Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول غير الباضع يحفز ارتفاع السكر في الدم في حمار وحشي لمدة تصل إلى 8 أسابيع. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إجراء دراسة متعمقة للآثار الضارة لارتفاع السكر في الدم.

Abstract

حمار وحشي(دانيو ريريو)هي نموذج ممتاز للتحقيق في آثار ارتفاع السكر في الدم المزمن, السمة المميزة لمرض السكري من النوع الثاني (T2DM). هذا البروتوكول الغمر البديل هو غير باضع، خطوة الحكمة طريقة لتحفيز ارتفاع السكر في الدم لمدة تصل إلى ثمانية أسابيع. تتعرض أسماك الحمار الوحشي البالغة بالتناوب للسكر (الجلوكوز) والماء لمدة 24 ساعة لكل منهما. تبدأ سمكة الحمار الوحشي العلاج في محلول الجلوكوز 1٪ لمدة أسبوعين ، ثم حل 2٪ لمدة أسبوعين ، وأخيرا حل 3٪ للأسابيع ال 4 المتبقية. بالمقارنة مع المياه المعالجة (الإجهاد) والضوابط المعالجة مانيتول (التناضح)، وسمك الحمار الوحشي المعالجة بالجلوكوز لديها مستويات أعلى بكثير من السكر في الدم. تظهر سمكة الحمار الوحشي المعالجة بالجلوكوز مستويات السكر في الدم 3 مرات من الضوابط، مما يشير إلى أنه بعد كل من أربعة وثمانية أسابيع يمكن تحقيق ارتفاع السكر في الدم. ارتبط ارتفاع السكر في الدم المستمر بزيادة البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) وزيادة مستويات العامل النووي كابا B (NF-kB) في شبكية العين وانخفاض الاستجابات الفسيولوجية ، وكذلك العجز المعرفي مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه لنمذجة مضاعفات المرض.

Introduction

حمار وحشي (دانيو rerio) سرعان ما تصبح نموذجا حيوانية تستخدم على نطاق واسع لدراسة كل من المرضوالإدراك 1. سهولة التلاعب الجيني والشفافية الجنينية من خلال مراحل النمو المبكرة، وجعلها مرشحا رئيسيا لدراسة الأمراض البشرية مع أساس وراثي معروف. على سبيل المثال، وقد استخدمت حمار وحشي لدراسة متلازمة هولت أورام، اعتلال عضلة القلب، وأمراض الكلى الكبيبات، ضمور العضلات، ومرض السكري (DM) من بين أمراض أخرى1. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نموذج حمار وحشي مثالية بسبب حجم الأنواع الصغيرة، وسهولة الصيانة، و fecundity عالية2،3.

البنكرياس حمار وحشي على حد سواء تشريحيا وعمليا مماثلة لبنكرياس الثدييات4. وهكذا، فإن الخصائص الفريدة للحجم، والخصوبة العالية، وهياكل الغدد الصماء المماثلة تجعل من سمك الحمار الوحشي مرشحا مناسبا لدراسة المضاعفات المرتبطة ب DM. في حمار وحشي، وهناك طريقتان تجريبيتان تستخدم للحث على ارتفاع السكر في الدم لفترات طويلة التي هي سمة من سمات DM: تدفق الجلوكوز (النمذجة نوع 2) ووقف إفراز الأنسولين (النمذجة نوع 1)5،6. تجريبيا, لوقف إفراز الأنسولين, يمكن تدمير البنكرياس β الخلايا كيميائيا باستخدام حقن الستربتوتوسين (STZ) أو Alloxan. وقد استخدمت STZ بنجاح في القوارض والحمار الوحشي, مما أدى إلى مضاعفات المرتبطة اعتلال الشبكية7,8,9, العاهات المعرفية10, وتجديد أطرافه11. ومع ذلك، في حمار وحشي، β الخلايا تجديد بعد العلاج، مما تسبب في "حقن الداعم" من STZ لتكون ضرورية للحفاظ على ظروف السكري12. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة البنكرياس من حمار وحشي6. هذه هي الإجراءات على حد سواء الغازية للغاية، وذلك بسبب الحقن متعددة، ووقت الانتعاش واسعة النطاق.

