A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.
שיטת השיבוט שער הזהב מאפשרת הרכבה מהירה של גנים מרובים בכל סידור המוגדר על ידי המשתמש. היא משתמשת באנזימי הגבלת IIS מסוג שחותכים מחוץ לאתרי הזיהוי שלהם ויוצרים עקיפה קצרה. מערכת שיבוט מודולרית (MoClo) זו משתמשת בזרימת עבודה הירארכית שבה חלקי דנ"א שונים, כגון מקדמים, רצפי קידוד (CDS) ומחסלים, משוכפלים תחילה לווקטור כניסה. לאחר מכן, וקטורים מרובים של הזנה מתאספים ליחידות שעתוק. מספר יחידות שעתוק מתחברות לפלסמיד מרובה גנים. אסטרטגיית השיבוט של שער הזהב היא בעלת יתרון עצום משום שהיא מאפשרת הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. זרימת העבודה ההיררכית מאפשרת בדרך כלל שיבוט קל של מגוון רחב של מבנים מרובי גנים ללא צורך ברצף מעבר לווקטורים של כניסה. השימוש בנשירה של חלבונים פלואורסצנטיים מאפשר סינון חזותי קל. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שיבוט מודולרי שמרים (MoClo). אנו מראים תוצאות אופטימליות ותת-אופטימליות של הרכבה מרובת גנים ומספקים מדריך להקרנה למושבות. אסטרטגיית שיבוט זו ישימה מאוד עבור הנדסה מטבולית שמרים ומצבים אחרים שבהם שיבוט פלסמיד רב גנים נדרש.
ביולוגיה סינתטית שואפת להנדס מערכות ביולוגיות עם פונקציות חדשות שימושיות לתעשיות פרמצבטיות, חקלאיות וכימיות. הרכבת מספר רב של שברי דנ"א באופן בעל תפוקה גבוהה היא טכנולוגיה בסיסית בביולוגיה סינתטית. תהליך מסובך כזה יכול להתפרק לרמות מרובות עם ירידה במורכבות, מושג המושאל ממדעי ההנדסה הבסיסית1,2. בביולוגיה סינתטית, שברי DNA בדרך כלל להרכיב באופן היררכי מבוסס על פונקציונליות: (i) רמת חלק: "חלקים" מתייחס שברי DNA עם פונקציה מסוימת, כגון מקדם, רצף קידוד, שליחות קטלנית, מקור של שכפול; (ii) רמת יחידות שעתוק (TU): TU מורכב ממקדם, רצף קידוד ומחסל המסוגל לתמלל גן יחיד; (iii) רמה מרובת גנים: פלסמיד מרובה גנים מכיל מספר TUs המורכב לעתים קרובות ממסלול מטבולי שלם. הרכבה היררכית זו חלוצה על ידי קהילת BioBrick היא מושג היסוד להרכבה של קבוצות גדולות של DNAs בביולוגיה סינתטית3.
בעשור האחרון4,5,6,7, טכניקת השיבוט שער הזהב אפשרה באופן משמעותי הרכבה DNA היררכית2. שיטות שיבוט מרובות חלקים רבים אחרים, כגון שיבוט גיבסון8, שיבוט עצמאי קשירה (SLIC)9, שיבוט מבוסס כריתת uracil (USER)10, תגובת רכיבה על אופניים ליגאז (LCR)11, ו ב vivo רקומבינציה (DNA Assembler)12,13, פותחו גם עד כה. אבל שיבוט שער הזהב הוא שיטת הרכבת DNA אידיאלית משום שהוא אינו תלוי ברצפים ספציפיים לגנים, ומאפשר הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. שיבוט שער הזהב מנצל אנזימי הגבלה מסוג IIS המזהים רצף לא פלינדרומי ליצירת מעליות מתנדנדות מחוץ לאתר הזיהוי2. לאחר מכן, ליגאז מצטרף לרסיסי הדנ"א ה Annealed כדי להשיג הרכבה מרובת חלקים. החלת אסטרטגיית שיבוט זו על מערכת שיבוט מודולרי (MoClo) אפשרה הרכבה של עד 10 שברי DNA עם מעל 90% transformants מוקרן המכיל את המבנה שהורכב כראוי4.
מערכת MoClo מציעה יתרונות עצומים שהאיצו את מחזור התכנון-מבחן של הביולוגיה הסינתטית. ראשית, החלקים הניתנים להחלפה מאפשרים שיבוט קומבינטורי כדי לבחון מרחב גדול של פרמטרים במהירות. לדוגמה, אופטימיזציה של מסלול מטבולי בדרך כלל דורש רכיבה על אופניים דרך מקדמים רבים עבור כל גן כדי לאזן את שטף המסלול. מערכת MoClo יכולה להתמודד בקלות עם משימות שיבוט תובעניות כאלה. שנית, יש לרצף את החלק פלסמיד אך בדרך כלל לא את ה- TU או את הפלסמידים מרובי הגנים. ברוב המקרים, הקרנה על ידי PCR המושבה או הגבלת העיכול מספיק לאימות ברמת TU ו פלסמיד רב גנים. הסיבה לכך היא שיבוט פלסמיד החלק הוא הצעד היחיד הדורש PCR, אשר לעתים קרובות מציג מוטציות. שלישית, מערכת MoClo אידיאלית לבניית מסלולים מטבוליים מורכבים מרובי גנים. לבסוף, בגלל ההסתבכויות האוניברסליות, ניתן לעשות שימוש חוזר בחלקים ולשתף אותם עם הקהילה הביו-הנדסהית כולה. נכון לעכשיו, ערכות MoClo זמינות עבורצמחים 14,15,5,16,17, פטריות6,18,19,20 ,21,22,חיידקים7,23,24,25,26,27, ובעליחיים 28,29. פלטפורמת MoClo רב ממלכות הוצגה גם לאחרונה30.
עבור Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 פיתחו ערכת כלים רב-תכליתית MoClo, משאב מצוין לקהילת הביולוגיה הסינתטית שמרים. ערכה זו מגיעה במתכונת נוחה של 96 בארות ומגדירה שמונה סוגים של חלקי דנ"א הניתנים להחלפה עם אוסף מגוון של מקדמים מאופיינים היטב, חלבונים פלואורסצנטיים, מחסלים, תגי פפטיד, סמני בחירה, מקור השכפול וכלי עריכת הגנום. ערכת כלים זו מאפשרת הרכבה של עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים. תכונות אלה הן בעלות ערך עבור הנדסה מטבולית שמרים, שבו מסלולים חלקיים או שלמים מבוטאים יתר על המידה כדי לייצר כימיקלים ממוקדים. באמצעות ערכה זו, החוקרים יש אופטימיזציה הייצור של geraniol, linalool31, פניצילין32, חומצה מוקונית33, אינדיגו34, ו betalain35 בשמרים.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד כדי להנחות את השימוש בערכת הכלים MoClo כדי ליצור מסלולים מרובי גנים עבור ביטוי אפיזומלי או גנומי. באמצעות שימוש נרחב בערכה זו, מצאנו כי המדידה המדויקת של ריכוזי DNA היא המפתח להבטחת התפלגות שווה השוויון של כל חלק בתגובת שער הזהב. אנו ממליצים גם על ליגאז DNA T4 על ליגאז DNA T7 כי לשעבר עובד טוב יותר עם מספר גדול יותר של overhangs36. לבסוף, יש להסיר או לביית אתרי זיהוי פנימיים של BsmBI ו- BsaI לפני ההרכבה. לחלופין, ניתן לשקול סינתזה של חלקים כדי להסיר אתרים פנימיים מרובים ולהשיג אופטימיזציה של קודון בו זמנית. אנו מדגימים כיצד להשתמש בערכת כלים זו על ידי הבעת מסלול של חמישה גנים לייצור β קרוטן וליקופן ב- S. cerevisiae. אנו מראים עוד כיצד לדפוק את לוקוס ADE2 באמצעות כלי עריכת הגנום מערכה זו. ניסויים מבוססי צבע אלה נבחרו להדמיה קלה. אנו גם מדגימים כיצד ליצור חלבוני היתוך וליצור מוטציות חומצות אמינו באמצעות שיבוט שער הזהב.
הערה: ניתן לחלק את פרוטוקול השיבוט ההירארכי המוצע בעורק כלים זה לשלושה שלבים עיקריים: 1. שיבוט פלסמידים של חלקים; 2. יחידות תעתיק שיבוט (TUs); 3. שיבוט פלסמידים מרובי גנים (איור 1). פרוטוקול זה מתחיל מעיצוב פריימר ומסתיים ביישומים של פלסמיד מרובה גנים משובטים.
1. עיצוב פריימר לשיבוט החלק פלסמיד (pYTK001):
2. שכפול חלקים בווקטור הכניסה (pYTK001) ליצירת פלסמידים חלקיים (איור 2B)
3. הרכבת פלסמידים חלק לתוך "קלטת" פלסמידים
הערה: פלסמיד קלטת מכיל יחידת תמלול (TU) המוגדרת על-ידי המשתמש, המורכבת ממקדם, CDS ומחסל. פלסמיד קלטת מאפשר ביטוי של גן יחיד. אם פלסמידים קלטת יורכבו לתוך פלסמיד רב גנים, אז הצעד הראשון הוא לקבוע את המספר ואת הסדר של TUs בפלסמיד מרובה גנים. אלה יקבעו באיזה מחברים להשתמש בפלטות הקלטת מאחר שמחברים מקשרים TUs בפלסמיד מרובה הגנים. המחבר השמאלי הראשון של TU צריך להיות ConLS, והמחבר הימני של ה- TU האחרון צריך להיות ConRE. הם יחפפו עם קונלס וקון-רה של פלסמידים מרובי גנים. שאר המחברים צריכים להיות בסדר המספרי הגדל. לדוגמה, אם הפלסמיד מרובה הגנים מכיל ארבעה TUs, שילובי המחברים יהיו ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 ו- ConL3-TU4-ConRE (איור 1).
4. הרכבת פלטות קלטת לפלסמידים "מרובי גנים":
הערה: פלסמידים מרובי גנים מאפשרים ביטוי של יותר מגן אחד. בהתאם ליישום במורד הזרם, פלסמידים מרובי גנים יכולים להיות משכפלים או אינטגרטיביים. פלסמידים משוכפלים יש את מקור השמרים של שכפול; לכן, זה יכול להישמר ביציבות כאשר תא שמרים מתחלק. פלסמידים אינטגרטיביים אין את מקור השמרים של שכפול. במקום זאת, יש להם זרועות הומולוגיות של 5 ו -3 'המאפשרות שילוב של גנים מרובים לתוך לוקוסים ספציפיים של הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית.
5. החלת פלסמידים מרובי גנים לביטוי גנים כרומוזומלי או מבוסס פלסמיד
כאן התוצאות של ארבעה פלסמידים מרובי גנים משוכפלים לייצור β קרוטן (צהוב) וליקופן (אדום). פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2 נבנה, שהמושבות שלו אדומות.
שכפול תקליטורים לווקטור הערך (pYTK001)
ERG20 הוגבר מגנום השמרים ו...
ערכת השיבוט המבוססת על MoClo שפותחה על ידי Lee et al. מספקת משאב מצוין להרכבה מהירה של אחת עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים או לשכפול או להשתלבות בגנום השמרים. השימוש בערכה זו מבטל את צוואר הבקבוק של שיבוט זמן רב שקיים לעתים קרובות להבעת גנים מרובים בשמרים.
בדקנו חמישה תנאים ?...
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת מדינת ניו יורק (פרס #: 71272) ופרס IMPACT של האוניברסיטה בבאפלו (פרס #: 000077).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved