Alternatives Eintauchen in Glukose, um eine verlängerte Hyperglykämie bei Zebrafischen zu erzeugen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll induziert nichtinvasiv Hyperglykämie bei Zebrafischen für bis zu 8 Wochen. Mit diesem Protokoll kann eine eingehende Untersuchung der nebenwirkungen von Hyperglykämie durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) sind ein hervorragendes Modell, um die Auswirkungen der chronischen Hyperglykämie, einem Kennzeichen des Typ-II-Diabetes Mellitus (T2DM), zu untersuchen. Dieses alternative Immersionsprotokoll ist eine nichtinvasive, schrittweise Methode zur Induktion von Hyperglykämie für bis zu acht Wochen. Erwachsene Zebrafische werden abwechselnd 24 Stunden lang Zucker (Glukose) und Wasser ausgesetzt. Der Zebrafisch beginnt die Behandlung in einer 1% igen Glukoselösung für 2 Wochen, dann einer 2% igen Lösung für 2 Wochen und schließlich einer 3% igen Lösung für die restlichen 4 Wochen. Im Vergleich zu wasserbehandelten (Stress) und mannitolbehandelten (osmotischen) Kontrollen haben glukosebehandelte Zebrafische signifikant höhere Blutzuckerspiegel. Die mit Glukose behandelten Zebrafische zeigen blutzuckerwerte, die 3-mal so hoch sind wie die der Kontrollen, was darauf hindeutet, dass nach vier und acht Wochen hyperglykämie erreicht werden kann. Anhaltende Hyperglykämie war mit einem erhöhten Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) und einem erhöhten Kernfaktor Kappa B (NF-kB) in der Netzhaut und verminderten physiologischen Reaktionen sowie kognitiven Defiziten verbunden, die darauf hindeuten, dass dieses Protokoll zur Modellierung von Krankheitskomplikationen verwendet werden kann.

Einleitung

Zebrafische (Danio rerio) werden schnell zu einem weit verbreiteten Tiermodell, um sowohl Krankheiten als auch Kognition zu untersuchen¹. Die Leichtigkeit der genetischen Manipulation und die embryonale Transparenz durch die frühen Entwicklungsstadien machen sie zu einem erstklassigen Kandidaten, um menschliche Krankheiten mit einer bekannten genetischen Grundlage zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Zebrafische verwendet, um Holt-Oram-Syndrom, Kardiomyopathien, glomerulozystische Nierenerkrankungen, Muskeldystrophie und Diabetes mellitus (DM) unter anderen^{Krankheiten zu}untersuchen 1 . Darüber hinaus ist das Zebrafischmodell aufgrund der geringen Größe der Art, der Wartungsfreundlichkeit und der hohen Fruchtbarkeit^2,3ideal.

Die Zebrafisch-Bauchspeicheldrüse ist sowohl anatomisch als auch funktionell der Säugetier-Bauchspeicheldrüse ähnlich⁴. So machen die einzigartigen Eigenschaften von Größe, hoher Fruchtbarkeit und ähnlichen endokrinen Strukturen Zebrafische zu einem geeigneten Kandidaten für die Untersuchung von DM-bedingten Komplikationen. Beim Zebrafisch gibt es zwei experimentelle Methoden, um die für DM charakteristische verlängerte Hyperglykämie zu induzieren: einen Zustrom von Glukose (Modellierung Typ 2) und die Beendigung der Insulinsekretion (Modellierung Typ 1)^5,6. Um die Insulinsekretion zu stoppen, können Pankreas- β-Zellen experimentell entweder mit Streptozotocin (STZ) oder Alloxan-Injektionen chemisch zerstört werden. STZ wurde erfolgreich bei Nagetieren und Zebrafischen eingesetzt, was zu Komplikationen im Zusammenhang mit Retinopathie^7,8^,9, kognitiven^{Beeinträchtigungen10}und Gliedmaßenregeneration¹¹führte . Bei Zebrafischen regenerieren sich jedoch β-Zellen nach der Behandlung, was dazu führt, dass "Booster-Injektionen" von STZ notwendig sind, um diabetische^{Erkrankungen aufrechtzuerhalten 12}. Alternativ kann die Bauchspeicheldrüse des Zebrafisches entfernt werden⁶. Dies sind sowohl hochinvasive Verfahren, aufgrund der mehrfachen Injektionen, als auch eine lange Erholungszeit.

Umgekehrt kann Hyperglykämie nichtinvasiv durch Exposition gegenüber exogener Glukose induziert werden. In diesem Protokoll werden Fische für 24 Stunden^5,13 oder kontinuierlich für 2 Wochen 14,^{15, 16}in eine hochkonzentrierte Glukoselösung getaunken. Exogene Glukose wird transdermal, durch Einnahme und/ oder über die Kiemen aufgenommen, was zu erhöhten Blutzuckerspiegeln führt. Da diese nicht-invasive Technik den Insulinspiegel nicht direkt manipuliert, kann sie nicht behaupten, Typ-2-DM zu induzieren. Es kann jedoch verwendet werden, um Komplikationen zu untersuchen, die durch Hyperglykämie induziert werden, die eines der Hauptsymptome von Typ 2 DM ist.

Vor kurzem wurde die Zebrafischmutante pdx1^-/- durch Manipulation des Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox-1-Gens entwickelt, einem Gen, das mit der genetischen Ursache von Typ 2 DM beim Menschen verbunden ist. Mit dieser Mutante konnten Forscher Pankreasentwicklungsstörungen, hohen Blutzucker replizieren und Hyperglykämie-induzierte diabetische Retinopathie^{untersuchen 17,18}.

In diesem Artikel beschreiben wir eine nichtinvasive Hyperglykämie-Induktionsmethode, die ein alternierendes Immersionsprotokoll verwendet. Dieses Protokoll hält hyperglykämische Zustände für bis zu 8 Wochen aufrecht, wobei nachfolgende Komplikationen beobachtet werden. Kurz gesagt, erwachsene Zebrafische werden für 24 Stunden in eine Zuckerlösung und dann für 24 Stunden in eine Wasserlösung gelegt. Im Gegensatz zum kontinuierlichen Eintauchen in externe Glukoselösungen ahmt der Wechsel zwischen Zucker und Wasser den Anstieg und Abfall des Blutzuckers bei Diabetes nach. Ein alternierendes Glukoseprotokoll ermöglicht es zusätzlich, Hyperglykämie über längere Zeiträume zu induzieren, da die Zebrafische die hohen äußeren Glukosebedingungen nicht so gut kompensieren können. Als Beweis für das Prinzip liefern wir Daten, die zeigen, dass Hyperglykämie, die mit diesem Protokoll induziert wird, die Netzhautchemie und -physiologie verändert.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der American University genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösungstanks

1. Erhalten Sie sechs Tanks, zwei für jede experimentelle Gruppe (Glukose, Mannit und Wasser). Kennzeichnen Sie einen der beiden Tanks als "Gehäusetank" (er wird den Fisch beherbergen) und beschriften Sie den anderen "Lösungstank" (er enthält die Lösung).
   HINWEIS: Die Mannitol-Behandlungsgruppe ist die osmotische Kontrolle, und die Wasseraufbereitungsgruppe ist eine Handhabungs- / Stresskontrolle. Es ist wichtig, die Tanks, Fluggesellschaften / Luftsteine, Deckel und Reinigungsmittel für jede Behandlungsgruppe getrennt zu halten
2. Verwenden Sie einen 2-L-Tank, wenn die Gesamtzahl der verwendeten Fische weniger als 20 beträgt. Verwenden Sie einen 4-L-Tank, wenn die Gesamtzahl der verwendeten Fische mehr als 20 beträgt.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein N von 5-10 pro Behandlungsgruppe und Probenahmezeitpunkt.
3. Halten Sie die Tanks in einem Wasserbad bei 28-29 °C, um die Wassertemperatur zu halten.
4. An Tag 1 legen Sie die Fische für 24 Stunden in ihre jeweiligen Behandlungslösungen (Glukose, Mannit, Wasser) ("Water to Treatment"). An Tag 2 die Fische für 24 Stunden von ihren Behandlungslösungen ins Wasser überführen ("Treatment to Water"). Am Tag 3 den Fisch vom Wasser zu Behandlungslösungen ("Water to Treatment") überführen. Diese alternierende Exposition setzt sich für den Rest des Experiments fort (Abbildung 1). Übertragen Sie wasserbehandelte Kontrollfische täglich von Wasser zu Wasser.
5. Stellen Sie sicher, dass die Fische während der gesamten Dauer des Experiments jeden Tag innerhalb desselben 2-Stunden-Fensters gefüttert und übertragen werden.

2. Zubereitung des Fisches

1. Verwenden Sie erwachsene Zebrafische (4 Monate – 1 Jahr)⁵.
2. Füttern Sie die fischgemahlenen Tetraminflocken täglich bei der Ankunft im Labor.
3. Notieren Sie den pH-Wert und die Temperatur aller Becken und zeichnen Sie den Allgemeinzustand der Fische auf.

3. Übertragen von Fischen

1. Übertragen Sie Fische in jeder Behandlungsgruppe mit einem Standardfischnetz aus dem Haltungsbecken in das entsprechende Lösungsbecken.
2. Stellen Sie den Tank mit dem Fisch wieder in das Wasserbad, ersetzen Sie den Luftstein und den Tankdeckel. Dieser Tank ist jetzt der "Wohntank" und der Tank, in dem sich der Fisch zuvor befand, ist jetzt der "Lösungstank".
3. Entsorgen Sie die alte Lösung und reinigen Sie den Tank zusammen mit den Tankdeckeln, Fluggesellschaften, Luftsteinen und Netzen, um die Ansammlung von Glukose und Mannit zu verhindern.
   HINWEIS: Waschen Sie Gegenstände nicht mit Seife. Verwenden Sie Wasser und eine spezielle Peelingbürste / Schwamm für jede Behandlungsbedingung, um die Tanks richtig zu reinigen.
4. Trocknen Sie die neu gereinigten "Lösungstanks" mit einem Papiertuch. Bereiten Sie die Lösungen für den nächsten Tag mit diesem Tank vor. Stellen Sie sicher, dass die anderen Gegenstände getrocknet und durch geeignete Behandlungsgruppen getrennt sind.
   HINWEIS: Führen Sie ein Protokoll darüber, aus welchen Lösungen die Fische jeden Tag transferiert werden, sowie die Lösungen, die für den nächsten Tag vorbereitet werden. Zum Beispiel: Fisch von Glukose auf_H2O übertragen, neue 1% ige Glukoselösung, die für morgen vorbereitet ist.

4. Vorbereitung der Lösung nach dem Transfer

1. Herstellung von Zuckerlösungen
   1. Füllen Sie jeden Lösungstank mit 2 L (oder 4 L) Systemwasser (Systemwasser ist definiert als Wasser, das mit dem richtigen Verhältnis von Salzlösung behandelt wurde und die gleiche Temperatur wie Lager- und Behandlungstanks hat).
   2. Messen Sie die richtige Menge an Glukose und Mannit (siehe Schritt 5 unten) mit einer Top-Ladewaage und separaten Wiegebooten für jede Chemikalie.
   3. Geben Sie die gewogene Glukose oder Mannitol aliquot in den entsprechenden, gereinigten Lösungstank, der nur Systemwasser enthält.
   4. Rühren Sie die Glukose- und Mannitollösungen mit separaten Glasrührstäben um, bis die Zucker vollständig aufgelöst sind.
   5. Die Lösungstanks werden in das Wasserbad zurückgelegen und mit den entsprechenden Deckeln abgedeckt.
2. Vorbereitung von Wasserlösungen
   1. Füllen Sie Versuchstanks (2 L oder 4 L) mit Systemwasser.
   2. Bringen Sie diese "Lösungstanks" in das Wasserbad zurück und bedecken Sie sie mit den entsprechenden Deckeln.

5. Prozentsätze ändern

1. Halten Sie den Fisch in einer 1% igen Lösung während der ersten 2 Wochen der Behandlung: 40 g Glukose oder Mannit in einem 4 L Tank.
2. Halten Sie den Fisch in einer 2% igen Lösung während der Wochen 3 und 4 der Behandlung: 80 g Glukose oder Mannit in einem 4 L Tank.
3. Halten Sie den Fisch in einer 3% igen Lösung für die letzten 4 Wochen der Behandlung: 120 g Glukose oder Mannit in einem 4 L Tank.

6. Blutzuckerspiegel messen und Gewebe sammeln

1. Betäuben Sie Fische 2 auf einmal in einer 0,02% igen Tricainlösung.
2. Enthaupten Sie den Fisch direkt hinter den Kiemen mit einer Rasierklinge.
3. Blutzuckerwert messen.
   HINWEIS: Wir verwenden ein Blutzuckermessgerät (z.B. Freestyle Lite) zur Blutzuckermessung und legen den Teststreifen direkt auf das exponierte Herz (Herzblutprobe).
4. Sezieren Sie das gewünschte Gewebe aus dem Fisch (Gehirn, Muskel usw.).
5. Lagern Sie gesammeltes Gewebe durch Schockgefrieren auf Trockeneis und Lagern in einem -80 °C-Gefrierschrank, fixieren Sie es in 4% Paraformaldehyd oder legen Sie es zur sofortigen Verwendung in eine Pufferlösung.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls (Abbildung 1) sind die Blutzuckerwerte sowohl nach 4- als auch nach 8-wöchiger Behandlung signifikant erhöht (Abbildung 2A), wobei hyperglykämie als 3x der Kontrollmittelwerte sowohl von wasserbehandelten als auch von Mannitol-behandelten Gruppen definiert ist. Wasserbehandelte Steuerungen werden täglich in und aus dem Wasser übertragen, um eine Stress- / Handhabungskontrolle zu bieten. Mannitol dient als osmotische Kontro...

Diskussion

Diabetes ist ein bundesweites Problem. Studien zeigen, dass bis 2030 schätzungsweise 400 Millionen Menschen irgendeine Form von Diabetes haben werden. In Nagetiermodellen wird Typ 2 DM mittels genetischer Manipulation untersucht. Bei Ratten liefern die Zucker diabetischen Fettratten (ZDF) und die Otsuka Long-Evans Tokushima Fettratten (OLETF) weitere Informationen über die Wirkung von Typ 2 DM¹⁰. Darüber hinaus wurden fettreiche Diäten bei Nagetieren verwendet, um Hyperglykämie zu induzieren....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airline Tubing	petsmart	5291863	This can be used in the tank to circulate air
Airpump	petsmart	5094984	This can be used in the tank to circulate air
Airstones	petsmart	5149683	This can be used in the tank to circulate air
D-glucose	Sigma	G8270-5KG
D-mannitol	Acros Organics	AC125340050
Freestyle Lite Meter	Amazon	B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips	Amazon	B074ZN3H2Z
Net	petsmart	5175115
Tanks	Amazon	B0002APZO4