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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo induce in modo non invasivo l'iperglicemia nel pesce zebra per un massimo di 8 settimane. Utilizzando questo protocollo, è possibile fare uno studio approfondito degli effetti avversi dell'iperglicemia.

Abstract

I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per indagare gli effetti dell'iperglicemia cronica, un segno distintivo del diabete mellito di tipo II (T2DM). Questo protocollo ad immersione alternativa è un metodo non invasivo e step-wise per indurre iperglicemia per un massimo di otto settimane. I pesci zebra adulti sono alternativamente esposti allo zucchero (glucosio) e all'acqua per 24 ore ciascuno. Il pesce zebra inizia il trattamento in una soluzione di glucosio all'1% per 2 settimane, quindi una soluzione al 2% per 2 settimane e infine una soluzione al 3% per le restanti 4 settimane. Rispetto ai controlli trattati con acqua (stress) e trattati con mannitolo (osmotico), i pesci zebra trattati con glucosio hanno livelli significativamente più elevati di zucchero nel sangue. Il pesce zebra trattato con glucosio mostra livelli di zucchero nel sangue 3 volte superiori a quello dei controlli, suggerendo che dopo quattro e otto settimane l'iperglicemia può essere raggiunta. L'iperglicemia sostenuta è stata associata all'aumento della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e all'aumento dei livelli di fattore nucleare Kappa B (NF-kB) nella retina e alla diminuzione delle risposte fisiologiche, così come i deficit cognitivi che suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per modellare le complicanze della malattia.

Introduzione

Il pesce zebra(Danio rerio)sta rapidamente diventando un modello animale ampiamente utilizzato per studiare sia la malattia che la cognizione1. La facilità di manipolazione genetica e la trasparenza embrionale attraverso le prime fasi di sviluppo, li rendono un candidato principale per studiare le malattie umane con una base genetica nota. Ad esempio, i pesci zebra sono stati utilizzati per studiare la sindrome di Holt-Oram, le cardiomiopatie, la malattia renale glomerulocistica, la distrofia muscolare e il diabete mellito (DM) tra le altremalattie 1. Inoltre, il modello zebrafish è ideale per le piccole dimensioni della specie, la facilità di manutenzione e l'elevata fecondità2,3.

Il pancreas zebrafish è sia anatomicamente che funzionalmente simile al pancreas di mammiferi4. Pertanto, le caratteristiche uniche di dimensioni, alta fecondità e strutture endocrine simili rendono zebrafish un candidato adatto per lo studio delle complicanze legate alla DM. Nel pesce zebra, ci sono due metodi sperimentali utilizzati per indurre l'iperglicemia prolungata che è caratteristica del DM: un afflusso di glucosio (modellazione di tipo 2) e la cessazione della secrezione di insulina (modellazione tipo 1)5,6. Sperimentalmente, per fermare la secrezione di insulina, le cellule β pancreatiche possono essere distrutte chimicamente usando iniezioni di Streptozotocina (STZ) o Alloxan. STZ è stato utilizzato con successo nei roditori e nei pesci zebra, con conseguenti complicazioni associate alla retinopatia7,8,9,deficit cognitivi10e rigenerazione degli arti11. Tuttavia, nel pesce zebra, β-cellule si rigenerano dopo il trattamento, causando la necessaria "iniezione di richiamo" di STZ per mantenere le condizioni diabetiche12. In alternativa, il pancreas del pesce zebra può essere rimosso6. Si tratta sia di procedure altamente invasive, dovute alle iniezioni multiple, sia di un ampio tempo di recupero.

Al contrario, l'iperglicemia può essere indotta in modo non invasivo attraverso l'esposizione al glucosio esogeno. In questo protocollo, i pesci sono immersi in una soluzione di glucosio altamente concentrata per 24 ore5,13 o continuamente per 2 settimane14,15,16. Il glucosio esogeno viene assunto transdermicamente, per ingestione e/o attraverso le branchie con conseguente elevati livelli di zucchero nel sangue. Poiché questa tecnica non invasiva non manipola direttamente i livelli di insulina, non può pretendere di indurre il DM di tipo 2. Tuttavia, può essere utilizzato per esaminare le complicanze indotte dall'iperglicemia, che è uno dei principali sintomi del DM di tipo 2.

Recentemente, il mutante zebrafish pdx1-/- è stato sviluppato manipolando il gene pancreatico e duodenale omeobox 1, un gene legato alla causa genetica del DM di tipo 2 nell'uomo. Utilizzando questo mutante, i ricercatori sono stati in grado di replicare l'interruzione dello sviluppo pancreatico, l'alto livello di zucchero nel sangue e studiare la retinopatia diabetica indotta da iperglicemia17,18.

In questo articolo, descriviamo un metodo di induzione dell'iperglicemia non invasiva che utilizza un protocollo ad immersione alternata. Questo protocollo mantiene condizioni iperglicemiche per un massimo di 8 settimane con complicazioni successive osservate. In breve, i pesci zebra adulti vengono posti in una soluzione di zucchero per 24 ore e quindi in una soluzione d'acqua per 24 ore. A differenza dell'immersione continua in soluzioni esterne di glucosio, alternare giorni tra zucchero e acqua imita l'aumento e la caduta della glicemia nel diabete. Un protocollo di glucosio alternato consente inoltre di indotta l'iperglicemia per periodi di tempo più lunghi, poiché i pesci zebra non sono così in grado di compensare le elevate condizioni esterne di glucosio. Come prova di principio, forniamo dati che mostrano che l'iperglicemia indotta usando questo protocollo altera la chimica retinica e la fisiologia.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'American University.

1. Preparazione dei serbatoi di soluzione

  1. Ottenere sei serbatoi, due per ogni gruppo sperimentale (glucosio, mannitolo e acqua). Etichettare uno dei due serbatoi "serbatoio di alloggiamento" (oterrà il pesce) ed etichettare l'altro "serbatoio di soluzione" (terrà la soluzione).
    NOTA: Il gruppo di trattamento del mannitol è il controllo osmotico e il gruppo di trattamento delle acque è un controllo della manipolazione / stress. È importante tenere separati i serbatoi, le compagnie aeree/ pietre aeree, i coperchi e i prodotti per la pulizia per ogni gruppo di trattamento
  2. Utilizzare un serbatoio da 2 L se il numero totale di pesci utilizzati è inferiore a 20. Utilizzare un serbatoio da 4 L se il numero totale di pesci utilizzati è superiore a 20.
    NOTA: Utilizzare una N di 5-10 per gruppo di trattamento per punto di tempo di campionamento.
  3. Tenere i serbatoi in un bagno d'acqua a 28-29 °C per mantenere la temperatura dell'acqua.
  4. Il primo giorno, mettere il pesce nelle rispettive soluzioni di trattamento (glucosio, mannitolo, acqua) per 24 ore ('Acqua da treatment'). Il secondo giorno, trasferire il pesce dalle loro soluzioni di trattamento all'acqua per 24 ore ('Trattamento in acqua'). Il giorno 3, trasferire il pesce dall'acqua alle soluzioni di trattamento ('Acqua al trattamento'). Questa esposizione alternata continua per il resto dell'esperimento (Figura 1). Trasferire quotidianamente pesci di controllo trattati con acqua dall'acqua all'acqua.
  5. Assicurarsi che il pesce venga nutrito e trasferito all'interno della stessa finestra di 2 ore ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento.

2. Preparare il pesce

  1. Utilizzare zebrafish adulti (4 mesi - 1 anno)5.
  2. Dai da mangiare al pesce macinato a scaglie di Tetramin ogni giorno all'arrivo in laboratorio.
  3. Registrare il pH e la temperatura di tutti i serbatoi e registrare le condizioni generali del pesce.

3. Trasferimento di pesce

  1. Trasferire il pesce in ogni gruppo di trattamento dal serbatoio di alloggiamento al serbatoio di soluzione corrispondente utilizzando una rete di pesce standard.
  2. Riposizionare il serbatoio contenente il pesce nel bagno d'acqua, sostituire la pietra d'aria e il coperchio del serbatoio. Questo serbatoio è ora il "serbatoio dell'alloggiamento" e il serbatoio che in precedenza deteneva il pesce è ora il "serbatoio della soluzione".
  3. Scartare la vecchia soluzione e pulire il serbatoio, insieme ai coperchi dei serbatoi, alle compagnie aeree, alle pietre aeree e alle reti per prevenire l'accumulo di glucosio e mannitol.
    NOTA: Non lavare gli articoli con sapone. Utilizzare acqua e una spazzola/spugna dedicata per ogni condizione di trattamento per pulire correttamente i serbatoi.
  4. Asciugare i "serbatoi di soluzione" appena puliti con un tovagliolo di carta. Preparare le soluzioni per il giorno successivo utilizzando questo serbatoio. Assicurarsi che gli altri articoli siano asciugati e separati da gruppi di trattamento appropriati.
    NOTA: Tenere un registro delle soluzioni che il pesce viene trasferito da e verso ogni giorno, nonché delle soluzioni preparate per il giorno successivo. Ad esempio: pesce trasferito dal glucosio all'H2O, nuova soluzione di glucosio all'1% preparata per domani.

4. Preparazione della soluzione post-trasferimento

  1. Preparazione di soluzioni zuccheri
    1. Riempire ogni serbatoio della soluzione con 2 L (o 4 L) di Acqua di sistema (l'acqua di sistema è definita come acqua che è stata trattata con il corretto rapporto di soluzione salina ed è alla stessa temperatura delle cisterne di stoccaggio e trattamento).
    2. Misurare la corretta quantità di glucosio e mannitol (vedere il passaggio 5 sotto) utilizzando una bilancia di carico superiore e barche di pesata separate per ogni sostanza chimica.
    3. Aggiungere l'aliquota di glucosio o mannito pesata al serbatoio della soluzione appropriato e pulito, che contiene solo acqua di sistema.
    4. Mescolare le soluzioni di glucosio e mannitol con aste di mescolare il vetro separate fino a quando gli zuccheri non sono completamente sciolti.
    5. Restituire i serbatoi di soluzione al bagno d'acqua e coprire con i coperchi corrispondenti.
  2. Preparazione di soluzioni idriche
    1. Riempire i serbatoi sperimentali (2 L o 4 L) con Acqua di sistema.
    2. Riportare questi "serbatoi di soluzione" al bagno d'acqua e coprire con i coperchi corrispondenti.

5. Variazione delle percentuali

  1. Mantenere il pesce in una soluzione all'1% durante le prime 2 settimane di trattamento: 40 g di glucosio o mannitolo in un serbatoio da 4 L.
  2. Mantenere il pesce in una soluzione al 2% durante le settimane 3 e 4 del trattamento: 80 g di glucosio o mannitol in un serbatoio da 4 L.
  3. Mantenere il pesce in una soluzione al 3% per le ultime 4 settimane di trattamento: 120 g di glucosio o mannitolo in un serbatoio da 4 L.

6. Misurazione dei livelli di glucosio nel sangue e raccolta dei tessuti

  1. Anestetizzare il pesce 2 alla volta in una soluzione di tricaina allo 0,02%.
  2. Decapitare il pesce direttamente dietro le branchie usando un rasoio.
  3. Misurare il valore della glicemia.
    NOTA: Usiamo un misuratore di glucosio nel sangue (ad esempio, Freestyle Lite) per misurare la glicemia e posizionare la striscia di prova direttamente sul cuore esposto (campione di sangue cardiaco).
  4. Sezionare il tessuto desiderato dal pesce (cervello, muscoli, ecc.).
  5. Conservare il tessuto raccolto congelando il ghiaccio secco e conservandolo in un congelatore a -80 °C, fissandolo in paraformaldeide al 4% o mettendo in una soluzione tampone per un uso immediato.

Risultati

Utilizzando questo protocollo (Figura 1), i valori della glicemia sono significativamente elevati dopo 4 settimane e 8 settimane di trattamento (Figura 2A), con iperglicemia definita come 3 volte le medie di controllo provenienti sia da gruppi trattati con acqua che da gruppi trattati con mannito. I controlli trattati con acqua vengono trasferiti ogni giorno all'interno e all'uscita dall'acqua, fornendo un controllo dello stress/movimentazione. Il mannitolo fung...

Discussione

Il diabete è un problema nazionale. Gli studi dimostrano che entro il 2030, si stima che 400 milioni di persone avranno una qualche forma di diabete. Nei modelli di roditori, il DM di tipo 2 viene studiato utilizzando la manipolazione genetica. Nei ratti, i ratti grassi diabetici Zucker (ZDF) e i ratti grassi Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), forniscono maggiori informazioni sugli effetti del tipo 2 DM10. Inoltre, diete ad alto contenuto di grassi sono state utilizzate nei roditori per indurre...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Vorremmo riconoscere VPC, CJR e MCP per lo sviluppo di questo protocollo. L'EMM ha ricevuto sostegno finanziario dall'American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support per svolgere questa ricerca. Questo lavoro è stato anche supportato da un American University Faculty Mellon Award e finanziamenti attraverso l'American University College of Arts and Sciences (entrambi a VPC).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Airline Tubingpetsmart5291863This can be used in the tank to circulate air
Airpumppetsmart5094984This can be used in the tank to circulate air
Airstonespetsmart5149683This can be used in the tank to circulate air
D-glucoseSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros OrganicsAC125340050
Freestyle Lite MeterAmazonB01LMOMLTU
Freestyle Lite StripsAmazonB074ZN3H2Z
Netpetsmart5175115
TanksAmazonB0002APZO4

Riferimenti

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