Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, zebra balıklarında 8 haftaya kadar hiperglisemiyi noninvaziv olarak indükler. Bu protokol kullanılarak hiperglisemi'nin olumsuz etkilerinin derinlemesine incelenmesi sağlanabilir.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio) Tip II Diabetes Mellitus'un (T2DM) ayırt edici özelliği olan kronik hiperglisemi etkilerini araştırmak için mükemmel bir modeldir. Bu alternatif daldırma protokolü, sekiz haftaya kadar hiperglisemiyi indüklemenin noninvaziv, adım adım bir yöntemidir. Yetişkin zebra balıkları dönüşümlü olarak her biri 24 saat boyunca şekere (glikoz) ve suya maruz kalır. Zebra balığı tedaviye 2 hafta boyunca% 1 glikoz çözeltisinde, daha sonra 2 hafta boyunca% 2 çözeltide ve son olarak kalan 4 hafta için% 3'lük bir çözeltide başlar. Su ile tedavi edilen (stres) ve mannitolle işlenmiş (ozmotik) kontrollerle karşılaştırıldığında, glikozla tedavi edilen zebra balıkları önemli ölçüde daha yüksek kan şekeri seviyelerine sahiptir. Glikozla tedavi edilen zebra balığı, kontrollerin 3 katı kan şekeri seviyesi gösterir ve hem dört hem de sekiz hafta sonra hiperglisemi elde edilebileceğini düşündürmektedir. Sürekli hiperglisemi, retinada glial fibril asidik protein (GFAP) ve artan nükleer faktör Kappa B (NF-kB) düzeyleri ve fizyolojik yanıtların azalmasının yanı sıra bu protokolün hastalık komplikasyonlarını modellemek için kullanılabileceğini düşündüren bilişsel eksikliklerle ilişkiliydi.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio) hızla hem hastalığı hem de bilişi incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli haline geliyor1. Erken gelişim aşamalarında genetik manipülasyon ve embriyonik şeffaflığın kolaylığı, onları bilinen bir genetik temele sahip insan hastalıklarını incelemek için birincil aday haline getirir. Örneğin, zebra balığı Holt-Oram sendromu, kardiyomiyopatiler, glomerülosit böbrek hastalığı, kas distrofisi ve diabetes mellitus (DM) diğer hastalıkların yanı sıra1. Ek olarak, zebra balığı modeli, türlerin küçük boyutu, bakım kolaylığı ve yüksek doğurganlık2,3nedeniyle idealdir.

Zebra balığı pankreası hem anatomik hem de işlevsel olarakmemelipankreasına benzer 4 . Bu nedenle, büyüklüğün benzersiz özellikleri, yüksek doğurganlık ve benzeri endokrin yapılar zebra balığını DM ile ilgili komplikasyonları incelemek için uygun bir aday haline getirir. Zebra balıklarında, DM'nin karakteristiği olan uzun süreli hiperglisemiyi teşvik etmek için kullanılan iki deneysel yöntem vardır: glikoz akını (modelleme Tip 2) ve insülin salgısının kesilmesi (modelleme Tip 1)5,6. Deneysel olarak, insülin salgısını durdurmak için, pankreas β hücreleri Streptozotocin (STZ) veya Alloxan enjeksiyonları kullanılarak kimyasal olarak yok edilebilir. STZ kemirgenlerde ve zebra balıklarında başarıyla kullanılmıştır, bu da retinopati7, 8,9,bilişsel bozukluklar10ve uzuv yenilenmesi11ile ilişkili komplikasyonlara neden olur. Bununla birlikte, zebra balıklarında, β hücreleri tedaviden sonra yenilenir ve diyabetik koşulları korumak için STZ'nin "güçlendirici enjeksiyonlarının" gerekli olmasına neden olur12. Alternatif olarak, zebra balığının pankreası çıkarılabilir6. Bunlar, çoklu enjeksiyonlar ve kapsamlı iyileşme süresi nedeniyle hem son derece invaziv prosedürlerdir.

Tersine, hiperglisemi eksojen glikoz maruziyeti yoluyla noninvaziv olarak indüklenebilir. Bu protokolde, balıklar 24 saat 5 , 13 veya sürekli olarak 2 haftaboyunca 14 ,15,16için yüksek konsantre bir glikoz çözeltisinebatırılır. Ekzojen glikoz transdermally, yutularak ve/veya solungaçlar boyunca alınarak kan şekeri seviyesinin yükselmesine neden olur. Bu non-invaziv teknik doğrudan insülin seviyelerini manipüle etmediğinden, Tip 2 DM'yi indüklediğini iddia edemez. Bununla birlikte, Tip 2 DM'nin ana semptomlarından biri olan hiperglisemi tarafından indüklenen komplikasyonları incelemek için kullanılabilir.

Son zamanlarda, zebra balığı mutant pdx1-/- insanlarda Tip 2 DM'nin genetik nedeni ile bağlantılı bir gen olan pankreas ve duodenal homeobox 1 geni manipüle ederek geliştirilmiştir. Bu mutant kullanarak, araştırmacılar pankreas gelişimi bozulmasını, yüksek kan şekerini çoğaltabildiler ve hiperglisemi kaynaklı diyabetik retinopatiyi incelemeyi başardılar17,18.

Bu yazıda, alternatif bir daldırma protokolü kullanan noninvaziv hiperglisemi indüksiyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, sonraki komplikasyonların gözlenmesiyle hiperglipsemik durumları 8 haftaya kadar korur. Kısacası, yetişkin zebra balıkları 24 saat boyunca bir şeker çözeltisine ve daha sonra 24 saat boyunca bir su çözeltisine yerleştirilir. Dış glikoz çözeltilerine sürekli daldırmanın aksine, şeker ve su arasındaki alternatif günler diyabette kan şekerinin yükselmesini ve düşmesini taklit eder. Alternatif bir glikoz protokolü ayrıca hiperglisemi'nin daha uzun süre indüklenir, çünkü zebra balığı yüksek dış glikoz koşullarını telafi edememektedir. İlke kanıtı olarak, bu protokol kullanılarak indüklenen hipergliseminin retina kimyasını ve fizyolojisini değiştirdiğini gösteren veriler sunuyoruz.

Protokol

Tüm prosedürler Amerikan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Çözelti Tanklarının Hazırlanması

  1. Her deney grubu için iki tane (glikoz, mannitol ve su) olmak üzere altı tank edinin. İki tanstan birini 'muhafaza tankı' olarak etiketle (balıkları barındıracak) ve diğer 'çözelti tankını' etiketle (çözümü tutacak).
    NOT: Mannitol arıtma grubu ozmotik kontrol, su arıtma grubu ise elleçleme/stres kontrolüdür. Tankların, havayollarının/hava taşlarının, kapakların ve temizlik malzemelerinin her tedavi grubu için ayrı tutulması önemlidir.
  2. Kullanılan toplam balık sayısı 20'den azsa 2 L tank kullanın. Kullanılan toplam balık sayısı 20'den fazlaysa 4 L'lik bir tank kullanın.
    NOT: Örnekleme zaman noktası başına tedavi grubu başına 5-10 N kullanın.
  3. Su sıcaklığını korumak için tankları 28-29 °C'de bir su banyosunda tutun.
  4. 1. Günde, balıkları 24 saat boyunca ('Tedaviye Su') kendi tedavi çözeltilerine (glikoz, mannitol, su) yerleştirin. 2. günde, balıkları arıtma çözeltilerinden 24 saat boyunca suya aktarın ('Suya Arıtma'). 3. günde, balıkları sudan arıtma çözeltilerine ('Sudan Arıtmaya') aktarın. Bu alternatif maruziyet deneyin geri kalanı için devam eder (Şekil 1). Su ile arıtılması gereken kontrol balıklarını günlük olarak sudan suya aktarın.
  5. Balıkların deney süresi boyunca her gün aynı 2 saatlik süre içinde beslendiğinden ve aktarıldığından emin olun.

2. Balığın hazırlanması

  1. Yetişkin zebra balığı kullanın (4 ay – 1 yıl)5.
  2. Laboratuvara vardıklarında her gün balık öğütülmüş Tetramin gevreği besleyin.
  3. Tüm tankların pH'ını ve sıcaklığını kaydedin ve balığın genel durumunu kaydedin.

3. Balık transferi

  1. Her tedavi grubundaki balıkları standart bir balık ağı kullanarak muhafaza tankından ilgili çözelti tankına aktarın.
  2. Balıkları içeren tankı su banyosuna geri yerleştirin, hava taşını ve tank kapağını değiştirin. Bu tank artık 'muhafaza tankı' ve daha önce balığı tutan tank artık 'çözüm tankı'.
  3. Glikoz ve mannitol birikmesini önlemek için eski çözeltiyi atın ve tankın kapakları, havayolları, hava taşları ve ağlarla birlikte temizleyin.
    NOT: Eşyaları sabunla yıkamayın. Tankları düzgün bir şekilde temizlemek için her tedavi durumu için su ve özel bir fırça / sünger kullanın.
  4. Yeni temizlenen 'çözelti tanklarını' kağıt havlu ile kurulayın. Bu tankı kullanarak çözümleri ertesi güne hazırlayın. Diğer eşyaların uygun tedavi grupları tarafından kurutulduğından ve ayrıldığından emin olun.
    NOT: Balıkların her gün hangi çözümlerden ve her güne aktarıldığı ve ertesi gün için hazırlanan çözümlerin bir günlüğünü tutun. Örneğin: Glikozdan H2O'ya aktarılan balıklar, yarın için hazırlanan yeni% 1 glikoz çözeltisi.

