Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra

Resumen

Este protocolo no invasiva induce hiperglucemia en el pez cebra durante un tiempo de hasta 8 semanas. Usando este protocolo, un estudio profundizado de los efectos nocivos de la hiperglucemia puede ser hecho.

Resumen

Los peces cebra(Danio rerio)son un excelente modelo para investigar los efectos de la hiperglucemia crónica, un sello distintivo de la Diabetes Mellitus Tipo II (DM2). Este protocolo alternativo de inmersión es un método no invasivo y gradual para inducir la hiperglucemia hasta por ocho semanas. Los peces cebra adultos se exponen alternativamente al azúcar (glucosa) y al agua durante 24 horas cada uno. El pez cebra comienza el tratamiento en una solución de glucosa al 1% durante 2 semanas, luego una solución al 2% durante 2 semanas y, finalmente, una solución al 3% durante las 4 semanas restantes. En comparación con los controles tratados con agua (estrés) y manitol (osmóticos), el pez cebra tratado con glucosa tiene niveles de azúcar en la sangre significativamente más altos. El pez cebra tratado con glucosa muestran niveles de azúcar en la sangre de 3 veces el de los controles, lo que sugiere que después de cuatro y ocho semanas se puede lograr la hiperglucemia. La hiperglucemia continua fue asociada a la proteína ácida fibrilosa glial creciente (GFAP) y a los niveles nucleares crecientes de la Kappa B (N-F-kB) del factor en retina y a respuestas fisiológicas disminuidas, así como los déficits cognoscitivos que sugerían que este protocolo se puede utilizar para modelar complicaciones de la enfermedad.

Introducción

El pez cebra(Danio rerio)se está convirtiendo rápidamente en un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar tanto la enfermedad como la cognición^1. La facilidad de la manipulación genética y la transparencia embrionaria a través de las primeras etapas del desarrollo, los convierten en un candidato principal para estudiar enfermedades humanas con una base genética conocida. Por ejemplo, el pez cebra se ha utilizado para estudiar el síndrome de Holt-Oram, las cardiomiopatías, la enfermedad renal glomerulocística, la distrofia muscular y la diabetes mellitus (DM) entre otras enfermedades^1. Además, el modelo de pez cebra es ideal debido al pequeño tamaño de la especie, la facilidad de mantenimiento y la alta fecundidad^2,3.

El páncreas del pez cebra es anatómica y funcionalmente similar al páncreas de^{mamíferos 4}. Por lo tanto, las características únicas de tamaño, alta fecundidad y estructuras endocrinas similares hacen del pez cebra un candidato adecuado para estudiar las complicaciones relacionadas con la DM. En el pez cebra, existen dos métodos experimentales utilizados para inducir la hiperglucemia prolongada que es característica de la DM: una afluencia de glucosa (modelado tipo 2) y el cese de la secreción de insulina (modelado tipo 1)^5,6. Experimentalmente, para parar la secreción de la insulina, las β-células pancreáticas se pueden destruir químicamente usando las inyecciones del Streptozotocin (STZ) o del Alloxan. STZ se ha utilizado con éxito en roedores y pez cebra, dando lugar a complicaciones asociadas con^{la retinopatía 7,8,9,}deterioro cognitivo^10,y la regeneración de extremidades^11. Sin embargo, en el pez cebra, las células β se regeneran después del tratamiento, haciendo que las "inyecciones de refuerzo" de STZ sean necesarias para mantener las condiciones diabéticas¹². Alternativamente, el páncreas del pez cebra se puede extirpar⁶. Estos son procedimientos altamente invasivos, debido a las múltiples inyecciones, y un extenso tiempo de recuperación.

Inversamente, la hiperglucemia se puede inducir no invasor con la exposición a la glucosa exógena. En este protocolo, los peces se sumergen en una solución de glucosa altamente concentrada durante 24 horas^5,13 o continuamente durante 2 semanas^14,15,16. La glucosa exógena se toma por vía transdérmica, por ingestión, y /o a través de las branquias, lo que resulta en niveles elevados de azúcar en la sangre. Dado que esta técnica no invasiva no manipula directamente los niveles de insulina, no puede pretender inducir dm tipo 2. Sin embargo, se puede utilizar para examinar las complicaciones inducidas por la hiperglucemia, que es uno de los principales síntomas de la DM tipo 2.

Recientemente, el mutante de pez cebra pdx1^-/- fue desarrollado mediante la manipulación del gen homeobox 1 pancreático y duodenal, un gen vinculado a la causa genética del tipo 2 DM en humanos. Usando este mutante, los investigadores han podido replicar la interrupción del desarrollo pancreático, el alto nivel de azúcar en la sangre y estudiar la retinopatía diabética inducida por hiperglucemia^17,18.

En este papel, describimos un método no invasor de la inducción de la hiperglucemia que utilice un protocolo de la inmersión que se alterna. Este protocolo mantiene condiciones hyperglycemic por hasta 8 semanas con las complicaciones subsecuentes observadas. En resumen, los peces cebra adultos se colocan en una solución de azúcar durante 24 horas y luego en una solución de agua durante 24 horas. A diferencia de la inmersión continua en soluciones externas de glucosa, la alternancia de días entre el azúcar y el agua imita el aumento y la caída del azúcar en la sangre en la diabetes. Un protocolo de glucosa alterna, además, permite que la hiperglucemia sea inducida por períodos de tiempo más largos, ya que el pez cebra no es tan capaz de compensar las altas condiciones externas de glucosa. Como prueba del principio, proporcionamos los datos que muestran que la hiperglucemia inducida usando este protocolo altera química y fisiología retinianas.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de american university.

1. Preparación de los tanques de solución

1. Obtenga seis tanques, dos para cada grupo experimental (glucosa, manitol y agua). Etiquete uno de los dos tanques como "tanque de alojamiento" (albergará el pescado) y etiquete el otro "tanque de solución" (sostendrá la solución).
   NOTA: El grupo de tratamiento de manitol es el control osmótico, y el grupo de tratamiento de agua es un control de manejo / estrés. Es importante mantener los tanques, las líneas aéreas/airstones, las tapas y los suministros de limpieza separados para cada grupo de tratamiento
2. Utilice un tanque de 2 L si el número total de peces utilizados es menor que 20. Utilice un tanque de 4 L si el número total de peces utilizados es superior a 20.
   NOTA: Utilice un N de 5-10 por grupo de tratamiento por punto de tiempo de muestreo.
3. Mantenga los tanques en un baño de agua a 28-29 °C para mantener la temperatura del agua.
4. El día 1, coloque los peces en sus respectivas soluciones de tratamiento (glucosa, manitol, agua) durante 24 horas ('Agua a tratamiento'). El día 2, transfiera los peces de sus soluciones de tratamiento al agua durante 24 horas ('Tratamiento a agua'). El día 3, transfiera los peces del agua a las soluciones de tratamiento ('Agua a tratamiento'). Esta exposición alterna continúa durante el resto del experimento (Figura 1). Transfiera diariamente los peces de control tratados con agua del agua al agua.
5. Asegúrese de que los peces sean alimentados y transferidos dentro de la misma ventana de 2 horas cada día durante la duración del experimento.

2. Preparación del pescado

1. Utilizar pez cebra adulto (4 meses – 1 año)⁵.
2. Alimente a los peces molidos con escamas tetramin diariamente a su llegada al laboratorio.
3. Registrar el pH y la temperatura de todos los tanques y registrar el estado general de los peces.

3. Transferencia de peces

1. Transfiera los peces de cada grupo de tratamiento del tanque de alojamiento al tanque de solución correspondiente utilizando una red de pescado estándar.
2. Coloque el tanque que contiene los peces de nuevo en el baño de agua, reemplace la piedra de aire y la tapa del tanque. Este tanque es ahora el "tanque de alojamiento" y el tanque que anteriormente contenía el pez es ahora el "tanque de solución".
3. Deseche la solución vieja y limpie el tanque, junto con las tapas del tanque, las líneas aéreas, las piedras de aire y las redes para evitar la acumulación de glucosa y manitol.
   NOTA: No lave los artículos con jabón. Use agua y un cepillo/esponja de exfoliación dedicado para cada condición de tratamiento para limpiar adecuadamente los tanques.
4. Seque los "tanques de solución" recién limpiados con una toalla de papel. Prepare las soluciones para el día siguiente utilizando este tanque. Asegúrese de que los demás elementos estén secos y separados por los grupos de tratamiento apropiados.
   NOTA: Mantenga un registro de las soluciones de las que los peces se transfieren fuera y hacia cada día, así como las soluciones que se preparan para el día siguiente. Por ejemplo: Pescado transferido de glucosa a_H2O, nueva solución de glucosa al 1% preparada para mañana.

4. Preparación de la solución posterior a la transferencia

1. Preparación de soluciones de azúcar
   1. Llene cada tanque de solución con 2 L (o 4 L) de agua del sistema (el agua del sistema se define como el agua que ha sido tratada con la proporción correcta de solución salina y está a la misma temperatura que los tanques de stock y tratamiento).
   2. Mida la cantidad correcta de glucosa y manitol (consulte el paso 5 a continuación) utilizando una báscula de carga superior y botes de pesaje separados para cada producto químico.
   3. Agregue la alícuota de glucosa o manitol pesada al tanque de solución limpia apropiado, que contiene solo agua del sistema.
   4. Revuelva las soluciones de glucosa y manitol con barras de agitación de vidrio separadas hasta que los azúcares se disuelvan por completo.
   5. Devolver los tanques de solución al baño de agua y cubrir con sus correspondientes tapas.
2. Preparación de soluciones de agua
   1. Llene los tanques experimentales (2 L o 4 L) con agua del sistema.
   2. Devuelva estos 'tanques de solución' al baño de agua y cubra con sus tapas correspondientes.

5. Cambio de porcentajes

1. Mantenga el pescado en una solución al 1% durante las primeras 2 semanas de tratamiento: 40 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.
2. Mantener el pescado en una solución al 2% durante las semanas 3 y 4 de tratamiento: 80 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.
3. Mantenga el pescado en una solución al 3% durante las últimas 4 semanas de tratamiento: 120 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.

6. Medición de los niveles de glucosa en sangre y recolección de tejido

1. Anestesiar los peces 2 a la vez en una solución Tricaine al 0,02%.
2. Decapitar los peces directamente detrás de las branquias usando una navaja de afeitar.
3. Mida el valor del azúcar en la sangre.
   NOTA: Utilizamos un medidor de glucosa en sangre (por ejemplo, Freestyle Lite) para medir la glucosa en sangre y colocar la tira reactiva directamente en el corazón expuesto (muestra de sangre cardíaca).
4. Diseccionar el tejido deseado de los peces (cerebro, músculo, etc.).
5. Almacene el tejido recolectado mediante congelación repentina sobre hielo seco y almacenamiento en un congelador de -80 °C, fijando en paraformadehído al 4% o colocándolo en una solución tampón para uso inmediato.

Resultados

Utilizando este protocolo(Figura 1),los valores de azúcar en sangre se elevan significativamente después de 4 semanas y 8 semanas de tratamiento(Figura 2A),con hiperglucemia definida como 3 veces los promedios de control de los grupos tratados con agua y manitol. Los controles tratados con agua se transfieren dentro y fuera del agua diariamente, proporcionando un control de estrés / manejo. El manitol sirve como un control osmótico en estudios de glucosa in ...

Discusión

La diabetes es un problema nacional. Los estudios muestran que para 2030, se estima que 400 millones de personas tendrán algún tipo de diabetes. En modelos de roedores, la DM tipo 2 se estudia mediante manipulación genética. En ratas, las ratas grasas diabéticas de Zucker (ZDF), y las ratas grasas de Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), están proporcionando más información sobre los efectos del tipo - 2 DM^10. Además, las dietas altas en grasas se han utilizado en roedores para inducir hip...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airline Tubing	petsmart	5291863	This can be used in the tank to circulate air
Airpump	petsmart	5094984	This can be used in the tank to circulate air
Airstones	petsmart	5149683	This can be used in the tank to circulate air
D-glucose	Sigma	G8270-5KG
D-mannitol	Acros Organics	AC125340050
Freestyle Lite Meter	Amazon	B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips	Amazon	B074ZN3H2Z
Net	petsmart	5175115
Tanks	Amazon	B0002APZO4