交替浸入葡萄糖中，在斑马鱼中产生长期血糖超血症

摘要

此协议非侵入性地诱发斑马鱼高血糖长达 8 周。利用这一协议，可以深入研究高血糖的不利影响。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）是研究慢性高血糖影响的优秀模型，这是 II 型糖尿病 （T2DM） 的标志。这种替代浸入协议是一种非侵入性的、循步骤的方法，可诱导高血糖长达八周。成年斑马鱼交替接触糖（葡萄糖）和水，每次24小时。斑马鱼开始用1%的葡萄糖溶液治疗2周，然后用2%的溶液治疗2周，最后在剩下的4周内进行3%的溶液治疗。与水处理（压力）和曼尼托处理（渗透）对照相比，葡萄糖处理斑马鱼的血糖水平显著较高。经过葡萄糖处理的斑马鱼的血糖水平是对照组的3倍，这表明在4周和8周后可以达到高血糖。持续性高血糖与胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 增加、心网膜核因子 Kappa B （NF-kB） 水平增加、生理反应下降以及认知缺陷有关，表明此协议可用于模拟疾病并发症。

引言

斑马鱼（丹尼奥·雷里奥）正在迅速成为一个广泛使用的动物模型，以研究疾病和认知^1。基因操纵的易受干扰和胚胎透明性在早期发育阶段，使他们成为研究人类疾病的主要候选者与已知的遗传基础。例如，斑马鱼已经被用来研究霍尔特-奥拉姆综合征，心肌病，球状细胞性肾脏疾病，肌肉萎缩症和糖尿病（DM）等疾病^1。此外，斑马鱼模型是理想的，因为该物种的体积小，维护方便，和高粪便^2，3。

斑马鱼胰腺在解剖学上和功能上都与哺乳动物胰腺⁴相似。因此，斑马鱼具有体型大、肥大和内分泌结构相似的独特特征，因此斑马鱼成为研究DM相关并发症的合适人选。在斑马鱼中，有两种实验方法用于诱导DM特有的长时间高血糖:葡萄糖的流入（建模2型）和胰岛素分泌的停止（建模1型^）5、6。在实验中，为了阻止胰岛素分泌，胰腺β细胞可以通过链球菌素（STZ）或Aloxan注射进行化学破坏。STZ已成功地用于啮齿动物和斑马鱼，导致并发症与视网膜病变^7，8，9，认知障碍^10，和肢体再生^11。然而，在斑马鱼中，β细胞在治疗后再生，导致STZ的"助推器注射"成为维持糖尿病状况所必需的^。或者，斑马鱼的胰腺可以去除^6。这些都是高度侵入性的程序，由于多次注射，和广泛的恢复时间。

相反，高血糖可以通过接触外源性葡萄糖来非侵入性地诱发。在此协议中，鱼被淹没在高度浓缩的葡萄糖溶液中24小时^5，13或连续2周14，15，16。外源性葡萄糖通过摄入和/或穿过刺，导致血糖水平升高而被跨皮吸走。由于这种非侵入性技术不直接操纵胰岛素水平，因此不能声称诱导2型DM。然而，它可以用来检查高血糖引起的并发症，这是2型DM的主要症状之一。

最近，斑马鱼突变pdx1-/-通过操纵胰腺和十二指肠家谱1基因，一种与人类2型DM的遗传原因相关的基因而开发的。利用这种突变体，研究人员已经能够复制胰腺发育中断，高血糖，并研究高血糖引起的糖尿病视网膜病变^17，18。

本文描述了一种使用交替浸入协议的非侵入性高血糖诱导方法。此协议维持高血糖条件长达 8 周，并观察到随后的并发症。简言之，成年斑马鱼被放置在糖溶液中24小时，然后放入水溶液中24小时。与持续浸入外部葡萄糖溶液相反，糖和水之间的交替天模拟糖尿病中血糖的上升和下降。此外，交替葡萄糖协议还允许高血糖在较长时间内诱发，因为斑马鱼无法补偿高外部葡萄糖条件。作为原则的证明，我们提供的数据表明，使用此协议诱导的血糖过高会改变视网膜化学和生理学。

研究方案

所有程序都得到了美国大学动物护理和使用机构委员会的批准。

1. 准备解决方案罐

1. 获得六个水箱，每个实验组两个（葡萄糖、曼尼托和水）。给两个储罐中的一个贴上"储罐"（它将容纳鱼）的标签，并给另一个"溶液罐"贴上标签（它将容纳溶液）。
   注:曼尼托治疗组为渗透控制，水处理组为处理/应力控制。重要的是要保持坦克，航空公司/航空石，盖子和清洁用品分开为每个治疗组
2. 如果使用的鱼总数小于 20，请使用 2 L 油箱。如果使用的鱼总数超过 20，请使用 4 L 油箱。
   注:每个采样时间点使用每个治疗组的N为5-10。
3. 将水箱保存在28-29°C的水浴中，以保持水温。
4. 第1天，将鱼放入各自的治疗液（葡萄糖、曼尼托、水）中，24小时（"水处理"）。在第2天，将鱼从其处理解决方案转移到水中24小时（"水处理"）。第3天，将鱼从水中转移到处理解决方案（"水到治疗"）。这种交替曝光继续为实验的其余部分（图1）。每天将水处理控制鱼从水中转移到水中。
5. 确保在整个实验期间，每天在同一 2 小时窗口内喂养和转移鱼类。

2. 准备鱼

1. 使用成年斑马鱼（4个月=1年^）5。
2. 抵达实验室后，每天喂鱼地利乐片。
3. 记录所有鱼缸的pH度和温度，并记录鱼的总体状况。

3. 转移鱼类

1. 使用标准鱼网将每个处理组中的鱼从外壳罐转移到相应的溶液罐中。
2. 将装有鱼的鱼缸放回水浴池，更换气石和鱼缸盖。这个鱼缸现在是"住宅罐"，以前装鱼的鱼缸现在是"溶液罐"。
3. 丢弃旧溶液并清洁油箱，以及油箱盖、航空公司、气石和网，以防止葡萄糖和曼尼托的积聚。
   注意:不要用肥皂清洗物品。使用水和专用磨砂刷/海绵为每个处理条件，以适当清洁水箱。
4. 用纸巾擦干新清洗的"溶液罐"。使用此油箱为第二天的解决方案做好准备。确保其他物品干燥，由适当的治疗组分离。
   注意:记录鱼每天进出的解决方案，以及为第二天准备的解决方案。例如:鱼从葡萄糖转移到H₂O，新的1%葡萄糖溶液为明天做好准备。

4. 转移后解决方案准备

1. 准备糖溶液
   1. 将每个溶液罐中填充 2 升（或 4 升）系统水（系统水定义为已处理过正确盐溶液比例且与库存和处理罐温度相同的水）。
   2. 使用顶部装载量表和每个化学品的单独称重船测量葡萄糖和曼尼托的正确量（见下文第 5 步）。
   3. 将称重葡萄糖或曼尼托阿利库特添加到适当的清洁溶液罐中，其中只含有系统水。
   4. 用单独的玻璃搅拌棒搅拌葡萄糖和曼尼托溶液，直到糖完全溶解。
   5. 将溶液罐返回到水浴池，并盖上相应的盖子。
2. 准备水解决方案
   1. 用系统水填充实验罐（2升或4升）。
   2. 将这些"溶液罐"返回水浴池，并盖上相应的盖子。

5. 更改百分比

1. 在治疗的前 2 周内，将鱼保持在 1% 的溶液中:4 升油箱中 40 克葡萄糖或曼尼托。
2. 在治疗的第 3 周和第 4 周将鱼保持在 2% 的溶液中:4 L 油箱中 80 克葡萄糖或曼尼托。
3. 在治疗的最后 4 周中，将鱼保持在 3% 的溶液中:4 L 水箱中 120 克葡萄糖或曼尼托。

6. 测量血糖水平和收集组织

1. 麻醉鱼2一次在0.02%的三卡因溶液。
2. 用剃须刀将鱼直接斩首在刺后面。
3. 测量血糖值。
   注意:我们使用血糖计（如自由式精简版）测量血糖，并将测试条直接放在暴露的心脏（心脏血液样本）上。
4. 从鱼（大脑、肌肉等）解剖通缉组织。
5. 通过在干冰上闪光冷冻和储存在 -80 °C 冰柜中，固定在 4% 的副甲醛中，或放入缓冲液中供立即使用来储存收集的组织。

结果

使用此协议（图 1），经过 4 周和 8 周的治疗（图 2A），血糖值显著升高，高血糖的定义是水处理组和曼尼托治疗组的控制平均值的 3 倍。水处理控制每天进出水，提供压力/处理控制。曼尼托在体外葡萄糖研究^19，20中充当渗透控制，因为它是一种6碳糖，如葡萄糖，但不被细胞占用。为了与这些研究和斑马鱼...

讨论

糖尿病是一个全国性的问题。研究表明，到2030年，估计有4亿人将患有某种形式的糖尿病。在啮齿动物模型中，使用基因操作研究2型DM。在大鼠中，扎克糖尿病脂肪大鼠（ZDF）和大须卡长埃文斯德岛脂肪大鼠（OLETF）提供了更多关于2型^DM10的影响的信息。此外，高脂肪饮食已用于啮齿动物诱发高血糖。这反映了本文中提出的非侵入性程序。使用我们的非侵入性协议，我们可以诱发?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Airline Tubing	petsmart	5291863	This can be used in the tank to circulate air
Airpump	petsmart	5094984	This can be used in the tank to circulate air
Airstones	petsmart	5149683	This can be used in the tank to circulate air
D-glucose	Sigma	G8270-5KG
D-mannitol	Acros Organics	AC125340050
Freestyle Lite Meter	Amazon	B01LMOMLTU
Freestyle Lite Strips	Amazon	B074ZN3H2Z
Net	petsmart	5175115
Tanks	Amazon	B0002APZO4