Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.
Golden Gate klonlama yöntemi, kullanıcı tanımlı herhangi bir düzenlemede birden fazla genin hızlı bir şekilde bire birliğini sağlar. Tanıma alanlarının dışında kesilen ve kısa bir çıkıntı oluşturan tip IIS kısıtlama enzimlerini kullanır. Bu modüler klonlama (MoClo) sistemi, organizatörler, kodlama dizileri (CDS) ve sonlandırıcılar gibi farklı DNA parçalarının ilk olarak bir giriş vektörüne klonlandırıldığı hiyerarşik bir iş akışı kullanır. Birden çok giriş vektörü daha sonra transkripsiyon birimlerine monte edilir. Birkaç transkripsiyon ünitesi daha sonra çok genli bir plazmid içine bağlanır. Golden Gate klonlama stratejisi, tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verdiği için muazzam bir avantaja sahip. Hiyerarşik iş akışı genellikle giriş vektörlerinin ötesinde sıralamaya gerek kalmadan çok çeşitli çok genli yapıların facile klonlasını sağlar. Floresan protein bırakmalarının kullanımı kolay görsel tarama sağlar. Bu çalışma, maya modüler klonlama (MoClo) kitini kullanarak çok genli plazmidlerin montajı için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar. Çok genli plazmid montajının optimal ve yetersiz sonuçlarını gösteriyoruz ve koloniler için tarama için bir kılavuz sağlıyoruz. Bu klonlama stratejisi maya metabolik mühendisliği ve çok genli plazmid klonlamanın gerekli olduğu diğer durumlar için oldukça geçerlidir.
Sentetik biyoloji, farmasötik, tarım ve kimya endüstrileri için yararlı yeni işlevlere sahip biyolojik sistemler tasarlamayı amaçlamaktadır. Çok sayıda DNA parçasını yüksek verimli bir şekilde birleştirmek sentetik biyolojide temel bir teknolojidir. Böyle karmaşık bir süreç, temel mühendislik bilimlerinden ödünç alınan bir kavram olan azalan karmaşıklık ile birden fazla seviyeye ayrılabilir1,2. Sentetik biyolojide, DNA parçaları genellikle işlevselliğe göre hiyerarşik olarak bir araya gelir: (i) Parça düzeyi: "parçalar", organizatör, kodlama dizisi, sonlandırıcı, çoğaltmanın kaynağı gibi belirli bir işleve sahip DNA parçalarını ifade eder; (ii) Transkripsiyon üniteleri (TU) seviyesi: TU, bir organizatör, bir kodlama dizisi ve tek bir geni aktarabilen bir sonlandırıcıdan oluşur; (iii) Çok genli seviye: çok genli plazmid, sıklıkla tüm metabolik yoldan oluşan birden fazla TUs içerir. BioBrick topluluğunun öncülük ettiği bu hiyerarşik derleme, sentetik biyoloji3'tebüyük DNA setlerinin montajı için temel kavramdır.
Son on yılda4,5,6,7, Golden Gate klonlama tekniği hiyerarşik DNA derlemesini önemli ölçüde kolaylaştırmıştır2. Gibson klonlama8, ligasyondan bağımsız klonlama (SLIC)9, urasil eksizyon tabanlı klonlama (KULLANICI)10, ligase cycling reaksiyon (LCR)11ve in vivo rekombinasyon (DNA Assembler)12,13gibi diğer birçok çok parçalı klonlama yöntemi de şimdiye kadar geliştirilmiştir. Ancak Golden Gate klonlama ideal bir DNA montaj yöntemidir, çünkü genlere özgü dizilerden bağımsızdır ve tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verir. Golden Gate klonlama, tanıma alanı2dışında kademeli çıkıntılar oluşturmak için palindromi olmayan bir diziyi tanıyan tip IIS kısıtlama enzimlerinden yararlanır. Bir ligase daha sonra çok parçalı bir montaj elde etmek için tavlanmış DNA parçalarını birleştirir. Bu klonlama stratejisini modüler klonlama (MoClo) sistemine uygulamak, doğru monte edilmiş yapı4'ü içeren% 90'dan fazla dönüştürücü ile 10'a kadar DNA parçasının bir araya alınmasını sağlamıştır.
MoClo sistemi, sentetik biyolojinin tasarım-inşa-test döngüsünü hızlandıran muazzam avantajlar sunar. İlk olarak, değiştirilebilir parçalar, büyük bir parametre alanını hızlı bir şekilde test etmek için kombinatoryal klonlamayı etkinleştirir. Örneğin, metabolik bir yolu optimize etmek genellikle yol akısını dengelemek için her gen için birçok promotör arasında bisiklet sürmeyi gerektirir. MoClo sistemi bu tür zorlu klonlama görevlerini kolayca halledebilir. İkincisi, plazmid kısmını sıralamak gerekir, ancak tipik olarak TU veya çok genli plazmidleri sıralamaz. Çoğu durumda, koloni PCR veya kısıtlama sindirimi ile tarama TU ve çok genli plazmid düzeyinde doğrulama için yeterlidir. Bunun nedeni, parça plazmidi klonlamanın, sık sık mutasyonları tanıtan PCR gerektiren tek adım olmasıdır. Üçüncü olarak, MoClo sistemi çok genli karmaşık metabolik yollar oluşturmak için idealdir. Son olarak, evrensel çıkıntılar nedeniyle, parça plazmidleri yeniden kullanılabilir ve tüm biyomühendislik topluluğu ile paylaşılabilir. Şu anda, MoClo kitleri bitkiler için mevcuttur14,15,5,16,17, mantar6,18,19,20,21,22, bakteri7,23,24,25,26,27vehayvanlar28,29. Çok krallıklı bir MoClo platformu da yakın zamanda tanıtıldı30.
Saccharomyces cerevisiaeiçin Lee ve ark.6, maya sentetik biyoloji topluluğu için mükemmel bir kaynak olan çok yönlü bir MoClo araç seti geliştirdi. Bu kit uygun bir 96 kuyu formatında gelir ve iyi karakterize edilmiş organizatörler, floresan proteinler, terminatörler, peptit etiketleri, seçim belirteçleri, replikasyon kaynağı ve genom düzenleme araçlarından oluşan çeşitli bir koleksiyona sahip sekiz tür değiştirilebilir DNA parçası tanımlar. Bu araç seti, beş adede kadar transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine birleştirilmiş olmasını sağlar. Bu özellikler, kısmi veya tüm yolların hedeflenen kimyasalları üretmek için aşırı ifade edildiği maya metabolik mühendisliği için değerlidir. Bu kiti kullanarak, araştırmacılar geraniol, linalool31, penisilin32, mukonik asit33, indigo34ve mayada betalain35 üretimini optimize etmişlerdir.
Burada, epizomal veya genomik ekspresyon için çok genli yollar oluşturmak için MoClo araç setinin kullanımına rehberlik etmek için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu kitin kapsamlı kullanımıyla, DNA konsantrasyonlarının doğru ölçümünün, Golden Gate reaksiyonundaki her parçanın eşitlikçi dağılımını sağlamanın anahtarı olduğunu bulduk. Ayrıca T7 DNA ligaz üzerinde T4 DNA ligazını öneririz, çünkü ilki daha fazla sayıda çıkıntla daha iyi çalışır36. Son olarak, BsmBI ve BsaI'nin tüm iç tanıma siteleri montajdan önce kaldırılmalı veya evcillendirilmelidir. Alternatif olarak, birden fazla dahili siteyi kaldırmak ve eşzamanlı kodon optimizasyonu elde etmek için parçaları sentezlemeyi düşünebilirsiniz. S. cerevisiae'de β karoten ve likopen üretimi için beş genlik bir yol ifade ederek bu araç setin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, bu kitin genom düzenleme araçlarını kullanarak ADE2 locus'un nasıl nakavt olduğunu gösteriyoruz. Bu renk tabanlı deneyler kolay görselleştirme için seçildi. Ayrıca Golden Gate klonlama kullanarak füzyon proteinlerinin nasıl üretilip amino asit mutasyonlarının nasıl oluşturulacağı da göstermektedir.
NOT: Bu araç setinde sunulan hiyerarşik klonlama protokolü üç ana adıma ayrılabilir: 1. Parça plazmidlerini klonlama; 2. Klonlama transkripsiyon üniteleri (TUs); 3. Çok genli plazmidlerin klonlama (Şekil 1). Bu protokol astar tasarımından başlar ve klonlanmış çok genli plazmid uygulamaları ile sona erer.
1. Parça plazmid klonlama için astar tasarımı (pYTK001):
2. Parça plazmidleri oluşturmak için parçaları giriş vektörüne klonlama (pYTK001) (Şekil 2B)
3. Parça plazmidlerinin "kaset" plazmidlerine montajı
NOT: Kaset plazmidi, bir organizatör, CDS ve bir sonlandırıcıdan oluşan kullanıcı tanımlı bir transkripsiyon ünitesi (TU) içerir. Kaset plazmidi tek bir genin ifadesini sağlar. Kaset plazmidleri çok genli bir plazmid halinde birleştirilecekse, ilk adım çok genli plazmiddeki TU'ların sayısını ve sırasını belirlemektir. Konnektörler çok genli plazmiddeki TU'ları bağladığından, bunlar kaset plazmidlerinde hangi konektörlerin kullanılacağını belirleyecektir. İlk TU'nun sol konektörü ConLS ve son TU'nun sağ konektörü ConRE olmalıdır. Çok genli plazmidlerin ConLS' ve ConRE'si ile çakışacaklardır. Bağlayıcıların geri kalanı artan sayısal sırada olmalıdır. Örneğin, çok genli plazmid dört TUs içeriyorsa, konektör kombinasyonları ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 ve ConL3-TU4-ConRE (Şekil 1)olacaktır.
4. Kaset plazmidlerini "çok genli" plazmidlere monte etmek:
NOT: Çok genli plazmidler birden fazla genin ifadesini sağlar. Aşağı akış uygulamasına bağlı olarak, çok genli plazmidler çoğaltıcı veya bütünleştirici olabilir. Çoğaltıcı plazmidler replikasyon maya kökenine sahiptir; bu nedenle, maya hücresi bölündüğünde dikkatlice muhafaza edilebilir. Bütünleştirici plazmidler replikasyon maya kökenine sahip değildir. Bunun yerine, homolog rekombinasyon yoluyla birden fazla genin genomun belirli bir locisine entegrasyonunu sağlayan 5' ve 3' homoloji kollarına sahiptirler.
5. Kromozomal veya plazmid bazlı gen ekspresyözü için çok genli plazmidlerin uygulanması
Burada β karoten (sarı) ve likopen (kırmızı) üretimi için dört çoğaltıcı çok genli plazmid sonuçları. ADE2 lokusunu bozmak için kolonileri kırmızı olan bir bütünleştirici çok genli plazmid inşa edildi.
CDS'leri giriş vektörüne klonlama (pYTK001)
ERG20 maya genomundan ve üç karotenoid gen crtE, crtYB, crtI plazmid pLM494
Lee ve arkadaşları tarafından geliştirilen MoClo tabanlı klonlama kiti, maya genomuna çoğaltma veya entegrasyon için bir ila beş transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine hızlı bir şekilde montajı için mükemmel bir kaynak sağlar. Bu kitin kullanımı, mayadaki birden fazla geni ifade etmek için sıklıkla var olan zaman alıcı klonlama darboğazını ortadan kaldırır.
T4 DNA ligaz ile Golden Gate klonlamanın sindirim/ligasyon döngüleri için beş farklı k...
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Bu çalışma New York Eyalet Üniversitesi Araştırma Vakfı (Ödül #: 71272) ve Buffalo Üniversitesi IMPACT Ödülü (Ödül #: 000077) tarafından finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır