アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

要約

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。

要約

社会的行動や生殖分業などの真社会性昆虫のユニークな形質は、その遺伝子システムによって制御されています。遺伝子が社会的形質をどのように制御するかを調べるために、私たちはCRISPR複合体を若い胚の合胞期に送達することを介して変異アリを開発しました。ここでは、顕著な表現型の可塑性を示すポネリンアリ種である ハルペグナトスソルテーターにおけるCRISPRを介した突然変異誘発のプロトコルを提供します。 H.ソルテーター アリは実験室環境で容易に飼育されます。胚は、Cas9タンパク質によるマイクロインジェクションのために収集され、自家製の石英針を使用して in vitro で合成された低分子ガイドRNA(sgRNA)です。注射後の胚はコロニーの外で飼育されます。最初の幼虫の出現後、すべての胚と幼虫は、さらなる発達のために数人の看護労働者と一緒に巣箱に運ばれます。このプロトコルは、アリのカースト特異的な生理学や社会的行動の分析のための突然変異誘発を誘発するのに適していますが、膜翅目や他の昆虫のより広いスペクトルにも適用できます。

概要

昆虫の真社会性の進化、すなわち膜翅目とブラットデア目(旧等翅目)の進化は、個体レベルとコロニーレベルの両方で現れる独特でしばしば洗練された行動形質をもたらしました。社会性昆虫の最も進んだグループを特徴付ける特性である生殖分業には、多くの場合、いくつかの行動的およびしばしば形態学的に特徴的なグループで構成されるカーストシステムが含まれます。カースト間のこのような行動的および形態学的多様性は、その遺伝システムだけでなく、しばしば環境によっても制御されており1,2,3,4、真社会性昆虫を遺伝的およびエピジェネティックな研究にとって魅力的な対象にしています。

真社会性昆虫の遺伝システムを操作する能力は、多くの種が実験室の設定で交尾および繁殖しないため、困難であることが証明されています。ほとんどの真社会性昆虫はまた、コロニー内に生殖個体が非常に少ないため、生産できる子孫の数が制限され、その結果、遺伝子操作のサンプルサイズが制限されます⁵。さらに、多くの真社会性昆虫は、遺伝学的研究に一般的に使用される昆虫( ショウジョウバエなど)と比較して発生時間が長く、遺伝子系統を確....

プロトコル

1. ハルペグナトス塩析 コロニーの定期的なメンテナンス

1. H. saltatorの野生型コロニーをアリ飼育室の透明なプラスチックの箱に入れて、22〜25°C、日長12時間の光:12時間の暗(12L:12D)照明スケジュールで維持します。
   1. 小さな箱(9.5 x 9.5 cm²)を使用して、個々の労働者または小さなコロニーを育てます。より大きなコロニーを後方にするには、中型の箱(19 x 13.5 cm 2)または大きな箱(27 x 19 cm²)を使用します(図1)。
   2. 巣箱を作成するには、石膏を使用して箱の床を作ります。湿った石膏が中型箱と大きな箱の中で乾いているので、箱の後ろから数センチの深さと数センチの石膏にフォームブロックを押して、下の巣の領域を指定します。石膏が乾いたら、指定された巣の領域を正方形のガラス片で覆います。
      注:小さなボックスでは、下のネスト領域を指定する必要はありません。アリが指定された下の巣領域の使用を怠っている場合は、赤いセロハンの正方形の部分でガラスを覆うのに役立つ場合があります。これは、 H. saltator が野生で使用する巣に似た暗い地下空間の印象を与え、指定された地域に移動するように促す可能性があります。
2. 週に2回....

結果

ここで提供されるプロトコルを使用して、 ハルペグナトスソルテーター 胚のゲノム編集が正常に実行されました。これらの結果は、ポリメラーゼ連鎖反応と注入された胚から抽出されたDNAのpGEMクローニングとそれに続くDNAシーケンシングによって検証されました。このプロトコルを用いた体細胞突然変異誘発の効率は約40%に達した。F1変異体の雄を野生型の?.......

ディスカッション

アリ、ハチ、ハチ、シロアリなどの昆虫の真社会性の進化は、新しい行動的および形態学的形質の出現をもたらし、その多くは環境的および遺伝的要因の組み合わせによって影響を受けると理解されています^1,2,3,4。残念ながら、遺伝学の分野における研究モデルとしての真社会性昆虫の魅力と有.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X)	ThermoFisher	15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration	PNA Bio	CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet	Hypogloss Products	B00254CNJA	The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope	Nikon	Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip	BioQuip	4748
FemtoJet ll microinjector	Eppendorf	920010504	This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips	Eppendorf	930001007
NCBI database	National Center for Biotechnology Information	Gene ID: 105183395
P-2000 Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2)	Pioneer Plastics	079C
Plastic boxes (27 X 19 cm2)	Pioneer Plastics	195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2)	Pioneer Plastics	028C
Quartz glass without filament	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm	World Precision Instruments	500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000	Winsor and Newton	5301030