وعلى العكس من ذلك، يمكن أن يحدث فرط السكر في الدم بشكل غير الباضع من خلال التعرض للجلوكوز الخارجي المنشأ. في هذا البروتوكول، يتم غمر الأسماك في محلول الجلوكوز مركزة للغاية لمدة 24 ساعة5،13 أو باستمرار لمدة 2 أسابيع14،15،16. يتم تناول الجلوكوز الخارجي بشكل عابر ، عن طريق الابتلاع ، و / أو عبر الخياشيم مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات السكر في الدم. وبما أن هذه التقنية غير الغازية لا تعالج مستويات الأنسولين بشكل مباشر ، فلا يمكنها الادعاء بالحث على النوع 2 DM. ومع ذلك، يمكن استخدامه لفحص المضاعفات الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم، والتي هي واحدة من الأعراض الرئيسية للنوع 2 DM.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير pdx1متحولة حمار وحشي-/- عن طريق التلاعب في جين هبوإكس 1 البنكرياس والثنائي ، وهو جين مرتبط بالسبب الوراثي للنوع 2 DM في البشر. باستخدام هذا متحولة, وقد تمكن الباحثون لتكرار اضطراب نمو البنكرياس, ارتفاع نسبة السكر في الدم, ودراسة اعتلال الشبكية السكري الناجم عن فرط السكر في الدم17,18.

في هذه الورقة، نقوم بوصف طريقة تحريضية غير الباضعة التي تستخدم بروتوكول الغمر بالتناوب. يحافظ هذا البروتوكول على ظروف فرط سكر الدم لمدة تصل إلى 8 أسابيع مع ملاحظة المضاعفات اللاحقة. باختصار، يتم وضع حمار وحشي الكبار في محلول السكر لمدة 24 ساعة ومن ثم محلول المياه لمدة 24 ساعة. بدلا من الانغماس المستمر في حلول الجلوكوز الخارجية ، فإن الأيام المتناوبة بين السكر والماء تحاكي ارتفاع وانخفاض نسبة السكر في الدم في مرض السكري. بروتوكول الجلوكوز بالتناوب بالإضافة إلى ذلك يسمح ارتفاع السكر في الدم أن يكون مستحثا لفترات أطول من الزمن، كما حمار وحشي ليست قادرة على تعويض عن ظروف الجلوكوز الخارجية العالية. كدليل على المبدأ، ونحن نقدم بيانات تبين أن فرط السكر في الدم الناجم عن استخدام هذا البروتوكول يغير كيمياء الشبكية وعلم وظائف الأعضاء.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في الجامعة الأمريكية.

1. إعداد دبابات الحل

  1. الحصول على ستة خزانات، واثنين لكل مجموعة تجريبية (الجلوكوز، مانيتول، والماء). تسمية واحدة من اثنين من الدبابات 'خزان الإسكان' (وسوف يضم الأسماك) وتسمية أخرى 'خزان الحل' (وسوف تعقد الحل).
    ملاحظة: مجموعة معالجة مانيتول هي التحكم التناضحي، ومجموعة معالجة المياه هي التحكم في المناولة/ الإجهاد. من المهم الحفاظ على الدبابات وشركات الطيران / airstones والأغطية ولوازم التنظيف منفصلة لكل مجموعة العلاج
  2. استخدم خزان 2 لتر إذا كان إجمالي عدد الأسماك المستخدمة أقل من 20. استخدم خزان 4 لتر إذا كان إجمالي عدد الأسماك المستخدمة أكثر من 20.
    ملاحظة: استخدم N من 5-10 لكل مجموعة معالجة لكل نقطة زمنية لأخذ العينات.
  3. الحفاظ على الخزانات في حمام مائي في 28-29 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة المياه.
  4. في اليوم الأول، ضع السمك في حلول العلاج الخاصة بكل منها (الجلوكوز، مانيتول، الماء) لمدة 24 ساعة ('المياه إلى المعالجة'). في اليوم الثاني، نقل الأسماك من حلول المعالجة الخاصة بها إلى الماء لمدة 24 ساعة ('المعالجة إلى الماء'). في اليوم الثالث، نقل الأسماك من الماء إلى حلول المعالجة ('المياه إلى المعالجة'). يستمر هذا التعرض المتناوب لبقية التجربة (الشكل 1). نقل أسماك التحكم المعالجة بالمياه من الماء إلى الماء يوميا.
  5. تأكد من تغذية الأسماك ونقلها في نفس فترة الساعتان كل يوم طوال مدة التجربة.