4. Transfer sonrası çözüm hazırlığı

  1. Şeker çözeltileri hazırlama
    1. Her çözelti tankını 2 L (veya 4 L) Sistem Suyu ile doldurun (sistem suyu, doğru tuz çözeltisi oranıyla arıtilmiş ve stok ve arıtma tanklarıyla aynı sıcaklıkta olan su olarak tanımlanır).
    2. Her kimyasal için bir üst yükleme ölçeği ve ayrı tartım tekneleri kullanarak doğru miktarda glikoz ve mannitol ölçün (aşağıdaki adım 5'e bakın).
    3. Tartılmış glikoz veya mannitol aliquot'ı sadece sistem suyu içeren uygun, temizlenmiş çözelti tankına ekleyin.
    4. Glikoz ve mannitol çözeltilerini ayrı cam karıştırma çubuklarıyla şekerler tamamen çözünene kadar karıştırın.
    5. Çözelti tanklarını su banyosuna geri verin ve ilgili kapaklarıyla örtün.
  2. Su çözeltileri hazırlama
    1. Deneysel tankları (2 L veya 4 L) Sistem Suyu ile doldurun.
    2. Bu 'çözelti tanklarını' su banyosuna geri verin ve ilgili kapaklarıyla örtün.

5. Değişen yüzdeler

  1. Tedavinin ilk 2 haftasında balığı% 1 çözeltide koruyun: 4 L tankta 40 g glikoz veya mannitol.
  2. Balığı tedavinin 3 ve 4. haftalarında% 2'lik bir çözeltide tutun: 4 L tankta 80 g glikoz veya mannitol.
  3. Son 4 haftalık tedavi için balığı% 3'lük bir çözeltide koruyun: 4 L tankta 120 g glikoz veya mannitol.

6. Kan şekeri seviyelerinin ölçülmesi ve doku toplanması

  1. Balıkları% 0.02 Tricaine çözeltisinde bir seferde 2 anestezi edin.
  2. Jilet kullanarak balığın kafasını doğrudan solungaçların arkasına geçirin.
  3. Kan şekeri değerini ölçün.
    NOT: Kan şekeri ölçmek ve test şeridini doğrudan maruz kalan kalbe (kardiyak kan örneği) yerleştirmek için bir kan şekeri ölçer (örneğin Freestyle Lite) kullanırız.
  4. Balıktan istenen dokuyu (beyin, kas vb.) parçalara ayrıştırın.
  5. Toplanan dokuyu kuru buz üzerinde flaş dondurma ve -80 °C dondurucuda saklayarak, %4 paraformaldehitte sabitleyerek veya hemen kullanım için bir tampon çözeltisine yerleştirerek saklayın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak (Şekil 1), kan şekeri değerleri hem 4 haftalık hem de 8 haftalık tedaviden sonra önemli ölçüde yükselir (Şekil 2A), hiperglisemi hem su ile arıtılmış hem de mannitol ile işlenmiş gruplardan kontrol ortalamalarının 3 katı olarak tanımlanır. Su ile arıtılması kontroller günlük olarak suya girip çıkar ve dışarı aktarılarak stres/elleçleme kontrolü sağlanmaktadır. Mannitol, in vitro glikoz çalışmalar?...

Tartışmalar

Diyabet ülke çapında bir sorundur. Çalışmalar, 2030'a kadar yaklaşık 400 milyon kişinin bir tür diyabete sahip olacağını göstermektedir. Kemirgen modellerinde, Tip 2 DM genetik manipülasyon kullanılarak incelenir. Sıçanlarda, Zucker diyabetik yağlı sıçanlar (ZDF) ve Otsuka Long-Evans Tokushima yağlı sıçanları (OLETF), Tip 2 DM10'unetkileri hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ek olarak, kemirgenlerde hiperglisemiyi teşvik etmek için yüksek yağlı diyetler kullanılmı...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu protokolün geliştirilmesi için VPC, CJR ve MCP'yi kabul etmek istiyoruz. EMM, bu araştırmayı yürütmek için Amerikan Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Lisansüstü Öğrenci Desteği'nden finansal destek aldı. Bu çalışma aynı zamanda bir Amerikan Üniversitesi Fakültesi Mellon Ödülü ve Amerikan Üniversitesi Sanat ve Bilim Koleji (her ikisi de VPC'ye) aracılığıyla finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Airline Tubingpetsmart5291863This can be used in the tank to circulate air
Airpumppetsmart5094984This can be used in the tank to circulate air
Airstonespetsmart5149683This can be used in the tank to circulate air
D-glucoseSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros OrganicsAC125340050
Freestyle Lite MeterAmazonB01LMOMLTU
Freestyle Lite StripsAmazonB074ZN3H2Z
Netpetsmart5175115
TanksAmazonB0002APZO4

Referanslar

  1. Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
  2. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
  4. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  5. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
  6. Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
  7. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
  8. Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
  9. Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
  10. Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
  11. Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).
  12. Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , (2013).
  13. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
  14. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  15. Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
  16. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
  17. Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43 (2020).
  18. Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
  19. Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
  20. Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
  21. Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
  22. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
  23. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
  24. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
  25. Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
  26. Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
  27. Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
  28. Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
  29. Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
  30. Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  31. Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
  32. Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
  33. Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
  34. Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
  35. Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 171Danio rerioHiperglisemiGlikozRetinopatiAlternatif Dald rma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır