(OR)の絶対補助受容体をコードする遺伝子であるorcoに生殖細胞系列変異を生成しました¹⁰。膜翅目の真社会性昆虫ではOR遺伝子が著しく拡大しており¹⁶、オルコは昆虫の嗅覚に不可欠な役割を果たしています。それがない場合、ORは正常に組み立てられないか機能しません。したがって、オルコ遺伝子の突然変異は、嗅覚、神経発達、および関連する社会的行動を混乱させます^9,10。

このプロトコルでは、Cas9タンパク質と低分子ガイドRNA(sgRNA)を、標的遺伝子の突然変異誘発を誘導する目的で、マイクロインジェクションを使用してアリ胚に導入します。ここでは、コロニーや注入された胚のケアに関する指示とともに、マイクロインジェクションの手順について詳しく説明します。これらの方法は、 H. saltator アリの様々な異なる遺伝子における突然変異誘発を誘導するのに適切であり、より広いスペクトルの膜翅目昆虫に適用され得る。

プロトコル

1. ハルペグナトス塩析 コロニーの定期的なメンテナンス

1. H. saltatorの野生型コロニーをアリ飼育室の透明なプラスチックの箱に入れて、22〜25°C、日長12時間の光:12時間の暗(12L:12D)照明スケジュールで維持します。
   1. 小さな箱(9.5 x 9.5 cm²)を使用して、個々の労働者または小さなコロニーを育てます。より大きなコロニーを後方にするには、中型の箱(19 x 13.5 cm 2)または大きな箱(27 x 19 cm²)を使用します(図1)。
   2. 巣箱を作成するには、石膏を使用して箱の床を作ります。湿った石膏が中型箱と大きな箱の中で乾いているので、箱の後ろから数センチの深さと数センチの石膏にフォームブロックを押して、下の巣の領域を指定します。石膏が乾いたら、指定された巣の領域を正方形のガラス片で覆います。
      注:小さなボックスでは、下のネスト領域を指定する必要はありません。アリが指定された下の巣領域の使用を怠っている場合は、赤いセロハンの正方形の部分でガラスを覆うのに役立つ場合があります。これは、 H. saltator が野生で使用する巣に似た暗い地下空間の印象を与え、指定された地域に移動するように促す可能性があります。
2. 週に2回、生きたコオロギでコロニーに餌をやる。
   注:コロニーは、次の給餌の前にすべてのコオロギを消費するのに十分な給餌を行う必要があります。隔離されたアリと突然変異アリのコロニーに、通常のコロニーの労働者によって事前に刺されたコオロギを毎週2〜3回与えます。
3. 洗浄ボトルを使用して、石膏巣箱の床に定期的に水を塗ります。
   注意: 石膏は、触ってもほこりを感じないように十分に湿っている必要がありますが、追加されたすべての水が石膏に吸収されるように十分に乾燥している必要があります。巣に過度に水をやらないことが重要です。平均して、巣箱は週に一度少量の水を追加する必要があります。
4. 給餌が行われるときはいつでも、ゴミや死んだ人を取り除きます。すべての廃棄物と死んだアリを-30°Cで一晩凍結してから、これらの材料を通常のゴミとして処分します。
5. 乾燥したおがくずのピンチを定期的にコロニーに追加します。これは、幼虫が蛹化を受けるのを助け、労働者が巣箱を清潔に保つのに役立ちます。

2.石英ガラスマイクロインジェクションニードルの調製

1. マイクロピペットプーラーを使用して、ガラスマイクロインジェクションニードルを引きます。
2. 引っ張るガラスを選択します。使用するガラスがほこりのない清潔な環境で保管されていることを確認してください。
   注:ここでは、外径1.0 mm、内径0.5 mm、長さ7.5 cmの薄肉糸状石英ガラスを使用してマイクロインジェクション針を製造しています。柔らかい体の胚を注入する場合、ホウケイ酸針も適用できますが、ホウケイ酸針は硬い絨毛膜を貫通できません。
3. プーラーのパラメータ設定を行います。 H.ソルテーター 胚のマイクロインジェクション針を引くために2段階のプロセスを使用します:最初のステップのパラメータには、575の熱、3のフィラメント、35の速度、145の遅延、および75の引っ張りが含まれます。2番目のステップのパラメータには、熱425、フィラメント0、速度15、遅延128、およびプル200が含まれます。2番目のステップに続いて、得られた針のテーパーが2 mm、先端が0.5 μmであることを確認します(図2)。
   注意: この一連のパラメーターは、他の針タイプのパラメーターとともに、操作マニュアル¹⁷に記載されています。ピペットプーラーのマニュアルには、さまざまな技術に推奨されるパラメータが記載されていることがよくあります。どのパラメータが特定のニーズに最適な針を生成するかを決定するには、試行錯誤が必要になる場合があります。短いテーパーは、H.ソルテーター胚の硬い絨毛膜に浸透できるため、H.ソルテーター注射に最適です。脱絨毛性胚(ショウジョウバエなど)などの柔らかい胚を注入する場合は、約10 mmのテーパーを長くすると、より良い結果が得られる可能性があります。ピペットプーラーの操作マニュアルには、通常、さまざまなニーズに適した針を引っ張るための特定のパラメータが記載されています。ガラスフィラメントを取り扱ったり針を引っ張ったりするときは、手袋を着用することが重要です。手袋を着用しないと、素手の油がガラスに移ることがあります。
4. パラメータを設定したら、マイクロピペットプーラーを使用してマイクロインジェクション用の針を引きます。使用するまで、針がほこりのない清潔な環境に保管されていることを確認してください。
   注意: 引きたてのマイクロ注射針を使用することをお勧めします。事前に引っ張られた針を使用する場合は、針先の損傷や潜在的な汚染を防ぐために、箱に適切に保管する必要があります。長期保存を受けた針は胚注射にはお勧めできません。

3.マイクロインジェクターの調製

1. マイクロインジェクターを使用して、アリの胚に目的の材料を注入します。
2. Cas9タンパク質と in vitro 合成低分子ガイドRNA(sgRNA)のマイクロインジェクション混合物を調製します¹⁰。マイクロインジェクションニードルをロードするまで、混合物を氷上に置いておきます。使用しないときは、マイクロインジェクション混合物を-80°Cで保存してください。
   注:濃度は種によって異なります。高濃度は高い死亡率を引き起こす可能性があり、低濃度は効率を低下させる可能性があります。H.ソルテーター胚注入には、0.2 μg/μLのCas9タンパク質と0.2 μg/μL sgRNAを使用しています。我々のsgRNAの設計は、以前に確立されたプロトコル¹⁸に従った。遺伝子配列はDNAデータベースから取得した。H.ソルテーターのゲノム配列も以前に報告されています^19,20。
3. H. saltator胚の注入パラメータを調整します:注入圧力140ヘクトパスカル(hPa)、一定圧力70hPa、および 0.4 秒の時間。材料が一方向にのみ流れるように一定の圧力を調整します。注射圧と時間は、針から胚に物質が流れていない場合にのみ調整してください。
   注:異なる種類の胚を注射する場合、変化する可能性のある主なパラメータは一定の圧力であり、胚からの液体が針に逆流しないようにする責任があります。このプロトコルでは、ボリュームは制御されません。マイクロインジェクターのパラメータを設定するだけで、一貫した注入を得ることができます。
4. マイクロローダーピペットチップを使用して、2 μLの混合物を含むマイクロインジェクションニードルをロードします。混合物をゆっくりと行い、気泡が形成されないようにします。
   注:気泡が形成されると、一貫したマイクロインジェクションを維持するのが難しい場合があります。
5. 狭いテーパーが維持されるようにテープの端に沿って折ることによって、針の先端だけを折ってください。針が先端が開くのに十分なだけ折れていることを確認してくださいが、テーパーが折れるほどではありません。
   注意: 重要なことに、折れた後の針の開口部が広すぎると、射出圧力をかける前に加圧されたマイクロインジェクターに取り付けると、ユーザーが針から液体がなくなるのがわかります。一部のマイクロインジェクションプロトコルでは、ハサミで先端を切って針を折ることを勧めています。はさみは針の先端を粉砕する可能性があるため、この方法はお勧めしません。粉々になった針で胚を注射すると、非常に損傷を与えます。
6. 針をマイクロマニピュレーターに取り付けます

4.胚の注入

1. 合胞体期からマイクロインジェクション用の胚を選択します:細胞質分裂なしで核が分裂する発生中の時間。
   注:これは、 ショウジョウバエ²¹で以前に発見されたように、マイクロインジェクションによるゲノム編集の開発中の理想的な時期です。 H.ソルテーター 胚は合胞期を通過し、産卵後36時間頃に細胞化に達します¹⁰。若い胚を注射に使用すると、より高い効率が達成されます。
2. ガラス顕微鏡スライドに貼り付けた両面テープの上に胚を並べる。注射中の動きを防ぐために、胚がテープにしっかりと固定されていることを確認してください。胚の外側がテープの端になるように、胚を垂直方向に置きます(図3)。スライドと裏打ちされた胚を、指定されたマイクロインジェクションワークステーションの顕微鏡のステージに置きます。
   注:注射のたびに針の位置を調整するのではなく、ステージ上でスライドを動かすことで連続注入を行えるように胚を配置することをお勧めします。これにより、連続した注入をより効率的に行うことができます。
3. マイクロマニピュレーターを使用して、注射する最初の胚に針を合わせます(図4a)。
4. 顕微鏡下で背側/腹側軸に沿って最初の胚に針を横方向に穿刺します。
5. マイクロインジェクション混合物を注入します。注入された液体による内圧の上昇を示す、胚のわずかな動きを探します。さらに、胚の外膜に目に見える痕跡の組織および/または脂質を含む小さな液滴が形成されるのを観察します(図4b)。
   注:液滴に微量の組織および/または脂質が存在する場合は、針が胚の絨毛膜と卵子膜の両方に正常に穴を開けたことを示しています。これらの材料の痕跡が存在しない場合、注入は正常に実行されなかったため、繰り返す必要があります。数秒後、液滴は胚に再吸収され、見えなくなります。
6. すぐに胚から針をそっと外し、顕微鏡スライドの位置を調整して次へ進みます。すべての胚が注入されるまで繰り返します。
7. スライド上のすべての胚が正常に注入されたら、スライドを湿潤ボックスに移して1時間、スライドから取り出す前に胚が注入プロセスから回復する時間を与えます。

5.注入胚の飼育

1. 湿った箱の中で1時間インキュベートした後、フェザー級鉗子を使用して注入された胚をテープから静かに取り除き、少量の70%エタノールで満たされたチューブに移します。チューブを数回反転させて、胚をチューブの底に移します。エタノール洗浄を1回繰り返し、続いてオートクレーブ水で3回洗浄する。
2. 小さくて柔らかい絵筆を使用して、注入したすべての胚を2%抗生物質-抗真菌剤を含む1%寒天プレートに移します。寒天プレートを注いだ後に抗生物質・抗真菌剤を塗布し、セルスプレッダーを用いてプレートの表面に広げて冷却した。寒天プレートをパラフィルムで密封し、寒天の乾燥を防ぎます。
   注:労働者はほとんどの注射された胚を破壊する可能性があるため、注射後に注入された胚をコロニーに戻そうとしないでください。したがって、生存は、胚が通常のコロニー環境外の寒天プレート上で発生することを可能にすることによって最適化される。
3. 寒天プレートを25°Cで約4週間インキュベートします。孵化を定期的に確認してください。
4. 最初の胚が幼虫に孵化したら、すべての胚と幼虫を巣箱に戻して、孵化したばかりの子ガメの世話をするために数人の若い看護師がいます。より大きな野生型のコロニーに刺されたコオロギを使用して餌を与え、老廃物を取り除き、セクション1で説明したのと同じプロトコルに従って水を追加します。
   注:小さな箱(9.5 x 9.5 cm²)はそのようなコロニーに最適です。H.ソルテーター は捕われの身でよく繁殖します。したがって、突然変異胚は成体まで飼育することができる。変異した成体の分離は、生殖ゲーマーゲート段階への移行を誘発します。制御交雑は、ヘテロ接合体またはホモ接合個体を有する変異コロニーを確立するために使用される(図5)。

結果

ここで提供されるプロトコルを使用して、 ハルペグナトスソルテーター 胚のゲノム編集が正常に実行されました。これらの結果は、ポリメラーゼ連鎖反応と注入された胚から抽出されたDNAのpGEMクローニングとそれに続くDNAシーケンシングによって検証されました。このプロトコルを用いた体細胞突然変異誘発の効率は約40%に達した。F1変異体の雄を野生型の?...

ディスカッション

アリ、ハチ、ハチ、シロアリなどの昆虫の真社会性の進化は、新しい行動的および形態学的形質の出現をもたらし、その多くは環境的および遺伝的要因の組み合わせによって影響を受けると理解されています^1,2,3,4。残念ながら、遺伝学の分野における研究モデルとしての真社会性昆虫の魅力と有...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030