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Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.
O método de clonagem golden gate permite a montagem rápida de múltiplos genes em qualquer arranjo definido pelo usuário. Ele utiliza enzimas de restrição tipo IIS que cortam fora de seus sites de reconhecimento e criam uma saliência curta. Este sistema de clonagem modular (MoClo) usa um fluxo de trabalho hierárquico no qual diferentes partes de DNA, como promotores, sequências de codificação (CDS) e terminadores, são primeiramente clonadas em um vetor de entrada. Vários vetores de entrada então se reúnem em unidades de transcrição. Várias unidades de transcrição então se conectam a um plasmídeo multi-gene. A estratégia de clonagem da Golden Gate é de tremenda vantagem porque permite um conjunto sem cicatrizes, direcional e modular em uma reação de um pote. O fluxo de trabalho hierárquico normalmente permite a clonagem fácil de uma grande variedade de construções multigênicas sem necessidade de sequenciamento além dos vetores de entrada. O uso de evasão de proteínas fluorescentes permite uma triagem visual fácil. Este trabalho fornece um protocolo detalhado passo a passo para a montagem de plasmídeos multi-genes usando o kit de clonagem modular de levedura (MoClo). Mostramos resultados ótimos e subótimos da montagem plasmida multigênica e fornecemos um guia para triagem para colônias. Esta estratégia de clonagem é altamente aplicável para a engenharia metabólica de levedura e outras situações em que a clonagem plasmida multi-gene é necessária.
A biologia sintética visa projetar sistemas biológicos com novas funcionalidades úteis para indústrias farmacêuticas, agrícolas e químicas. Reunir um grande número de fragmentos de DNA de forma de alto rendimento é uma tecnologia fundamental em biologia sintética. Um processo tão complicado pode se dividir em múltiplos níveis com diminuição da complexidade, conceito emprestado das ciências básicas de engenharia1,2. Na biologia sintética, fragmentos de DNA geralmente se reúnem hierarquicamente com base na funcionalidade: (i) Nível de peça: "partes" refere-se a fragmentos de DNA com uma função específica, como um promotor, uma sequência de codificação, um exterminador, uma origem da replicação; (ii) Unidades de transcrição (TU) nível: um TU consiste de um promotor, uma sequência de codificação e um exterminador capaz de transcrever um único gene; (iii) Nível multi-gene: um plasmídeo multi-gene contém múltiplas TUs frequentemente compostas de toda uma via metabólica. Esta montagem hierárquica pioneira pela comunidade BioBrick é o conceito fundamental para a montagem de grandes conjuntos de DNAs em biologia sintética3.
Na últimadécada, 4,5,6,7,a técnica de clonagem golden gate facilitou significativamente o conjunto hierárquico de DNA2. Muitos outros métodos de clonagem em várias partes, como a clonagem gibson8,clonagem independente de ligadura (SLIC)9,clonagem baseada em excisão uracil (USUÁRIO)10,a reação de ciclismo ligase (LCR)11e a recombinação in vivo (Pedador de DNA)12,13, também foram desenvolvidos até agora. Mas a clonagem do Golden Gate é um método ideal de montagem de DNA porque é independente de sequências específicas de genes, permitindo montagem sem cicatrizes, direcionais e modulares em uma reação de um pote. A clonagem golden gate aproveita as enzimas de restrição tipo IIS que reconhecem uma sequência não palindômica para criar saliências escalonadas fora do local de reconhecimento2. Um ligase então se junta aos fragmentos de DNA ressarcidos para obter uma montagem em várias partes. A aplicação desta estratégia de clonagem ao sistema de clonagem modular (MoClo) permitiu a montagem de até 10 fragmentos de DNA com mais de 90% de transformadores rastreados contendo a construção corretamente montada4.
O sistema MoClo oferece enormes vantagens que aceleraram o ciclo de projeto-construção-teste da biologia sintética. Em primeiro lugar, as peças intercambiáveis permitem clonagem combinatória para testar um grande espaço de parâmetros rapidamente. Por exemplo, otimizar uma via metabólica geralmente requer ciclismo através de muitos promotores para cada gene para equilibrar o fluxo da via. O sistema MoClo pode facilmente lidar com tarefas de clonagem tão exigentes. Em segundo lugar, é preciso sequenciar a peça plasmid, mas tipicamente não o TU ou os plasmídeos multi-genes. Na maioria dos casos, a triagem por PCR colônia ou digestão de restrição é suficiente para verificação no nível TU e plasmídeo multi-gene. Isso porque a clonagem da peça plasmid é o único passo que requer PCR, que frequentemente introduz mutações. Em terceiro lugar, o sistema MoClo é ideal para construir vias metabólicas multigênicas complexas. Por fim, por causa das saliências universais, a parte plasmids pode ser reutilizada e compartilhada com toda a comunidade de bioengenharia. Atualmente, os kits MoClo estão disponíveis para plantas14,15,5,16,17, fungos6,18,19,20,21,22, bactérias7,23,24,25,26,27, e animais28,29. Uma plataforma MoClo multi-reinos também foi introduzida recentemente30.
Para Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 desenvolveram um versátil kit de ferramentas MoClo, um excelente recurso para a comunidade de biologia sintética de levedura. Este kit vem em um formato conveniente de 96 poços e define oito tipos de partes de DNA intercambiáveis com uma coleção diversificada de promotores bem caracterizados, proteínas fluorescentes, terminadores, tags de peptídeos, marcadores de seleção, origem da replicação e ferramentas de edição de genomas. Este kit de ferramentas permite a montagem de até cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene. Essas características são valiosas para a engenharia metabólica de levedura, na qual vias parciais ou inteiras são super expressas para produzir produtos químicos direcionados. Utilizando este kit, os pesquisadores otimizaram a produção de geraniol, linalool31,penicilina32, ácido mucorico33, índigo34e betalain35 em levedura.
Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para orientar o uso do kit de ferramentas MoClo para gerar caminhos multi-genes para expressão episômica ou genômica. Através do uso extensivo deste kit, descobrimos que a medição precisa das concentrações de DNA é fundamental para garantir a distribuição equimolar de cada parte na reação da Golden Gate. Também recomendamos a liga ligase de DNA T4 sobre a liga ligase de DNA T7 porque o primeiro funciona melhor com um número maior de saliências36. Por fim, quaisquer locais de reconhecimento interno de BsmBI e BsaI devem ser removidos ou domesticados antes da montagem. Alternativamente, pode-se considerar sintetizar peças para remover vários sites internos e alcançar a otimização simultânea do codon. Demonstramos como usar este kit de ferramentas expressando um caminho de cinco genes para a produção de β-caroteno e licopeno em S. cerevisiae. Nós ainda mostramos como derrubar o lócus ADE2 usando as ferramentas de edição de genomas deste kit. Esses experimentos baseados em cores foram selecionados para fácil visualização. Também demonstramos como gerar proteínas de fusão e criar mutações de aminoácidos usando a clonagem golden gate.
NOTA: O protocolo hierárquico de clonagem oferecido neste kit de ferramentas pode ser dividido em três etapas principais: 1. Plasmids de peça de clonagem; 2. Unidades de transcrição de clonagem (TUs); 3. Clonagem de plasmídeos multiédis(Figura 1). Este protocolo começa a partir do projeto primer e termina com aplicações do plasmídeo multi-gene clonado.
1. Design primer para clonagem da peça plasmid (pYTK001):
2. Clonagem de peças no vetor de entrada (pYTK001) para criar plasmídeos de peça(Figura 2B)
3. Montagem de plasmídeos em plasmídeos
NOTA: Um plasmídeo contém uma unidade de transcrição definida pelo usuário (TU) composta por um promotor, um CDS e um exterminador. Um plasmídeo permite a expressão de um único gene. Se os plasmídeos serão montados em um plasmídeo multi-gene, então o primeiro passo é determinar o número e a ordem de TUs no plasmídeo multi-gene. Estes determinarão quais conectores usar nos plasmídeos, uma vez que os conectores ligam TUs no plasmídeo multi-gene. O primeiro conector esquerdo do TU deve ser ConLS, e o conector direito do último TU deve ser ConRE. Eles se sobreporão com conls e ConRE' de plasmídeos multi-genes. O resto dos conectores devem estar na ordem numérica crescente. Por exemplo, se o plasmídeo multigênito contém quatro TUs, as combinações de conectores seriam ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 e ConL3-TU4-ConRE(Figura 1).
4. A montagem de plasmídeos de em plasmídeos multi-genes:
NOTA: Plasmídeos multiédis permitem a expressão de mais de um gene. Dependendo da aplicação a jusante, plasmídeos multi-genes podem ser replicativos ou integrativos. Plasmídeos replicativos têm a origem da levedura da replicação; portanto, pode ser mantido com estada quando a célula de levedura se divide. Plasmídeos integrativos não têm a origem da levedura da replicação. Em vez disso, eles têm braços de 5' e 3' homologia permitindo a integração de múltiplos genes em loci específicos do genoma através da recombinação homólogo.
5. Aplicando plasmídeos multi-genes para expressão genética cromossômica ou plasmida
Aqui estão os resultados de quatro pládidos multi-genes replicativos para produção de β-caroteno (amarelo) e licopeno (vermelho). Um plasmídeo multi-gene integrado para interromper o lócus ADE2 foi construído, das quais as colônias são vermelhas.
Clonagem de CDSs no vetor de entrada (pYTK001)
O ERG20 foi amplificado a partir do genoma da levedura e dos três genes carotenoides ...
O kit de clonagem baseado em MoClo desenvolvido por Lee et al. fornece um excelente recurso para montagem rápida de uma a cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene, seja para replicação ou integração no genoma da levedura. O uso deste kit elimina o demorado gargalo de clonagem que existe frequentemente para expressar múltiplos genes na levedura.
Testamos cinco condições diferentes para os ciclos de digestão/ligamento da clonagem golden gate com ligase de DNA T4. Desc...
Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi financiado pela Research Foundation para a Universidade Estadual de Nova York (Prêmio #: 71272) e pelo Impact Award of University at Buffalo (Prêmio #: 000077).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
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