2. إعداد السمك

  1. استخدام حمار وحشي الكبار (4 أشهر – 1 سنة)5.
  2. إطعام رقائق تترامين الأرض الأسماك يوميا عند وصوله إلى المختبر.
  3. سجل درجة الحموضة ودرجة حرارة جميع الخزانات وسجل الحالة العامة للأسماك.

3. نقل الأسماك

  1. نقل الأسماك في كل مجموعة معالجة من خزان الإسكان إلى خزان الحل المقابل باستخدام شبكة سمك قياسية.
  2. ضع الخزان الذي يحتوي على السمكة مرة أخرى في حمام الماء ، واستبدل حجر الهواء وغطاء الخزان. هذا الخزان هو الآن "خزان الإسكان" والصهريج الذي كان يحمل السمكة هو الآن "خزان الحل".
  3. تجاهل الحل القديم وتنظيف الخزان، جنبا إلى جنب مع أغطية الخزان، وشركات الطيران، وأحجار الهواء، والشباك لمنع تراكم الجلوكوز والمانيتول.
    ملاحظة: لا تغسل العناصر بالصابون. استخدم الماء وفرشاة/إسفنجة مخصصة لكل حالة علاج لتنظيف الخزانات بشكل صحيح.
  4. جفف "خزانات الحل" التي تم تنظيفها حديثا بمنشفة ورقية. إعداد الحلول لليوم التالي باستخدام هذا الخزان. تأكد من تجفيف العناصر الأخرى وفصلها من قبل مجموعات العلاج المناسبة.
    ملاحظة: الاحتفاظ بسجل للحلول التي يتم نقل الأسماك من وإلى كل يوم، وكذلك الحلول التي يتم إعدادها لليوم التالي. على سبيل المثال: الأسماك المنقولة من الجلوكوز إلى H2O، حل الجلوكوز الجديد 1٪ أعدت ليوم غد.

4. إعداد حلول ما بعد النقل

  1. إعداد حلول السكر
    1. ملء كل خزان حل مع 2 لتر (أو 4 لتر) من مياه النظام (يعرف نظام المياه والمياه التي تم علاجها مع النسبة الصحيحة من محلول الملح، وهي في نفس درجة حرارة المخزون وخزانات المعالجة).
    2. قياس الكمية الصحيحة من الجلوكوز والمانيتول (انظر الخطوة 5 أدناه) باستخدام مقياس التحميل العلوي وقوارب وزن منفصلة لكل مادة كيميائية.
    3. إضافة الجلوكوز وزنها أو مانيتول aliquot إلى المناسبة، خزان الحل تنظيفها، والذي يحتوي على مياه النظام فقط.
    4. يحرك محلول الجلوكوز والمانيتول بقضبان زجاجية منفصلة حتى تذوب السكريات تماما.
    5. عودة خزانات حل لحمام المياه وتغطية مع الأغطية المقابلة لها.
  2. إعداد حلول المياه
    1. املأ الخزانات التجريبية (2 لتر أو 4 لتر) بماء النظام.
    2. إعادة هذه "خزانات الحل" إلى حمام المياه وتغطية مع الأغطية المقابلة لها.

5. تغيير النسب المئوية

  1. الحفاظ على الأسماك في محلول 1٪ خلال أول أسبوعين من العلاج: 40 غرام من الجلوكوز أو مانيتول في خزان 4 لتر.
  2. الحفاظ على الأسماك في محلول 2٪ خلال الأسبوعين 3 و 4 من العلاج: 80 غرام من الجلوكوز أو مانيتول في خزان 4 لتر.
  3. الحفاظ على الأسماك في حل 3٪ للأسابيع 4 النهائي للعلاج: 120 غرام من الجلوكوز أو مانيتول في خزان 4 لتر.

6. قياس مستويات السكر في الدم وجمع الأنسجة

  1. تخدير الأسماك 2 في وقت واحد في حل Tricaine 0.02٪.
  2. قطع رأس السمك مباشرة وراء الخياشيم باستخدام شفرة الحلاقة.
  3. قياس قيمة السكر في الدم.
    ملاحظة: نستخدم مقياس الجلوكوز في الدم (على سبيل المثال، Freestyle Lite) لقياس مستوى السكر في الدم ووضع شريط الاختبار مباشرة على القلب المكشوف (عينة دم القلب).
  4. تشريح الأنسجة المطلوبة من الأسماك (الدماغ والعضلات، وما إلى ذلك).
  5. تخزين الأنسجة التي تم جمعها عن طريق تجميد فلاش على الجليد الجاف وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية، وتحديد في 4٪ paraformaldehyde، أو وضع في محلول عازل للاستخدام الفوري.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 1)، يتم رفع قيم السكر في الدم بشكل ملحوظ بعد كل من 4 أسابيع و 8 أسابيع من العلاج (الشكل 2A)، مع ارتفاع السكر في الدم المعرفة بأنها 3x متوسطات التحكم من كل من المجموعات المعالجة بالماء و mannitol المعالجة. يتم نقل الضوابط المعالجة بالميا...

Discussion

مرض السكري هو مشكلة في جميع أنحاء البلاد. وتشير الدراسات إلى أنه بحلول عام 2030، سيإصابة ما يقدر بنحو 400 مليون شخص بشكل من أشكال مرض السكري. في نماذج القوارض ، تتم دراسة النوع 2 DM باستخدام التلاعب الجيني. في الفئران، والجرذان الدهنية السكري زوكر (ZDF)، والجرذان الدهنية أوتسوكا لونغ إيفانز توكوش?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونود أن نعترف ب VPC و CJR و MCP لتطوير هذا البروتوكول. تلقت EMM الدعم المالي من الجامعة الأمريكية كلية الآداب والعلوم دعم طلاب الدراسات العليا لإجراء هذا البحث. كما تم دعم هذا العمل من خلال جائزة ميلون كلية الجامعة الأمريكية والتمويل من خلال كلية الجامعة الأمريكية للفنون والعلوم (سواء لVPC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Airline Tubingpetsmart5291863This can be used in the tank to circulate air
Airpumppetsmart5094984This can be used in the tank to circulate air
Airstonespetsmart5149683This can be used in the tank to circulate air
D-glucoseSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros OrganicsAC125340050
Freestyle Lite MeterAmazonB01LMOMLTU
Freestyle Lite StripsAmazonB074ZN3H2Z
Netpetsmart5175115
TanksAmazonB0002APZO4

References

  1. Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
  2. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
  4. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  5. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
  6. Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
  7. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
  8. Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
  9. Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
  10. Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
  11. Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).
  12. Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , (2013).
  13. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
  14. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  15. Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
  16. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
  17. Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43 (2020).
  18. Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
  19. Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
  20. Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
  21. Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
  22. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
  23. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
  24. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
  25. Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
  26. Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
  27. Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
  28. Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
  29. Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
  30. Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  31. Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
  32. Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
  33. Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
  34. Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
  35. Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171rerio

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved