A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
والهدف من هذا البروتوكول هو توفير دليل مفصل خطوة بخطوة لتجميع البنى متعددة الجينات باستخدام نظام الاستنساخ المعياري القائم على استنساخ البوابة الذهبية. كما يقدم توصيات بشأن الخطوات الحاسمة لضمان التجميع الأمثل استنادا إلى خبراتنا.
تمكن طريقة استنساخ البوابة الذهبية من التجميع السريع لجينات متعددة في أي ترتيب يحدده المستخدم. ويستخدم نوع IIS تقييد الإنزيمات التي تقطع خارج مواقع الاعتراف بها وخلق تراكم قصيرة. يستخدم نظام الاستنساخ المعياري هذا (MoClo) سير عمل هرمي يتم فيه استنساخ أجزاء الحمض النووي المختلفة ، مثل المروجين وتسلسلات الترميز (CDS) والمنهيين ، لأول مرة في متجه إدخال. ناقلات دخول متعددة ثم تجميع في وحدات النسخ. ثم تتصل عدة وحدات نسخ ببللازميد متعدد الجينات. استراتيجية الاستنساخ البوابة الذهبية هي ميزة هائلة لأنها تسمح ندبة أقل، والاتجاه، والتجمع وحدات في رد فعل وعاء واحد. ويمكن سير العمل الهرمي عادة من الاستنساخ السهل لمجموعة كبيرة ومتنوعة من البنى المتعددة الجينات دون الحاجة إلى التسلسل خارج ناقلات الدخول. يتيح استخدام التسرب من البروتين الفلوري الفحص البصري السهل. يوفر هذا العمل بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة الاستنساخ المعياري للخمائر (MoClo). نعرض النتائج المثلى ودون المستوى الأمثل لتجميع البلازميد متعدد الجينات ونقدم دليلا لفحص المستعمرات. وتنطبق استراتيجية الاستنساخ هذه إلى حد كبير على هندسة التمثيل الغذائي للخمائر وغيرها من الحالات التي يلزم فيها استنساخ البلازميد المتعدد الجينات.
تهدف البيولوجيا التركيبية إلى هندسة النظم البيولوجية مع وظائف جديدة مفيدة للصناعات الصيدلانية والزراعية والكيميائية. تجميع أعداد كبيرة من شظايا الحمض النووي بطريقة عالية الإنتاجية هو تقنية أساسية في البيولوجيا الاصطناعية. مثل هذه العملية المعقدة يمكن أن تنهار إلى مستويات متعددة مع انخفاض التعقيد ، وهو مفهوم مستعار من العلوم الهندسية الأساسية1،2. في البيولوجيا التركيبية، عادة ما تتجمع شظايا الحمض النووي بشكل هرمي استنادا إلى الوظيفة: '1' مستوى الجزء: تشير "الأجزاء" إلى شظايا الحمض النووي ذات وظيفة محددة، مثل المروج، وتسلسل الترميز، والمنهي، وأصل النسخ المتماثل؛ و'2' العوامل التي يمكن أن تكون ذات طبيعة مختلفة. '2' مستوى وحدات النسخ: تتكون الوحدة من مروج وتسلسل ترميز ومنهي قادر على نسخ جين واحد؛ '3' المستوى المتعدد الجينات: يحتوي البلازميد المتعدد الجينات على عدة وحدات ثلاثية المستويات تتألف في كثير من الأحيان من مسار استقلابي كامل. هذا التجمع الهرمي رائدة من قبل المجتمع BioBrick هو المفهوم التأسيسي لتجميع مجموعات كبيرة من DNAs في البيولوجيا الاصطناعية3.
في العقد الماضي4،5،6،7، وقد سهلت تقنية استنساخ البوابة الذهبية بشكل كبير تجميع الحمض النووي الهرمي2. كما تم تطوير العديد من أساليب الاستنساخ متعددة الجزأة الأخرى ، مثل استنساخ جيبسون8، الاستنساخ المستقل عن الربط (SLIC)9، والاستنساخ القائم على الختان (USER)10، ورد فعل الدراجات ليغان (LCR)11، وفي إعادة دمج الجسم الحي (DNA Assembler)12،13، حتى الآن. ولكن استنساخ البوابة الذهبية هو طريقة مثالية لتجميع الحمض النووي لأنه مستقل عن التسلسلات الخاصة بالجينات ، مما يسمح بتجميع ندبة واتجاهية ووحدات في رد فعل وعاء واحد. يستفيد استنساخ البوابة الذهبية من إنزيمات تقييد IIS من النوع التي تتعرف على تسلسل غير باليندروميك لإنشاء تراكمات متداخلة خارج موقع التعرف2. ثم ينضم الليغاز إلى شظايا الحمض النووي الملدن للحصول على تجميع متعدد الأجزاء. وقد مكن تطبيق استراتيجية الاستنساخ هذه على نظام الاستنساخ المعياري (MoClo) من تجميع ما يصل إلى 10 شظايا الحمض النووي مع أكثر من 90٪ من المحولات التي تم فحصها والتي تحتوي على البناء المجمع بشكل صحيح4.
يوفر نظام MoClo مزايا هائلة عجلت بدورة التصميم والبناء والاختبار للبيولوجيا التركيبية. أولا، تمكن الأجزاء القابلة للتبديل الاستنساخ الجمعي من اختبار مساحة كبيرة من المعلمات بسرعة. على سبيل المثال، يتطلب تحسين المسار الأيضي عادة ركوب الدراجات من خلال العديد من المروجين لكل جين لتحقيق التوازن بين تدفق المسار. يمكن لنظام MoClo التعامل بسهولة مع مهام الاستنساخ المطلوبة. ثانيا، يحتاج المرء إلى تسلسل الجزء البلازميد ولكن عادة ليس TU أو البلازميدات متعددة الجينات. في معظم الحالات، الفحص عن طريق PCR مستعمرة أو تقييد الهضم كافية للتحقق على مستوى TU ومتعددة الجينات البلازميد. وذلك لأن استنساخ جزء البلازميد هو الخطوة الوحيدة التي تتطلب PCR، الذي يدخل في كثير من الأحيان الطفرات. ثالثا، نظام موكلو مثالي لبناء مسارات التمثيل الغذائي المعقدة متعددة الجينات. وأخيرا، بسبب التراكمات العالمية، يمكن إعادة استخدام الجزء البلازميدات ومشاركتها مع مجتمع الهندسة الحيوية بأكمله. حاليا، مجموعات موكلو متوفرة للنباتات14،15،5،16،17، الفطريات6،18،19،20،21،22، البكتيريا7،23،24،25،26،27، والحيوانات28،29. كما تم تقديم منصة MoClo متعددة المملكة مؤخرا30.
لSaccharomyces cerevisiae, وقد وضعت لي وآخرون6 مجموعة أدوات موكلو تنوعا, مورد ممتاز للمجتمع البيولوجيا الاصطناعية الخميرة. تأتي هذه المجموعة في شكل مريح من 96 بئرا وتحدد ثمانية أنواع من أجزاء الحمض النووي القابلة للتبديل مع مجموعة متنوعة من المروجين المميزين ، والبروتينات الفلورية ، والمنهيين ، وعلامات الببتيد ، وعلامات الاختيار ، وأصل النسخ المتماثل ، وأدوات تحرير الجينوم. تسمح مجموعة الأدوات هذه بتجميع ما يصل إلى خمس وحدات نسخ في بلازميد متعدد الجينات. هذه الميزات هي قيمة لهندسة التمثيل الغذائي الخميرة، التي يتم التعبير عن مسارات جزئية أو كاملة لإنتاج المواد الكيميائية المستهدفة. باستخدام هذه المجموعة، وقد الأمثل الباحثين إنتاج geraniol، linalool31،البنسلين32،حمض موكونيك33،النيلي34،وبيتالين35 في الخميرة.
هنا نقدم مفصلة، خطوة بخطوة بروتوكول لتوجيه استخدام مجموعة أدوات موكلو لتوليد مسارات متعددة الجينات للتعبير إما الظهارية أو الجينومية. من خلال الاستخدام المكثف لهذه المجموعة ، وجدنا أن القياس الدقيق لتركيزات الحمض النووي هو المفتاح لضمان توزيع الاعتدال لكل جزء في رد فعل البوابة الذهبية. ونحن نوصي أيضا ليغان الحمض النووي T4 على ليغاس الحمض النووي T7 لأن الأول يعمل بشكل أفضل مع أعداد أكبر من يتدلى36. وأخيرا، يجب إزالة أي مواقع اعتراف داخلية من BsmBI و BsaI أو تدجينها قبل التجميع. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن ينظر في تجميع أجزاء لإزالة مواقع داخلية متعددة وتحقيق الأمثل codon في وقت واحد. نحن نظهر كيفية استخدام مجموعة الأدوات هذه من خلال التعبير عن مسار من خمسة جينات لإنتاج β كاروتين والليكوبين في S. cerevisiae. نعرض كذلك كيفية ضرب موقع ADE2 باستخدام أدوات تحرير الجينوم من هذه المجموعة. تم اختيار هذه التجارب القائمة على الألوان لسهولة التصور. كما أننا نبين كيفية توليد بروتينات الاندماج وخلق طفرات الأحماض الأمينية باستخدام استنساخ البوابة الذهبية.
ملاحظة: يمكن تقسيم بروتوكول الاستنساخ الهرمي المعروض في مجموعة الأدوات هذه إلى ثلاث خطوات رئيسية: 1. استنساخ جزء البلازميدات؛ 2. 2. استنساخ وحدات النسخ (TUs)؛ 3. استنساخ البلازميدات متعددة الجينات (الشكل 1). يبدأ هذا البروتوكول من تصميم التمهيدي وينتهي بتطبيقات البلازميد المستنسخ متعدد الجينات.
1. تصميم التمهيدي لاستنساخ الجزء plasmid (pYTK001):
2. استنساخ أجزاء في متجه الدخول (pYTK001) لإنشاء جزء plasmids (الشكل 2B)
3. تجميع جزء plasmids في "كاسيت" البلازميدات
ملاحظة: يحتوي كاسيت بلازميد على وحدة نسخ معرفة من قبل المستخدم (TU) تتكون من مروج وCDS ومنهي. يسمح شريط كاسيت بلازميد بالتعبير عن جين واحد. إذا كان سيتم تجميع plasmids كاسيت في البلازميد متعدد الجينات، ثم الخطوة الأولى هي لتحديد عدد وترتيب TUs في البلازميد متعدد الجينات. هذه ستحدد الموصلات التي لاستخدامها في plasmids كاسيت منذ الموصلات ربط TUs في البلازميد متعدد الجينات. يجب أن يكون الموصل الأيسر ل TU الأول ConLS، ويجب أن يكون الموصل الأيمن ل TU الأخير ConRE. وسوف تتداخل مع ConLS 'وConRE' من البلازميدات متعددة الجينات. وينبغي أن تكون بقية الموصلات في الترتيب العددي المتزايد. على سبيل المثال، إذا كان البلازميد متعدد الجينات يحتوي على أربع وحدات ثلاثية التوليفات، فإن تركيبات الموصل ستكون ConLS-TU1-ConR1 وConL1-TU2-ConR2 وConL2-TU3-ConR3 وConL3-TU4-ConRE(الشكل 1).
4. تجميع الكاسيت البلازميدات في البلازميدات "متعددة الجينات":
ملاحظة: تسمح البلازميدات متعددة الجينات بالتعبير عن أكثر من جين واحد. اعتمادا على تطبيق المصب، يمكن أن تكون البلازميدات متعددة الجينات متماثلة أو تكاملية. البلازميدات المستنسخة لها أصل الخميرة من النسخ المتماثل. ولذلك، فإنه يمكن الحفاظ عليها بشكل ثابت عندما يقسم خلية الخميرة. البلازميدات التكاملية ليس لديها أصل الخميرة من النسخ المتماثل. بدلا من ذلك، لديهم 5 'و 3' أسلحة الشوم السماح لدمج جينات متعددة في loci محددة من الجينوم من خلال إعادة التركيب متجانسة.
5. تطبيق البلازميدات متعددة الجينات للتعبير الجيني الكروموسومي أو القائم على البلازميد
هنا نتائج أربعة plasmids متعددة الجينات المستنسخة لإنتاج β كاروتين (الأصفر) والليكوبين (الأحمر). تم بناء بلازميد متعدد الجينات التكاملي لتعطيل موقع ADE2 ، والمستعمرات منها حمراء.
استنساخ CDSs في متجه الإدخال (pYTK001)
تم تضخيم ERG20...
توفر مجموعة الاستنساخ القائمة على MoClo التي طورها Lee et al. موردا ممتازا للتجميع السريع لوحدات النسخ من واحد إلى خمسة في بلازميد متعدد الجينات إما للتكرار أو الاندماج في جينوم الخميرة. استخدام هذه المجموعة يلغي اختناق الاستنساخ المستهلكة للوقت التي توجد في كثير من الأحيان للتعبير عن جينات مت?...
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث لجامعة ولاية نيويورك (الجائزة رقم: 71272) وجائزة IMPACT للجامعة في بافالو (الجائزة رقم: 000077).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved