ゼブラフィッシュで長期高血糖を生み出すグルコースの交互浸漬

要約

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの高血糖を最大8週間非侵襲的に誘導する。このプロトコルを用いて、高血糖の副作用に関する詳細な研究が行われる。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、慢性高血糖症の影響を調査するための優れたモデルであり、II型糖尿病(T2DM)の特徴である。この交互浸漬プロトコルは、最大8週間の高血糖を誘導する非侵襲的で段階的な方法である。成虫のゼブラフィッシュは、それぞれ24時間砂糖(ブドウ糖)と水に交互に曝されます。ゼブラフィッシュは、2週間1%のグルコース溶液で治療を開始し、その後2週間、そして最後に残りの4週間の3%溶液を2%溶液とする。水処理(ストレス)およびマンニトール処理(浸透)コントロールと比較して、グルコース処理ゼブラフィッシュは血糖値が有意に高い。グルコース処理されたゼブラフィッシュは、コントロールの3倍の血糖値を示し、4週間と8週間後の高血糖が達成できることを示唆している。持続的な高血糖は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の増加と、陰性および生理学的応答の減少における核因子カッパB(NF-kB)レベルの増加と関連しており、このプロトコルが疾患合併症をモデル化するために使用できることを示唆する認知障害であった。

概要

ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、病気と認知の両方を研究するために広く使用される動物モデルになりつつあります¹.初期の発達段階を通じた遺伝子操作と胚性の透明性の容易さは、既知の遺伝的基礎を持つヒト疾患を研究する最有力候補となる。例えば、ゼブラフィッシュは、ホルト・オラム症候群、心筋症、糸球嚢胞性腎疾患、筋ジストロフィー、および糖尿病(DM)の研究に使用^{されてきた。}また、ゼブラフィッシュモデルは、種の小型、メンテナンスの容易さ、および高い胎児性^2、3のために理想的です。

ゼブラフィッシュ膵臓は、哺乳類膵臓⁴と解剖学的および機能的に類似している。したがって、サイズ、高い胎児性、および類似の内分泌構造のユニークな特性は、ゼブラフィッシュをDM関連合併症を研究するための適切な候補にする。ゼブラフィッシュでは、DMに特徴的な長期高血糖を誘導するために用いられる2つの実験方法があります:グルコースの流入(モデリングタイプ2)とインスリン分泌の停止(モデリングタイプ^1)5、6。実験的に、インスリン分泌を止めるために、膵臓β細胞は、ストレプトゾトシン(STZ)またはアロキサン注射のいずれかを使用して化学的に破壊することができる。STZは齧歯類およびゼブラフィッシュで正常に使用され、網膜症^7、8、9、認知障害^10、および四肢再生¹¹に関連する合併症を生じさせる。しかし、ゼブラフィッシュでは、β細胞が治療後に再生し、糖尿病状態¹²を維持するためにSTZの「ブースター注射」が必要となる。あるいは、ゼブラフィッシュの膵臓を⁶から取り除くことができる。これらは、複数の注射、および広範な回復時間のために、両方の非常に侵襲的な手順です。

逆に、高血糖は、外因性グルコースへの暴露を通じて非侵襲的に誘発され得る。このプロトコルでは、魚は24時間^5、13、または2週間^14、15、16のために継続的に高濃度グルコース溶液に沈め^られます。外因性グルコースは、経口摂取によって、および/またはエラを横切って、血糖値の上昇をもたらす経皮的に取り上げられる。この非侵襲的な技術はインスリンレベルを直接操作しないので、タイプ2 DMを誘導するとは主張できない。しかし、これは、タイプ2 DMの主な症状の一つである高血糖によって誘発される合併症を調べるために使用することができる。

最近、ゼブラフィッシュ変異体pdx1-/-は、ヒトにおける2型DMの遺伝的原因に関連する遺伝子である膵臓および十二指腸ホメオボックス1遺伝子を操作することによって開発された。この変異体を用いて、研究者は膵臓発達破壊、高血糖、および高血糖誘発糖尿病網膜症^17,18を複製することができた。

本論文では、交互浸漬プロトコルを用いた非侵襲性高血糖誘導法について述べている。このプロトコルは、その後の合併症が観察された最大8週間の高血糖状態を維持する。簡単に言えば、成虫のゼブラフィッシュは24時間砂糖溶液に入れられ、次いで24時間水溶液に入れられます。外部グルコース溶液への連続浸漬とは対照的に、砂糖と水の間の交互の日は、糖尿病における血糖値の上昇と下降を模倣する。交互のグルコースプロトコルは、高血糖を高血糖が高い外部グルコース条件を補うことができないほど長い期間誘発することをさらに可能にする。原理の証明として、このプロトコルを用いて誘発される高血糖が、レチナリカル化学と生理学を変えるデータを提供する。

プロトコル

すべての手続きは、アメリカン大学の制度的動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. ソリューションタンクの準備

1. 実験群(グルコース、マンミトール、水)ごとに2両の6つのタンクを得る。2つのタンクの「住宅タンク」の1つにラベルを付け(それは魚を収容します)、他の「溶液タンク」にラベルを付けます(それはソリューションを保持します)。
   注:マンニトール処理群は浸透制御であり、水処理グループは取り扱い/応力制御です。タンク、航空会社/航空石、ふた、および洗浄用品は、各治療グループごとに別々に保つことが重要です
2. 使用する魚の総数が20未満の場合は、2 Lタンクを使用してください。使用魚の総数が20を超える場合は、4 Lタンクを使用してください。
   注: サンプリング タイム ポイントごとに処理グループあたり 5 ~ 10 の N を使用します。
3. 水温を維持するために、水浴中のタンクを28〜29°Cに保ちます。
4. 1日目に、魚をそれぞれの治療溶液(グルコース、マンニトール、水)に24時間配置します(「水から治療へ」)。2日目に、魚を処理液から24時間水に移します(「水への治療」)。3日目に、魚を水から処理液に移します(「水から治療へ」)。この交互の露出は、実験の残りの部分(図1)のために続きます。 水処理されたコントロール魚を水から水に毎日移します。
5. 魚が毎日同じ2時間のウィンドウ内で、実験の間、餌を与えられ、転送されることを確認します。

2. 魚の準備

1. 大人のゼブラフィッシュ(4ヶ月 - 1年⁾⁵を使用してください。
2. ラボに到着すると毎日魚の地面テトラミンフレークを養います。
3. すべてのタンクのpHと温度を記録し、魚の一般的な状態を記録します。

3. 魚の転写

1. 各処理群の魚を、標準的な魚網を使用して、住宅タンクから対応する溶液タンクに移します。
2. 魚を含むタンクを水浴に戻し、エアストーンとタンク蓋を交換します。このタンクは現在「住宅タンク」であり、以前に魚を保持していたタンクは現在「ソリューションタンク」です。
3. 古い溶液を捨てて、タンクの蓋、航空会社、航空石、ネットとともに、グルコースとマンリトールの蓄積を防ぎます。
   メモ:石鹸で洗い物をしないでください。水と専用のスクラブブラシ/スポンジを各処理条件に使用して、タンクを適切に洗浄します。
4. 新しく洗浄した「溶液タンク」をペーパータオルで乾かします。このタンクを使用して翌日のソリューションを準備します。他の項目は乾燥し、適切な処置群によって分離されていることを確認してください。
   注:魚が毎日から、そして毎日に転送されているソリューションのログと、翌日に用意されているソリューションを記録しておきます。例えば:魚はブドウ糖から_H2Oに移され、新しい1%グルコース溶液は明日のために調製される。

4. 転写後ソリューションの準備

1. 砂糖溶液の準備
   1. 各溶液タンクにシステムウォーターの2 L(または4L)を充填します(システム水は、塩溶液の正しい比率で処理され、ストックおよび処理タンクと同じ温度にある水として定義されます)。
   2. 上部ローディングスケールを使用してグルコースとマンニートールの正しい量を測定し(下記のステップ5を参照)、各化学物質のボートを別々に計量します。
   3. 計量したグルコースまたはマンニートールアリコートを、システム水のみを含む適切な洗浄溶液タンクに追加します。
   4. 糖が完全に溶解するまで、別々のガラス攪拌棒でグルコースとマンニトール溶液をかき混ぜます。
   5. 水浴に溶液タンクを返し、対応する蓋で覆います。
2. 水溶液の準備
   1. 実験用タンク(2 L または 4 L)をシステムウォーターで満たします。
   2. これらの「溶液タンク」を水浴に戻し、対応する蓋で覆います。

5. パーセンテージの変更

1. 治療の最初の2週間の間に1%溶液で魚を維持する:4 Lタンク内のグルコースまたはマンニトールの40グラム。
2. 治療の週3と4の間に2%溶液で魚を維持する:4 Lタンク内のグルコースまたはマンニトールの80グラム。
3. 治療の最後の4週間の3%溶液で魚を維持する:4 Lタンク内のグルコースまたはマンニトールの120グラム。

6. 血糖値の測定と組織の収集

1. 0.02%トリケーヌ溶液で魚2を一度に麻酔します。
2. カミソリの刃を使用してエラの真後ろの魚を切断します。
3. 血糖値を測定します。
   注:血糖計(フリースタイルLiteなど)を使用して血糖値を測定し、検査ストリップを露出した心臓(心臓血液サンプル)に直接置きます。
4. 魚から望ましい組織(脳、筋肉など)を解剖する。
5. 収集した組織をドライアイスでフラッシュ冷凍し、-80°C冷凍庫に保管し、4%パラホルムアルデヒドで固定するか、または直ちに使用するために緩衝液に入れます。

結果

このプロトコル(図1)を用いて、血糖値は4週間および8週間の治療の後に有意に上昇し(図2A)、高血糖血症は水処理群およびマンリトール処理群の両方からの対照平均の3倍と定義される。水処理コントロールは、毎日水の出入りが行われ、ストレス/ハンドリングコントロールを提供します。マンニトールは、ブドウ糖のような6炭素糖であるが細胞に?...

ディスカッション

糖尿病は全国的な問題です。研究によると、2030年までに推定4億人が何らかの糖尿病を患うだろう。げっ歯類モデルでは、遺伝子操作を用いて2型DMを研究する。ラットでは、ザッカー糖尿病性ラット(ZDF)、及び大塚ロングエバンス徳島脂肪ラット(OLETF)が、2型^DM10の効果に関するより多くの情報を提供している。また、高血糖を誘発するためにげっ歯類にも高脂肪食が使用され...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airline Tubing	petsmart	5291863	This can be used in the tank to circulate air
Airpump	petsmart	5094984	This can be used in the tank to circulate air
Airstones	petsmart	5149683	This can be used in the tank to circulate air
D-glucose	Sigma	G8270-5KG
D-mannitol	Acros Organics	AC125340050
Freestyle Lite Meter	Amazon	B01LMOMLTU
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Net	petsmart	5175115
Tanks	Amazon	B0002APZO4