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Resumo

O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Resumo

O método de clonagem golden gate permite a montagem rápida de múltiplos genes em qualquer arranjo definido pelo usuário. Ele utiliza enzimas de restrição tipo IIS que cortam fora de seus sites de reconhecimento e criam uma saliência curta. Este sistema de clonagem modular (MoClo) usa um fluxo de trabalho hierárquico no qual diferentes partes de DNA, como promotores, sequências de codificação (CDS) e terminadores, são primeiramente clonadas em um vetor de entrada. Vários vetores de entrada então se reúnem em unidades de transcrição. Várias unidades de transcrição então se conectam a um plasmídeo multi-gene. A estratégia de clonagem da Golden Gate é de tremenda vantagem porque permite um conjunto sem cicatrizes, direcional e modular em uma reação de um pote. O fluxo de trabalho hierárquico normalmente permite a clonagem fácil de uma grande variedade de construções multigênicas sem necessidade de sequenciamento além dos vetores de entrada. O uso de evasão de proteínas fluorescentes permite uma triagem visual fácil. Este trabalho fornece um protocolo detalhado passo a passo para a montagem de plasmídeos multi-genes usando o kit de clonagem modular de levedura (MoClo). Mostramos resultados ótimos e subótimos da montagem plasmida multigênica e fornecemos um guia para triagem para colônias. Esta estratégia de clonagem é altamente aplicável para a engenharia metabólica de levedura e outras situações em que a clonagem plasmida multi-gene é necessária.

Introdução

A biologia sintética visa projetar sistemas biológicos com novas funcionalidades úteis para indústrias farmacêuticas, agrícolas e químicas. Reunir um grande número de fragmentos de DNA de forma de alto rendimento é uma tecnologia fundamental em biologia sintética. Um processo tão complicado pode se dividir em múltiplos níveis com diminuição da complexidade, conceito emprestado das ciências básicas de engenharia1,2. Na biologia sintética, fragmentos de DNA geralmente se reúnem hierarquicamente com base na funcionalidade: (i) Nível de peça: "partes" refere-se a fragmentos de DNA com uma função específica, como um promotor, uma sequência de codificação, um exterminador, uma origem da replicação; (ii) Unidades de transcrição (TU) nível: um TU consiste de um promotor, uma sequência de codificação e um exterminador capaz de transcrever um único gene; (iii) Nível multi-gene: um plasmídeo multi-gene contém múltiplas TUs frequentemente compostas de toda uma via metabólica. Esta montagem hierárquica pioneira pela comunidade BioBrick é o conceito fundamental para a montagem de grandes conjuntos de DNAs em biologia sintética3.

Na últimadécada, 4,5,6,7,a técnica de clonagem golden gate facilitou significativamente o conjunto hierárquico de DNA2. Muitos outros métodos de clonagem em várias partes, como a clonagem gibson8,clonagem independente de ligadura (SLIC)9,clonagem baseada em excisão uracil (USUÁRIO)10,a reação de ciclismo ligase (LCR)11e a recombinação in vivo (Pedador de DNA)12,13, também foram desenvolvidos até agora. Mas a clonagem do Golden Gate é um método ideal de montagem de DNA porque é independente de sequências específicas de genes, permitindo montagem sem cicatrizes, direcionais e modulares em uma reação de um pote. A clonagem golden gate aproveita as enzimas de restrição tipo IIS que reconhecem uma sequência não palindômica para criar saliências escalonadas fora do local de reconhecimento2. Um ligase então se junta aos fragmentos de DNA ressarcidos para obter uma montagem em várias partes. A aplicação desta estratégia de clonagem ao sistema de clonagem modular (MoClo) permitiu a montagem de até 10 fragmentos de DNA com mais de 90% de transformadores rastreados contendo a construção corretamente montada4.

O sistema MoClo oferece enormes vantagens que aceleraram o ciclo de projeto-construção-teste da biologia sintética. Em primeiro lugar, as peças intercambiáveis permitem clonagem combinatória para testar um grande espaço de parâmetros rapidamente. Por exemplo, otimizar uma via metabólica geralmente requer ciclismo através de muitos promotores para cada gene para equilibrar o fluxo da via. O sistema MoClo pode facilmente lidar com tarefas de clonagem tão exigentes. Em segundo lugar, é preciso sequenciar a peça plasmid, mas tipicamente não o TU ou os plasmídeos multi-genes. Na maioria dos casos, a triagem por PCR colônia ou digestão de restrição é suficiente para verificação no nível TU e plasmídeo multi-gene. Isso porque a clonagem da peça plasmid é o único passo que requer PCR, que frequentemente introduz mutações. Em terceiro lugar, o sistema MoClo é ideal para construir vias metabólicas multigênicas complexas. Por fim, por causa das saliências universais, a parte plasmids pode ser reutilizada e compartilhada com toda a comunidade de bioengenharia. Atualmente, os kits MoClo estão disponíveis para plantas14,15,5,16,17, fungos6,18,19,20,21,22, bactérias7,23,24,25,26,27, e animais28,29. Uma plataforma MoClo multi-reinos também foi introduzida recentemente30.

Para Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 desenvolveram um versátil kit de ferramentas MoClo, um excelente recurso para a comunidade de biologia sintética de levedura. Este kit vem em um formato conveniente de 96 poços e define oito tipos de partes de DNA intercambiáveis com uma coleção diversificada de promotores bem caracterizados, proteínas fluorescentes, terminadores, tags de peptídeos, marcadores de seleção, origem da replicação e ferramentas de edição de genomas. Este kit de ferramentas permite a montagem de até cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene. Essas características são valiosas para a engenharia metabólica de levedura, na qual vias parciais ou inteiras são super expressas para produzir produtos químicos direcionados. Utilizando este kit, os pesquisadores otimizaram a produção de geraniol, linalool31,penicilina32, ácido mucorico33, índigo34e betalain35 em levedura.

Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para orientar o uso do kit de ferramentas MoClo para gerar caminhos multi-genes para expressão episômica ou genômica. Através do uso extensivo deste kit, descobrimos que a medição precisa das concentrações de DNA é fundamental para garantir a distribuição equimolar de cada parte na reação da Golden Gate. Também recomendamos a liga ligase de DNA T4 sobre a liga ligase de DNA T7 porque o primeiro funciona melhor com um número maior de saliências36. Por fim, quaisquer locais de reconhecimento interno de BsmBI e BsaI devem ser removidos ou domesticados antes da montagem. Alternativamente, pode-se considerar sintetizar peças para remover vários sites internos e alcançar a otimização simultânea do codon. Demonstramos como usar este kit de ferramentas expressando um caminho de cinco genes para a produção de β-caroteno e licopeno em S. cerevisiae. Nós ainda mostramos como derrubar o lócus ADE2 usando as ferramentas de edição de genomas deste kit. Esses experimentos baseados em cores foram selecionados para fácil visualização. Também demonstramos como gerar proteínas de fusão e criar mutações de aminoácidos usando a clonagem golden gate.

Protocolo

NOTA: O protocolo hierárquico de clonagem oferecido neste kit de ferramentas pode ser dividido em três etapas principais: 1. Plasmids de peça de clonagem; 2. Unidades de transcrição de clonagem (TUs); 3. Clonagem de plasmídeos multiédis(Figura 1). Este protocolo começa a partir do projeto primer e termina com aplicações do plasmídeo multi-gene clonado.

1. Design primer para clonagem da peça plasmid (pYTK001):

  1. Projete os primers dianteiros e invertidos contendo nucleotídeos de flanqueamento TTT no final de 5', um local de reconhecimento BsmBI com um nucleotídeo adicional (CGTCTCN), uma saliência de 4 nucleotídeos (nt) complementar ao do vetor de entrada, um site de reconhecimento BsaI com um nucleotídeo adicional (GGTCTCN), e uma saliência parcial específica de 4 nt, além da sequência específica do modelo(Figura 2A). GoldenBraid 4.037 e GoldenMutagenesis38 são alguns dos softwares online que podem ser usados para design de primer específico golden gate.
  2. Se os sites de reconhecimento BsaI ou BsmBI estiverem presentes em qualquer parte, use uma etapa de domesticação para mutar esses locais antes do conjunto Golden Gate39. Para plasmídeos integrativos (ver passo 4), domestice qualquer site de reconhecimento NotI. Para domesticar uma peça com um local de reconhecimento indesejável, divida a peça em duas subpartas perto do local indesejável(Figura 2A):
    1. Projete o primer dianteiro da primeira subparte da mesma forma que na etapa 1.1. mas projete o primer reverso com o site BsmBI e uma saliência específica de 4 ntsóis apenas.
    2. Projete o segundo primer de sub-parte para a frente com o site BsmBI e a saliência específica de genes de 4 nt apenas que se sobrepõe ao primer reverso da primeira sub-parte. Projete o primer reverso da segunda subtramida da mesma forma que na etapa 1.1.
    3. Introduza a mutação desejada no inverso (para a etapa 1.2.1) ou no primer para frente (passo 1.2.2) na região específica do gene do primer.
      NOTA: Alternativamente, uma peça livre de BsmBI e BsaI e otimizada por codon pode ser sintetizada comercialmente. Para sequências de codificação (CDS), uma mutação sinônimo pode ser facilmente incorporada no terceiro nucleotídeo de um códon de aminoácidos. Para promotores e exterminadores, no entanto, a verificação da atividade do promotor ou exterminador mutado usando um ensaio de repórter é recomendada39. Se houver um local de restrição indesejável no final da sequência, ele pode ser mutado usando um primer reverso mais longo. Se vários sites indesejáveis estiverem presentes, a mutagênese dirigida ao local permite a mutação de vários locais pode ser realizada40.
  3. Ocasionalmente, fundir duas proteínas como uma única parte com um linker no meio é desejável(Figura 2A). O linker ajuda a garantir a integridade estrutural das duas proteínas individuais41.
    1. O primer dianteiro para o primeiro gene é o mesmo da etapa 1.1. No primer inverso, inclua um site BsmBI, uma saliência específica de genes de 4 nt e uma sequência de linker. A saliência de 4-nt pode ser o linker ou os primeiros nucleotídeos do segundo gene.
    2. Para o segundo gene, projete a cartilha dianteira de tal forma que tenha um local de reconhecimento BsmBI e uma saliência de 4-nt complementar à do primer reverso do primeiro gene. Projete o primer reverso do segundo gene como na etapa 1.1.
  4. Para amplificar as partes por reação em cadeia de polimerase (PCR)42,use uma polimerase de DNA de alta fidelidade para amplificar as partes de um DNA genômico, um cDNA ou um plasmídeo. Verifique o produto PCR em um gel de 1% de agarose seguido de purificação de gel. O uso de DNA purificado é fortemente recomendado, se a purificação do gel for trabalhosa, use pelo menos uma coluna de spin para purificar o produto PCR.

2. Clonagem de peças no vetor de entrada (pYTK001) para criar plasmídeos de peça(Figura 2B)

  1. Para configurar o mix de reação Golden Gate, adicione 20 fmol de cada produto PCR e o vetor de entrada (pYTK001), 1 μL de tampão de ligase 10X T4, 0,5 μL de Esp3I (um isoschizomer altamente eficiente de BsmBI) e 0,5 μL de ligase T4. Adicione ddH2O para levar o volume total a 10 μL.
  2. Para configurar a reação de clonagem, execute o seguinte programa em um termociclador: 25-35 ciclos de 37 °C para 5 min (digestão) e 16 °C para 5 min (ligadura), seguido de digestão final a 50 °C para 10 min e inativação enzimápica a 80 °C por 10 min.
    NOTA: 35 ciclos de digestão/ligação são recomendados ao clonar várias peças de DNA no vetor de entrada simultaneamente, por exemplo, durante a clonagem de genes de fusão ou domesticação de um gene.
  3. Transforme toda a mistura de reação na cepa DH5α ou células equivalentes Escherichia coli quimicamente competentes por choque térmico. Transformando todo o produto clonado de 10 μL em células E. coli quimicamente competentes (2 X 105 cfu/mL, a CFU é calculada a partir da transformação de 5 ng pYTK001 em 100 μL das células competentes). Espalhe em uma placa de caldo de lise (LB) com 35 μg/mL de cloramfenicol (Cm). Incubar a 37 °C durante a noite.
  4. Depois de 16-18 h, retire a placa da incubadora e mantenha a placa a 4 °C por cerca de 5 h para deixar a proteína fluorescente verde super pasta (sfGFP) desenvolver-se para uma cor verde mais intensa.
  5. Para uma triagem mais fácil, coloque a placa em um ultravioleta (UV) ou em um transilluminador de luz azul. O sfGFP contendo colônias irá fluorescer sob a luz UV.
  6. As colônias verdes são negativas porque contêm o pYTK001 sem cortes. As colônias brancas são provavelmente positivas. A clonagem é geralmente bem sucedida se houver ~30-100% de colônias brancas. Realizar uma triagem adicional de algumas colônias brancas por pcr colônia ou digestões de restrição (enzima sugerida: BsaI-HFv2).
  7. Purificar plasmídeos de algumas das colônias potencialmente corretas e confirmar as sequências por sequenciamento Sanger.

3. Montagem de plasmídeos em plasmídeos

NOTA: Um plasmídeo contém uma unidade de transcrição definida pelo usuário (TU) composta por um promotor, um CDS e um exterminador. Um plasmídeo permite a expressão de um único gene. Se os plasmídeos serão montados em um plasmídeo multi-gene, então o primeiro passo é determinar o número e a ordem de TUs no plasmídeo multi-gene. Estes determinarão quais conectores usar nos plasmídeos, uma vez que os conectores ligam TUs no plasmídeo multi-gene. O primeiro conector esquerdo do TU deve ser ConLS, e o conector direito do último TU deve ser ConRE. Eles se sobreporão com conls e ConRE' de plasmídeos multi-genes. O resto dos conectores devem estar na ordem numérica crescente. Por exemplo, se o plasmídeo multigênito contém quatro TUs, as combinações de conectores seriam ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 e ConL3-TU4-ConRE(Figura 1).

  1. Antes de montar unidades de transcrição, recomenda-se a montagem de um vetor intermediário com as seguintes seis partes: o conector esquerdo, o dropout sfGFP (pYTK047), o conector direito, um marcador de seleção de leveduras, uma origem levedura de replicação e a parte plasmid com um mRFP1, uma origem E. coli. e o gene resistente à ampicilina (pYTK083) (Figura 3).
    1. Purifique os seis plasmídeos acima. Registosas concentrações usando um espectrofotômetro UV-Vis ou um ensaio baseado em fluorescência e diluir cada plasmídeo com ddH2O para que 1 μL tenha 20 fmol de DNA. Calcule a concentração molar de DNA usando uma calculadora online.
      NOTA: É muito importante medir as concentrações de DNA com precisão e encanar precisamente para que a montagem funcione, especialmente para montagens com plasmídeos de cinco a sete partes. Pequenos erros na concentração de DNA de cada plasmídeo podem causar uma diminuição significativa na eficiência da clonagem.
    2. Adicione 1 μL de cada plasmídeo, 1 μL de tampão ligase T4 10X, 0,5 μL de BsaI-HFv2 (uma versão altamente eficiente de BsaI) e 0,5 μL de ligase T4. Coma o volume a 10 μL adicionando ddH2O.
    3. Para configurar a reação de clonagem, execute o seguinte programa no termociclador: 25-35 ciclos de 37 °C para 5 min (digestão) e 16 °C por 5 min (ligadura). Omitir as etapas finais de digestão e inativação de calor, pois os locais de BsaI precisam ser mantidos no vetor intermediário(Figura 3).
    4. Transforme toda a mistura de reação na cepa DH5α ou outras células competentes de E. coli. Espalhe em uma placa LB com carbenicilina de 50 μg/mL (Cb) ou ampicillina. Incubar a 37 °C durante a noite.
      NOTA: Carbenicillin é um analógico estável da ampicilina.
    5. Depois das 16h18, tire a placa da incubadora. A placa conterá colônias verdes pálidas e vermelhas pálidas(Figuras 6C e 6D). Mantenha a placa a 4 °C por cerca de 5 h para deixar o mRFP1 e o sfGFP maduros. Use um UV ou um transilluminador de luz azul para identificar as colônias verdes, que contêm o vetor intermediário potencialmente correto.
    6. Listrar as colônias verdes em uma placa LB + Cb e incubar a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, saia novamente em uma placa LB + Cm e incubar a 37 °C durante a noite. As colônias que crescem em placas LB + Cm contêm plasmídeos desmontados porque os vetores de parte resistentes a CM são retidos.
    7. Escolha as colônias que não crescem na placa LB + Cm e realize digestões de restrição (enzimas sugeridas: BsaI-HFv2, Esp3I) para confirmar o plasmídeo corretamente montado. Alternativamente, use a COLÔNIA PCR para triagem.
  2. Uma vez que o vetor intermediário tenha sido montado com sucesso, o próximo passo é montar unidades de transcrição. Este é um conjunto de 4 peças com as seguintes partes: o vetor intermediário, um promotor, um CDS e um exterminador.
    1. Purificar os três plasmídeos de quatro partes. Regissuça suas concentrações e dilua cada um dos plasmídeos para que 1 μL tenha 20 fmol de DNA.
    2. Para configurar a mistura de reação, siga o Passo 3.1.2.
    3. Para configurar a reação de clonagem, siga o Passo 2.2.
    4. Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5α ou equivalentes E. coli e placa em LB + Cb. Incubar a 37 °C durante a noite.
    5. Depois de 16-18 h, retire a placa da incubadora. Serão exibidas colônias verdes brancas e pálidas(Figuras 6E e 6F). Mantenha a placa a 4 °C por cerca de 5 h para deixar o sfGFP amadurecer. Use um UV ou um transilluminador de luz azul para identificar as colônias brancas não fluorescentes. Estes contêm as unidades de transcrição potencialmente corretas.
    6. Ria e cresce 8-10 colônias brancas e realiza uma colônia PCR. Purificar plasmídeos das colônias que testam positivo da colônia PCR. Realize a digestão de restrição (enzima sugerida: Esp3I) para confirmar ainda mais a montagem.
      NOTA: As unidades de transcrição de sequenciamento normalmente não são necessárias porque a clonagem envolve apenas a digestão e a ligadura de restrição. Todas as sequências de interesse foram confirmadas no nível plasmídeo da peça.

4. A montagem de plasmídeos de em plasmídeos multi-genes:

NOTA: Plasmídeos multiédis permitem a expressão de mais de um gene. Dependendo da aplicação a jusante, plasmídeos multi-genes podem ser replicativos ou integrativos. Plasmídeos replicativos têm a origem da levedura da replicação; portanto, pode ser mantido com estada quando a célula de levedura se divide. Plasmídeos integrativos não têm a origem da levedura da replicação. Em vez disso, eles têm braços de 5' e 3' homologia permitindo a integração de múltiplos genes em loci específicos do genoma através da recombinação homólogo.

  1. Para plasmídeos multi-genes, monte um vetor intermediário primeiro.
    1. Para montar vetores intermediários replicativos(Figura 4A),monte as seguintes seis partes: o conector esquerdo (ConLS'-pYTK008), o desistência sfGFP (pYTK047), o conector direito (ConRE'-pYTK072), um marcador de seleção de leveduras, uma origem levedura de replicação, e a parte plasmid com mRFP1, uma origem E. coli de replicação, e o gene resistente à kanamicina (pYTK084).
      1. Para montagem, siga os passos de 3.1.1 para 3.1.3.
      2. Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5α ou equivalentes E. coli, e placa em LB mais 50 μg/mL kanamycin (Km). Incubar a 37 °C durante a noite.
      3. Para triagem baseada em cores vermelhas/verdes, siga o passo 3.1.5.
      4. Para a triagem de misassemblies, raia e crescer as colônias verdes em uma placa LB + Km. Em seguida, siga o passo 3.1.6.
    2. Para vetores multigógenos integrativos(Figura 4B),determine o lócus genômico de interesse primeiro, em seguida, projete aproximadamente 500 pares de base de braços de 5' e 3' de ecologia para integração a esse lócus.
      1. Clone os braços de elogia de 5' e 3' do DNA genômico de leveduras no vetor de entrada-pYTK001. Siga os passos 1 e 2.
      2. Monte os seguintes sete plasmídeos: o conector esquerdo (ConLS'-pYTK008), o dropout sfGFP (pYTK047), o conector direito (ConRE'-pYTK072), um marcador de seleção de leveduras, o braço de 3' homologia, a parte plasmid com mRFP1, E. coli origem da replicação, e o gene resistente à kanamicina (pYTK090), e o braço de 5' homologia.
      3. Para montagem e triagem, siga o passo 4.1.1.
  2. Montagem do plasmídeo multi-gene
    1. Purificar plasmídeos do vetor intermediário obtido na etapa 4.1 e os plasmídeos da etapa 3. Registosas de suas concentrações usando um espectrofotômetro UV-Vis ou um ensaio baseado em fluorescência. Diluir cada um em ddH2O para que 1 μL tenha 20 fmol DNA.
    2. Adicione 1 μL de vetor intermediário, 1 μL de cada unidade de transcrição, 1 μL de tampão de ligase T4 de 10x, 0,5 μL de Esp3I e 0,5 μL de liga ligase T4. Leve o volume para 10 μL de uso ddH2O.
    3. Para configurar a reação de clonagem, siga o passo 2.2.
    4. Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5α ou equivalentes E. coli, e placa em LB + Km. Incubar a 37 °C durante a noite.
    5. Realize a triagem verde/branco como na etapa 3.2.5.
    6. Purificar plasmídeos de algumas colônias brancas e realizar digestões de restrição. O uso da enzima NotI-HF é recomendado porque existem dois locais NotI na parte do marcador de seleção E. coli e Km, respectivamente(Figura 4B). Se o plasmídeo montado for muito grande, então outro local de restrição pode ser escolhido para confirmação posterior. Alternativamente, tela com COLÔNIA PCR antes de proceder à digestão de restrição.

5. Aplicando plasmídeos multi-genes para expressão genética cromossômica ou plasmida

  1. Integrando plasmídeos multi-genes no genoma da levedura para expressão genética cromossômica(Figura 5)
    1. Projete um RNA guia (gRNA) para o lócus desejado. O uso de vários recursos on-line, como Benchling, CRISPRdirect43e CHOPCHOP44,é recomendado para determinar a especificidade máxima no alvo.
    2. Clone o gRNA sintetizado de 20 nt no plasmídeo pCAS45 por clonagem Gibson. Linearize o plasmídeo pCAS por PCR usando um par de primer invertido que liga aos 3' da ribozyme HDV e aos 5' do tracrRNArespectivamente (Figura 5). Alternativamente, clone o gRNA no plasmídeo de desistência sgRNA (pYTK050) e monte o plasmídeo de gota em um plasmid com linkers. Em seguida, monte o Cas9 TU com o plasmídeo cas9 parte (pYTK036). Por último, monte o Cas9 TU e o sgRNA TU em um plasmídeo multi-gene replicativo.
    3. Linearize 5-15 μg de plasmídeo multi-gene integrativo com 1 μL de enzima NotI-HF durante a noite. Transforme 1 μg de pCAS-gRNA e o plasmídeo integrativo linearizado multi-gene em S. cerevisiae. Prepare células competentes usando um kit de transformação de leveduras comercialmente disponível ou seguindo o protocolo de Geitz e Schiestl, 200746.
      NOTA: É desnecessário purificar o plasmídeo multi-gene linearizado após a digestão NotI.
    4. Pelotar as células após a recuperação, descartar o sobrenante, lavar com um volume igual de água. Células de levedura de placa na placa de abandono do meio sintético completo (CSM) ou na placa de extrato de peptone dextrose (YPD) com antibióticos, dependendo do marcador seletivo de levedura. Incubar a 37 °C por dois dias para que as colônias se formem. Caso nenhuma colônia seja observada, incubar por mais um a dois dias a 30°C.
    5. Colônias de leveduras de tela para integração pela colônia PCR47.
    6. Para curar o pCAS, saia da colônia com a integração correta em uma placa YPD não seletiva. Cresça a 30 °C durante a noite. Raia uma colônia da placa YPD em uma placa YPD fresca. Novamente, cresça a 30 °C durante a noite. Streak uma colônia da segunda placa YPD para um YPD mais 100 μg/mL nourseothricin, o marcador de seleção de pCAS. A cura bem sucedida ocorre quando as células de levedura não crescem na placa seletiva.
      NOTA: Se o plasmídeo pCAS não for curado em duas rodadas de YPD não-seletivo, volte a entrar em um YPD fresco por mais 1-2 rounds.
  2. Transformando plasmídeo multi-gene replicativo para expressão genética baseada em plasmídeo
    1. Transforme 100 ng-1 μg puro plasmídeo multi-gene em células competentes S. cerevisiae.
    2. Células de levedura de placa imediatamente após a transformação na placa de abandono CSM ou YPD mais placa de antibiótico, dependendo do marcador de seleção de leveduras utilizado. Incubar a 30°C por 2-3 dias para as colônias se formarem.

Resultados

Aqui estão os resultados de quatro pládidos multi-genes replicativos para produção de β-caroteno (amarelo) e licopeno (vermelho). Um plasmídeo multi-gene integrado para interromper o lócus ADE2 foi construído, das quais as colônias são vermelhas.

Clonagem de CDSs no vetor de entrada (pYTK001)
O ERG20 foi amplificado a partir do genoma da levedura e dos três genes carotenoides ...

Discussão

O kit de clonagem baseado em MoClo desenvolvido por Lee et al. fornece um excelente recurso para montagem rápida de uma a cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene, seja para replicação ou integração no genoma da levedura. O uso deste kit elimina o demorado gargalo de clonagem que existe frequentemente para expressar múltiplos genes na levedura.

Testamos cinco condições diferentes para os ciclos de digestão/ligamento da clonagem golden gate com ligase de DNA T4. Desc...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Research Foundation para a Universidade Estadual de Nova York (Prêmio #: 71272) e pelo Impact Award of University at Buffalo (Prêmio #: 000077).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm Glass beadsRPI research products9831For lysing yeast cells
Bacto AgarBD & Company214010Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto PeptoneBD& Company211677Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Sa highly efficient version of BsaI restriction enzyme
CarbenicillinFisher Bioreagents4800-94-6Antibiotic for screening at the transcription unit level
ChloramphenicolFisher Bioreagents56-75-7Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsBD & Company291940Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs for PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Sa highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001For yeast transformation
HexanesFisher ChemicalH302-1For carotenoid extraction from yeast cells
KanamycinFisher Bioreagents25389-94-0Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
LycopeneCayman chemicalsNC1142173For lycopene quantification
MoClo YTKAddgene1000000061Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LFor plasmid purification from E.coli
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND2000cFor measuring accurate DNA concentrations
NotI-HFNew England BiolabsR3189SRestriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin SulphateGoldbioN-500-100Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)New England BiolabsB0518SBuffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530SHigh fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494Addgene100539Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz CuvetteThermo Electron10050801For quantifing carotenoids
T4 ligaseNew England BiolabsM0202SLigase for Golden Gate cloning
ThermocyclerBIO-RAD1851148For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue HomogenizerBullet BlenderModel: BBX24For homogenization of yeast cells
UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificGenesys 150For quantifing carotenoids
Yeast ExtractFisher BioreagentsBP1422-500Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-caroteneAlfa AesarAAH6010603For β-carotene quantification

Referências

  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M., Valla, S., Lale, R. . DNA Cloning and Assembly Methods. 1116, 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R., et al. . The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. 11, 181 (1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).

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