АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол неинвазивно вызывает гипергликемию у рыбок данио на срок до 8 недель. Используя этот протокол, можно провести углубленное исследование побочных эффектов гипергликемии.

Аннотация

Рыбки данио (Danio rerio) являются отличной моделью для исследования последствий хронической гипергликемии, отличительной черты сахарного диабета II типа (СД2). Этот альтернативный протокол погружения представляет собой неинвазивный, ступенчатый метод индуцирования гипергликемии на срок до восьми недель. Взрослые рыбки данио поочередно подвергаются воздействию сахара (глюкозы) и воды в течение 24 часов каждая. Рыбки данио начинают лечение в 1% растворе глюкозы в течение 2 недель, затем 2% раствором в течение 2 недель и, наконец, 3% раствором в течение оставшихся 4 недель. По сравнению с обработанными водой (стресс) и маннитолами (осмотическими) контрольными органами, рыбки данио, обработанные глюкозой, имеют значительно более высокий уровень сахара в крови. Рыбки данио, обработанные глюкозой, показывают уровень сахара в крови в 3 раза больше, чем в контрольной, предполагая, что через четыре и восемь недель может быть достигнута гипергликемия. Устойчивая гипергликемия была связана с увеличением глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и повышенным уровнем ядерного фактора Kappa B (NF-kB) в сетчатке и снижением физиологических реакций, а также когнитивным дефицитом, предполагающим, что этот протокол может быть использован для моделирования осложнений заболевания.

Введение

Рыбки данио (Danio rerio) быстро становятся широко используемой животной моделью для изучения как болезней, так и познания1. Легкость генетических манипуляций и эмбриональная прозрачность на ранних стадиях развития делают их главным кандидатом на изучение заболеваний человека с известной генетической основой. Например, рыбки данио использовались для изучения синдрома Холта-Орама, кардиомиопатий, гломерулоцистических заболеваний почек, мышечной дистрофии и сахарного диабета (СД) среди других заболеваний1. Кроме того, модель рыбок данио идеально подходит из-за небольшого размера вида, простоты в обслуживании и высокой плодовитости2,3.

Поджелудочная железа рыбок данио анатомически и функционально похожа на поджелудочную железу млекопитающих4. Таким образом, уникальные характеристики размера, высокая плодовитость и подобные эндокринные структуры делают рыбок данио подходящим кандидатом для изучения осложнений, связанных с СД. У рыбок данио существуют два экспериментальных метода, используемых для индуцирования длительной гипергликемии, характерной для СД: приток глюкозы (моделирование типа 2) и прекращение секреции инсулина (моделирование типа 1)5,6. Экспериментально, чтобы остановить секрецию инсулина, клетки β поджелудочной железы могут быть химически уничтожены с помощью инъекций стрептозотоцина (СТЗ) или аллоксана. STZ успешно используется у грызунов и рыбок данио, что приводит к осложнениям, связанным с ретинопатией7,8,9,когнитивными нарушениями10и регенерацией конечностей11. Однако у рыбок данио β-клетки регенерируют после лечения, в результате чего «бустерные инъекции» СТЗ необходимы для поддержания диабетических состояний12. Альтернативно, поджелудочная железа рыбки данио может быть удалена6. Это как высокоинвазивные процедуры, из-за многократных инъекций, так и обширного времени восстановления.

И наоборот, гипергликемия может быть вызвана неинвазивно через воздействие экзогенной глюкозы. В этом протоколе рыб погружают в высококонцентрированный раствор глюкозы на 24 часа5,13 или непрерывно в течение 2-х недель14,15,16. Экзогенная глюкоза поглощается трансдермально, путем приема внутрь и / или через жабры, что приводит к повышению уровня сахара в крови. Поскольку этот неинвазивный метод напрямую не манипулирует уровнями инсулина, он не может претендовать на индуцировать СД 2 типа. Тем не менее, он может быть использован для изучения осложнений, вызванных гипергликемией, которая является одним из основных симптомов СД 2 типа.

Недавно мутантный pdx1-/- рыбки данио был разработан путем манипулирования геном гомеобокса 1 поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки, геном, связанным с генетической причиной СД типа 2 у людей. Используя этот мутант, исследователи смогли воспроизвести нарушение развития поджелудочной железы, высокий уровень сахара в крови и изучить гипергликемию-индуцированную диабетическую ретинопатию17,18.

В этой статье мы описываем неинвазивный метод индукции гипергликемии, который использует протокол переменного погружения. Этот протокол поддерживает гипергликемические состояния до 8 недель с последующими осложнениями. Короче говоря, взрослых рыбок данио помещают в раствор сахара на 24 часа, а затем водный раствор на 24 часа. В отличие от непрерывного погружения во внешние растворы глюкозы, чередование дней между сахаром и водой имитирует подъем и падение уровня сахара в крови при диабете. Протокол чередования глюкозы дополнительно позволяет индуцировать гипергликемию в течение более длительных периодов времени, так как рыбки данио не в состоянии компенсировать высокие внешние условия глюкозы. В качестве доказательства принципа мы предоставляем данные, показывающие, что гипергликемия, вызванная с помощью этого протокола, изменяет химию и физиологию сетчатки.

протокол

Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при Американском университете.

1. Подготовка резервуаров для раствора

  1. Получите шесть резервуаров, по два для каждой экспериментальной группы (глюкоза, маннит и вода). Пометьте один из двух резервуаров «резервуар для корпуса» (в нем будет размещаться рыба) и пометьте другой «резервуар для раствора» (он будет удерживать раствор).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Группа обработки маннитола является осмотическим контролем, а группа очистки воды - контролем обработки / стресса. Важно, чтобы резервуары, авиалинии / аэрокаменные камни, крышки и чистящие средства были разделены для каждой группы обработки.
  2. Используйте резервуар объемом 2 л, если общее количество используемой рыбы меньше 20. Используйте аквариум объемом 4 л, если общее количество используемой рыбы превышает 20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте N 5-10 на группу обработки на момент отбора проб.
  3. Храните резервуары на водяной бане при температуре 28-29 °C для поддержания температуры воды.
  4. На 1-й день поместите рыбу в соответствующие лечебные растворы (глюкоза, маннит, вода) на 24 часа («Вода для обработки»). На 2-й день перенесите рыбу из ее лечебных растворов в воду в течение 24 часов («Обработка в воде»). На 3-й день перенесите рыбу из воды в лечебные растворы («Вода для очистки»). Это попеременное воздействие продолжается в течение оставшейся частиэксперимента (рисунок 1). Ежедневно передавайте очищенную водой контрольную рыбу из воды в воду.
  5. Убедитесь, что рыба кормится и переносится в течение одного и того же 2-часового окна каждый день на протяжении всего эксперимента.

2. Подготовка рыбы

  1. Употреблять взрослым рыбкам данио (4 месяца – 1 год)5.
  2. Ежедневно кормите рыбу измельченными хлопьями Tetramin по прибытии в лабораторию.
  3. Запишите рН и температуру всех аквариумов и запишите общее состояние рыбы.

3. Перенос рыбы

  1. Перенесите рыбу в каждой группе обработки из резервуара корпуса в соответствующий резервуар для раствора с помощью стандартной рыбной сети.
  2. Поместите аквариум с рыбой обратно на водяную баню, замените воздушный камень и крышку резервуара. Этот резервуар теперь является «резервуаром для корпуса», а резервуар, в котором ранее содержались рыбы, теперь является «резервуаром для раствора».
  3. Выбросьте старый раствор и очистите резервуар вместе с крышками резервуара, авиалиниями, воздушными камнями и сетями, чтобы предотвратить накопление глюкозы и маннитола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте предметы с мылом. Используйте воду и специальную щетку для скраба / губку для каждого состояния обработки, чтобы правильно очистить резервуары.
  4. Высушите недавно очищенные «резервуары для раствора» бумажным полотенцем. Подготовьте растворы на следующий день, используя этот резервуар. Убедитесь, что другие предметы высушены и разделены соответствующими группами обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите журнал того, какие растворы рыба переносит из и в каждый день, а также растворы, которые готовятся на следующий день. Например: Рыбу перевели из глюкозы вН2О,новый 1% раствор глюкозы приготовили на завтра.

4. Послепереносное приготовление раствора

  1. Приготовление растворов сахара
    1. Заполните каждый резервуар для раствора 2 л (или 4 л) системной воды (системная вода определяется как вода, которая была обработана с правильным соотношением солевого раствора и имеет ту же температуру, что и резервуары для хранения и очистки).
    2. Измерьте правильное количество глюкозы и маннитола (см. шаг 5 ниже) с помощью весов верхней загрузки и отдельных весовых лодок для каждого химического вещества.
    3. Добавьте взвешенную глюкозу или аликвот маннитола в соответствующий, очищенный резервуар для раствора, который содержит только системную воду.
    4. Перемешайте растворы глюкозы и маннита с помощью отдельных стеклянных стержней для перемешивания до полного растворения сахаров.
    5. Верните резервуары для раствора на водяную баню и накройте соответствующими им крышками.
  2. Приготовление водных растворов
    1. Заполните экспериментальные резервуары (2 л или 4 л) системной водой.
    2. Верните эти «резервуары для раствора» на водяную баню и накройте их соответствующими крышками.

5. Изменение процентов

  1. Выдерживая рыбу в 1% растворе в течение первых 2-х недель лечения: 40 г глюкозы или маннитола в 4-х л аквариуме.
  2. Выдерживая рыбу в 2% растворе в течение 3 и 4 недель лечения: 80 г глюкозы или манатина в резервуаре объемом 4 л.
  3. Выдерживая рыбу в 3% растворе в течение последних 4 недель лечения: 120 г глюкозы или маннитола в 4-х л аквариуме.

6. Измерение уровня глюкозы в крови и сбор ткани

  1. Обезболивать рыбу по 2 раза в 0,02% растворе трикаина.
  2. Обезглавить рыбу прямо за жабрами с помощью бритвенного лезвия.
  3. Измерьте уровень сахара в крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем глюкометр (например, Freestyle Lite) для измерения уровня глюкозы в крови и помещаем тест-полоску непосредственно на открытое сердце (образец сердечной крови).
  4. Рассекать ищутую ткань от рыбы (мозг, мышцы и т.д.).
  5. Храните собранную ткань путем мгновенного замораживания на сухом льду и хранения в морозильной камере при температуре -80 °C, фиксации в 4% параформальдегиде или помещения в буферный раствор для немедленного использования.

Результаты

Используя этот протокол(Рисунок 1),значения сахара в крови значительно повышаются как после 4 недель, так и после 8 недельлечения (Рисунок 2А),при этом гипергликемия определяется как в 3 раза выше контрольных средних значений как из обработанных водой, так ?...

Обсуждение

Диабет является общенациональной проблемой. Исследования показывают, что к 2030 году, по оценкам, 400 миллионов человек будут иметь ту или иную форму диабета. В моделях грызунов DM типа 2 изучается с помощью генетических манипуляций. У крыс диабетические жирные крысы Цукера (ZDF) и жирные крыс?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить VPC, CJR и MCP за разработку этого протокола. EMM получила финансовую поддержку от Американского университетского колледжа искусств и наук для аспирантов для проведения этого исследования. Эта работа также была поддержана премией Меллона факультета Американского университета и финансированием через Американский университетский колледж искусств и наук (оба для VPC).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Airline Tubingpetsmart5291863This can be used in the tank to circulate air
Airpumppetsmart5094984This can be used in the tank to circulate air
Airstonespetsmart5149683This can be used in the tank to circulate air
D-glucoseSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros OrganicsAC125340050
Freestyle Lite MeterAmazonB01LMOMLTU
Freestyle Lite StripsAmazonB074ZN3H2Z
Netpetsmart5175115
TanksAmazonB0002APZO4

Ссылки

  1. Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
  2. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
  4. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  5. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
  6. Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
  7. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
  8. Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
  9. Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
  10. Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
  11. Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).
  12. Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , (2013).
  13. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
  14. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  15. Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
  16. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
  17. Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43 (2020).
  18. Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
  19. Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
  20. Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
  21. Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
  22. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
  23. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
  24. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
  25. Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
  26. Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
  27. Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
  28. Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
  29. Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
  30. Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  31. Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
  32. Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
  33. Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
  34. Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
  35. Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены