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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Abstract

Il metodo di clonazione golden gate consente il rapido assemblaggio di più geni in qualsiasi disposizione definita dall'utente. Utilizza enzimi di restrizione di tipo IIS che tagliano al di fuori dei loro siti di riconoscimento e creano una breve sporgenza. Questo sistema di clonazione modulare (MoClo) utilizza un flusso di lavoro gerarchico in cui diverse parti del DNA, come promotori, sequenze di codifica (CDS) e terminatori, vengono prima clonate in un vettore di ingresso. Più vettori di ingresso si assemblano quindi in unità di trascrizione. Diverse unità di trascrizione si connettono quindi in un plasmide multi-gene. La strategia di clonazione del Golden Gate è di enorme vantaggio perché consente un assemblaggio senza cicatrici, direzionale e modulare in una reazione a un vaso. Il flusso di lavoro gerarchico consente in genere la facile clonazione di una grande varietà di costrutti multi-gene senza bisogno di sequenziamento oltre i vettori di ingresso. L'uso di abbandoni proteici fluorescenti consente un facile screening visivo. Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e dettagliato per l'assemblaggio di plasmidi multi-genico utilizzando il kit di clonazione modulare del lievito (MoClo). Mostriamo risultati ottimali e non ottimali dell'assemblaggio plasmide multi-genico e forniamo una guida per lo screening per le colonie. Questa strategia di clonazione è altamente applicabile per l'ingegneria metabolica del lievito e altre situazioni in cui è richiesta la clonazione plasmide multi-genica.

Introduzione

La biologia sintetica mira a progettare sistemi biologici con nuove funzionalità utili per l'industria farmaceutica, agricola e chimica. Assemblare un gran numero di frammenti di DNA in modo ad alta produttività è una tecnologia fondamentale nella biologia sintetica. Un processo così complicato può scomporsi in più livelli con complessità decrescente, un concetto preso in prestito dalle scienzeingegneristiche di base 1,2. In biologia sintetica, i frammenti di DNA di solito si assemblano gerarchicamente in base alla funzionalità: (i) Livello di parte: "parti" si riferisce a frammenti di DNA con una funzione specifica, come un promotore, una sequenza di codifica, un terminatore, un'origine della replicazione; (ii) Livello di unità di trascrizione (TU): un TU è costituito da un promotore, una sequenza di codifica e un terminatore in grado di trascrivere un singolo gene; ( iii) Livello multi-genico: un plasmide multi-gene contiene più UD spesso composte da un'intera via metabolica. Questo assemblaggio gerarchico introdotto dalla comunità BioBrick è il concetto fondamentale per l'assemblaggio di grandi serie di DNA in biologia sintetica3.

Nell'ultimo decennio4,5,6,7 , la tecnica diclonazionedel Golden Gate ha facilitato significativamente l'assemblaggio gerarchico del DNA2. Molti altri metodi di clonazione in più parti, come Gibsoncloning 8, ligation-independent cloning (SLIC)9, uracil excision-based cloning (USER)10, ligase cycling reaction (LCR)11e in vivo recombination (DNA Assembler)12,13, sono stati sviluppati finora. Ma la clonazione del Golden Gate è un metodo ideale di assemblaggio del DNA perché è indipendente dalle sequenze specifiche del gene, consentendo l'assemblaggio senza cicatrici, direzionali e modulari in una reazione a un vaso. La clonazione di Golden Gate sfrutta enzimi di restrizione di tipo IIS che riconoscono una sequenza non palindromica per creare sporgenze scaglionate al di fuori del sito diriconoscimento 2. Una ligasi si unisce quindi ai frammenti di DNA ricotto per ottenere un assemblaggio in più parti. L'applicazione di questa strategia di clonazione al sistema modulare di clonazione (MoClo) ha permesso l'assemblaggio di un massimo di 10 frammenti di DNA con oltre il 90% di trasformatori schermati contenenti il costruttocorrettamente assemblato 4.

Il sistema MoClo offre enormi vantaggi che hanno accelerato il ciclo di progettazione-costruzione-test della biologia sintetica. In primo luogo, le parti intercambiabili consentono alla clonazione combinatoria di testare rapidamente un ampio spazio di parametri. Ad esempio, l'ottimizzazione di un percorso metabolico di solito richiede di pedalare attraverso molti promotori per ogni gene per bilanciare il flusso del percorso. Il sistema MoClo è in grado di gestire facilmente attività di clonazione così impegnative. In secondo luogo, è necessario sequenziare la parte plasmide ma tipicamente non il TU o i plasmidi multi-genici. Nella maggior parte dei casi, lo screening per colonia PCR o la digestione delle restrizioni è sufficiente per la verifica a livello di TU e plasmide multi-gene. Questo perché la clonazione della parte plasmide è l'unico passo che richiede PCR, che spesso introduce mutazioni. In terzo luogo, il sistema MoClo è ideale per la costruzione di percorsi metabolici complessi multi-genico. Infine, a causa degli strapiombi universali, i plasmidi della parte possono essere riutilizzati e condivisi con l'intera comunità della bioingegneria. Attualmente, i kit MoClo sono disponibili per piante14,15,5,16,17,funghi6,18,19,20,21,22,batteri7,23,24,25,26,27e animali28,29. Recentemente è stata introdotta anche una piattaforma MoClo multi-regno30.

Per Saccharomyces cerevisiae,Lee etal. Questo kit è disponibile in un comodo formato da 96 po 'e definisce otto tipi di parti di DNA intercambiabili con una vasta collezione di promotori ben caratterizzati, proteine fluorescenti, terminatori, tag peptidici, marcatori di selezione, origine della replicazione e strumenti di editing del genoma. Questo toolkit permette l'assemblaggio di un massimo di cinque unità di trascrizione in un plasmide multi-gene. Queste caratteristiche sono preziose per l'ingegneria metabolica del lievito, in cui percorsi parziali o interi sono sovrascritti per produrre sostanze chimiche mirate. Utilizzando questo kit, i ricercatori hanno ottimizzato la produzione di geraniolo, linaloolo31,penicillina32,acido muconico33,indaco34e betalain35 nel lievito.

Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per guidare l'uso del toolkit MoClo per generare percorsi multi-genici per l'espressione episomica o genomica. Attraverso l'uso esorato di questo kit, abbiamo scoperto che la misurazione accurata delle concentrazioni di DNA è fondamentale per garantire la distribuzione equimolare di ogni parte nella reazione del Golden Gate. Consigliamo anche la legasi del DNA T4 sulla ligasi del DNA T7 perché la prima funziona meglio con un numero maggiore di strapiombi36. Infine, tutti i siti di riconoscimento interno di BsmBI e BsaI devono essere rimossi o addomesticati prima dell'assemblaggio. In alternativa, si può prendere in considerazione la sintesi di parti per rimuovere più siti interni e ottenere l'ottimizzazione simultanea del codone. Dimostriamo come utilizzare questo toolkit esprimendo una via a cinque geni per la produzione di β-carotene e licopene in S. cerevisiae. Mostriamo inoltre come eliminare il locus ADE2 utilizzando gli strumenti di modifica del genoma di questo kit. Questi esperimenti basati sul colore sono stati selezionati per una facile visualizzazione. Dimostriamo anche come generare proteine di fusione e creare mutazioni di amminoacidi usando la clonazione del Golden Gate.

Protocollo

NOTA: Il protocollo di clonazione gerarchica offerto in questo toolkit può essere diviso in tre passaggi principali: 1. Clonazione di plasmidi di parte; 2. Unità di trascrizione della clonazione (TA); 3. Clonazione di plasmidi multi-genici(figura 1). Questo protocollo parte dal design del primer e termina con le applicazioni del plasmide multi-gene clonato.

1. Design primer per la clonazione della parte plasmide (pYTK001):

  1. Progettare i primer avanti e indietro contenenti nucleotidi di fianco TTT all'estremità 5', un sito di riconoscimento BsmBI con un nucleotide aggiuntivo (CGTCTCN), uno sbalzo a 4 nucleotidi (nt) (TCGG) complementare a quello del vettore di ingresso, un sito di riconoscimento BsaI con un nucleotide aggiuntivo (GGTCTCN) e una sporgenza specifica della parte da 4 nt, oltre alla sequenza specifica del modello(Figura 2A). GoldenBraid 4.037 e GoldenMutagenesis38 sono alcuni dei software online che possono essere utilizzati per il design specifico del primer Golden Gate.
  2. Se i siti di riconoscimento BsaI o BsmBI sono presenti in qualsiasi parte, utilizzare un passaggio di addomesticamento per mutare questi siti prima dell'assemblaggio di Golden Gate39. Per i plasmidi integrativi (vedi fase 4), addomesticare qualsiasi sito di riconoscimento NotI. Per addomesticare una parte con un sito di riconoscimento indesiderato, dividere la parte in due sottoparti vicino al sito indesiderato (Figura 2A):
    1. Progettare il primer avanti della prima sottoparte nello stesso modo del passaggio 1.1. ma progettare il primer inverso con il sito BsmBI e solo una sporgenza specifica del gene 4-nt.
    2. Progettare il primor forward della seconda sotto-parte con il sito BsmBI e la sporgenza specifica del gene 4-nt solo che si sovrappone al primer inverso della prima sotto-parte. Progettare il primer inverso della seconda sotto parte nello stesso modo del passaggio 1.1.
    3. Introdurre le mutazioni desiderate nel verso (per il passaggio 1.2.1) o nel primer avanti (fase 1.2.2) nella regione specifica del gene del primer.
      NOTA: In alternativa, una parte senza BsmBI e BsaI e ottimizzata per il codone può essere sintetizzata commercialmente. Per le sequenze di codifica (CDS), una mutazione sinonimi può essere facilmente incorporata al terzo nucleotide di un codone amminoacido. Per i promotori e i terminatori, tuttavia, si raccomanda di controllare l'attività del promotore o del terminatore mutato utilizzando un saggio reporter39. Se c'è un sito di restrizione indesiderato verso la fine della sequenza, può essere mutato usando un primer inverso più lungo. Se sono presenti più siti indesiderati, la mutagenesi diretta dal sito che consente di mutare più siti può essere eseguita40.
  3. Occasionalmente, è auspicabile fondere due proteine come una singola parte con un linker nel mezzo(Figura 2A). Il linker aiuta a garantire l'integrità strutturale delle due singole proteine41.
    1. Il primer in avanti per il primo gene è lo stesso del passaggio 1.1. Nel primer inverso, includono un sito BsmBI, una sporgenza specifica del gene 4-nt e una sequenza di linker. Lo sbalzo 4-nt può essere il linker o i primi nucleotidi del secondo gene.
    2. Per il secondo gene, progettare il primer in avanti in modo che abbia un sito di riconoscimento BsmBI e uno strapiombo di 4-nt complementare a quello del primer inverso del primo gene. Progettare il primer inverso del secondo gene come nel passaggio 1.1.
  4. Per amplificare le parti mediante reazione a catena della polimerasi (PCR)42, utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà per amplificare le parti da un DNA genomico, un cDNA o un plasmide. Controllare il prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% seguito da purificazione del gel. L'uso di DNA purificato è fortemente raccomandato, se la purificazione del gel è laboriosa, utilizzare almeno una colonna di spin per purificare il prodotto PCR.

2. Clonazione di parti nel vettore di ingresso (pYTK001) per creare plasmidi di parte (Figura 2B)

  1. Per impostare il mix di reazione di Golden Gate, aggiungere 20 fmol di ogni prodotto PCR e il vettore di ingresso (pYTK001), 1 μL di tampone di ligasi 10X T4, 0,5 μL di Esp3I (un isoschizomero altamente efficiente di BsmBI) e 0,5 μL di T4 ligasi. Aggiungere ddH2O per portare il volume totale a 10 μL.
  2. Per impostare la reazione di clonazione, eseguire il seguente programma in un termociclo: 25-35 cicli di 37 °C per 5 min (digestione) e 16 °C per 5 min (legatura), seguito da una digestione finale a 50 °C per 10 minuti e inattivazione enzimatica a 80 °C per 10 min.
    NOTA: Si raccomandano 35 cicli di digestione/legatura quando si clonano più pezzi di DNA nel vettore di ingresso contemporaneamente, ad esempio durante la clonazione di geni di fusione o l'addomesticamento di un gene.
  3. Trasformare l'intero mix di reazione nel ceppo DH5α o nelle cellule equivalenti di Escherichia coli chimicamente competenti mediante shock termico. Si raccomanda di trasformare l'intero prodotto clonato da 10 μL in cellule E. coli chimicamente competenti da 35 μL (2 X10 5 cfu/mL, il cfu viene calcolato trasformando 5 ng pYTK001 in 100 μL delle cellule competenti). Stendere su una piastra di brodo di lisogenia (LB) con 35 μg/mL di cloramfenicolo (Cm). Incubare a 37 °C durante la notte.
  4. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatore e mantenere la piastra a 4 °C per circa 5 ore per lasciare che la proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP) si sviluppi per un colore verde più intenso.
  5. Per uno screening più semplice, posizionare la piastra su un ultravioletto (UV) o un transilluminatore a luce blu. La sfGFP contenente colonie si fluoresce sotto la luce UV.
  6. Le colonie verdi sono negative perché contengono il pYTK001 non tagliato. Le colonie bianche sono probabilmente positive. La clonazione di solito ha successo se ci sono ~30-100% colonie bianche. Eseguire ulteriori screening di alcune colonie bianche da parte della COLONIA PCR o digestione di restrizione (enzima suggerito: BsaI-HFv2).
  7. Purificare i plasmidi da alcune delle colonie potenzialmente corrette e confermare le sequenze con il sequenziamento di Sanger.

3. Assemblaggio di parte plasmidi in plasmidi "cassetta"

NOTA: Un plasmide a cassetta contiene un'unità di trascrizione definita dall'utente (TU) composta da un promotore, un CDS e un terminatore. Un plasmide a cassetta permette l'espressione di un singolo gene. Se i plasmidi a cassetta saranno assemblati in un plasmide multi-gene, allora il primo passo è determinare il numero e l'ordine delle TA nel plasmide multi-gene. Questi determineranno quali connettori utilizzare nei plasmidi a cassetta poiché i connettori collegano le TA nel plasmide multi-gene. Il primo connettore sinistro di TU deve essere ConLS e il connettore destro dell'ultimo TU deve essere ConRE. Si sovrapporranno ai plasmidi multi-genici di ConLS' e ConRE'. Il resto dei connettori deve essere nell'ordine numerico crescente. Ad esempio, se il plasmide multi-gene contiene quattro TU, le combinazioni di connettori sarebbero ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 e ConL3-TU4-ConRE (Figura 1).

  1. Prima di assemblare unità di trascrizione, si consiglia di assemblare un vettore intermedio con le seguenti sei parti: il connettore sinistro, l'abbandono sfGFP (pYTK047), il connettore destro, un marcatore di selezione del lievito, un'origine di lievito di replicazione e il plasmide della parte con un mRFP1, un'origine E. coli e il gene resistente all'ampicillina (pYTK083)(Figura 3).
    1. Purificare i sei plasmidi di cui sopra. Registrare le loro concentrazioni utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis o un saggio a base di fluorescenza e diluire ogni plasmide con ddH2O in modo che 1 μL abbia 20 fmol di DNA. Calcola la concentrazione molare del DNA utilizzando una calcolatrice online.
      NOTA: È molto importante misurare con precisione le concentrazioni di DNA e pipettare proprio per il lavoro dell'assemblaggio, specialmente per gli assemblaggi con plasmidi da cinque a sette parti. Piccoli errori nella concentrazione di DNA di ogni plasmide possono causare una significativa diminuzione dell'efficienza della clonazione.
    2. Aggiungere 1 μL di ogni plasmide, 1 μL di tampone di ligasi 10X T4, 0,5 μL di BsaI-HFv2 (una versione altamente efficiente del BsaI) e 0,5 μL di T4 ligasi. Impostare il volume a 10 μL aggiungendo ddH2O.
    3. Per impostare la reazione di clonazione, eseguire il seguente programma nel termociclo: 25-35 cicli di 37 °C per 5 min (digestione) e 16 °C per 5 min (legatura). Omettere le fasi finali di digestione e inattivazione del calore in quanto i siti BsaI devono essere mantenuti nel vettore intermedio (Figura 3).
    4. Trasformare l'intero mix di reazione nel ceppo DH5α o in altre cellule competenti di E. coli. Stendere su una piastra LB con carbenicillina (Cb) o ampicillina da 50 μg/mL. Incubare a 37 °C durante la notte.
      NOTA: La carbenicillina è un analogo stabile dell'ampicillina.
    5. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatrice. La piastra conterrà colonie sia di colore rosso pallido che verde pallido(figure 6C e 6D). Mantenere la piastra a 4 °C per circa 5 ore per far maturare mRFP1 e sfGFP. Utilizzare un uv o un transilluminatore a luce blu per identificare le colonie verdi, che contengono il vettore intermedio potenzialmente corretto.
    6. Striare le colonie verdi su una piastra LB + Cb e incubare a 37 °C durante la notte. Il giorno dopo, strisciare di nuovo su una piastra LB + Cm e incubare a 37 ° C durante la notte. Le colonie che crescono su piastre LB + Cm contengono plasmidi smontati perché i vettori di parti resistenti al Cm vengono mantenuti.
    7. Scegli le colonie che non crescono sulla piastra LB + Cm ed esegui digestione di restrizione (enzimi suggeriti: BsaI-HFv2, Esp3I) per confermare il plasmide assemblato correttamente. In alternativa, utilizzare la PCR colonia per lo screening.
  2. Una volta che il vettore intermedio è stato assemblato con successo, il passo successivo è assemblare le unità di trascrizione. Questo è un assieme di 4 pezzi con le seguenti parti: il vettore intermedio, un promotore, un CDS e un terminatore.
    1. Purificare i plasmidi in quattro parti. Registrare le loro concentrazioni e diluire ciascuno di plasmide in modo che 1 μL abbia 20 fmol di DNA.
    2. Per impostare il mix di reazioni, seguire il passaggio 3.1.2.
    3. Per impostare la reazione di clonazione, seguire il passaggio 2.2.
    4. Trasformare l'intero mix di reazione di clonazione nelle cellule e nella piastra competenti DH5α o equivalente E. coli su LB + Cb. Incubare a 37 °C durante la notte.
    5. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatore. Appariranno colonie bianche e verde pallido(figure 6E e 6F). Mantenere la piastra a 4 °C per circa 5 ore per far maturare la sfGFP. Utilizzare un uv o un transilluminatore a luce blu per identificare le colonie bianche non fluorescenti. Questi contengono le unità di trascrizione potenzialmente corrette.
    6. Striati e cresci 8-10 colonie bianche ed esegui una PCR colonia. Purificare i plasmidi dalle colonie che testano positivo dalla PCR della colonia. Effettuare la digestione delle restrizioni (enzima suggerito: Esp3I) per confermare ulteriormente l'assemblaggio.
      NOTA: Il sequenziamento delle unità di trascrizione in genere non è necessario perché la clonazione comporta solo digestione e legatura di restrizione. Tutte le sequenze di interesse sono state confermate a livello plasmideo della parte.

4. Assemblaggio di plasmidi a cassetta in plasmidi "multi-gene":

NOTA: I plasmidi multi-genico consentono l'espressione di più di un gene. A seconda dell'applicazione a valle, i plasmidi multi-genico potrebbero essere replicativi o integrativi. I plasmidi replicativi hanno l'origine lievitata della replicazione; pertanto, può essere mantenuto stabilmente quando la cellula di lievito si divide. I plasmidi integrativi non hanno l'origine del lievito di replicazione. Invece, hanno bracci di omologia da 5' e 3' che consentono l'integrazione di più geni in loci specifici del genoma attraverso la ricombinazione omologa.

  1. Per i plasmidi multi-genico, assemblare prima un vettore intermedio.
    1. Per assemblare vettori intermedi replicativi (Figura 4A), assemblare le seguenti sei parti: il connettore sinistro (ConLS'-pYTK008), l'abbandono sfGFP (pYTK047), il connettore destro (ConRE'-pYTK072), un marcatore di selezione del lievito, un'origine di lievito di replicazione, e la parte plasmide con mRFP1, un'origine E. coli di replicazione, e il gene resistente alla kanamicina (pYTK084).
      1. Per il montaggio, seguire i passaggi dal 3.1.1 al 3.1.3.
      2. Trasformare l'intero mix di reazione di clonazione in CELLULE COMPETENTI DH5α o equivalente E. coli e piastra su LB più 50 μg/mL di kanamicina (Km). Incubare a 37 °C durante la notte.
      3. Per lo screening a colori rosso/verde, seguire il passaggio 3.1.5.
      4. Per lo screening di misassemblies, strisciare e far crescere le colonie verdi su una piastra LB + Km. Seguire quindi il passaggio 3.1.6.
    2. Per i vettori multi-genico integrativi (Figura 4B), determinare prima il luogo genomico di interesse, quindi progettare circa 500 coppie di basi di bracci di omologia 5' e 3' per l'integrazione in quel luogo.
      1. Clonare i bracci di omologia da 5' e 3' dal DNA genomico del lievito nel vettore di ingresso-pYTK001. Seguire i passaggi 1 e 2.
      2. Assemblare i seguenti sette plasmidi: il connettore sinistro (ConLS'-pYTK008), l'abbandono sfGFP (pYTK047), il connettore destro (ConRE'-pYTK072), un marcatore di selezione del lievito, il braccio di omologia 3', la parte plasmide con mRFP1, e. coli origine di replicazione, e il gene resistente alla kanamicina (pYTK090), e il braccio di omologia 5'.
      3. Per il montaggio e lo screening, seguire il passaggio 4.1.1.
  2. Assemblaggio del plasmide multi-gene
    1. Purificare i plasmidi del vettore intermedio ottenuto nel passaggio 4.1 e i plasmidi a cassetta del passaggio 3. Registrare le loro concentrazioni utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis o un saggio a base di fluorescenza. Diluire ciascuno in ddH2O in modo che 1 μL abbia 20 Fmol DI DNA.
    2. Aggiungere 1 μL di vettore intermedio, 1 μL di ogni unità di trascrizione, 1 μL di 10x T4 ligasi buffer, 0,5 μL di Esp3I e 0,5 μL di T4 ligasi. Portare il volume a 10 μL di utilizzo di ddH2O.
    3. Per impostare la reazione di clonazione, seguire il passaggio 2.2.
    4. Trasformare l'intero mix di reazione di clonazione in CELLULE COMPETENTI DH5α o equivalente E. coli e piastra su LB + Km.
    5. Eseguire lo screening verde/bianco come nel passaggio 3.2.5.
    6. Purifica i plasmidi da alcune colonie bianche ed esegui digestione delle restrizioni. Si raccomanda di utilizzare l'enzima NotI-HF perché esistono due siti NotI rispettivamente all'origine E. coli e alla parte marcatore di selezione Km (Figura 4B). Se il plasmide assemblato è molto grande, allora un altro sito di restrizione può essere scelto per un'ulteriore conferma. In alternativa, schermare con la PCR colonia prima di procedere alla digestione delle restrizioni.

5. Applicazione di plasmidi multi-genici per l'espressione genica cromosomica o plasmide

  1. Integrazione del plasmide multi-genico nel genoma del lievito per l'espressione genica cromosomica (Figura 5)
    1. Progettare un RNA guida (gRNA) per il locus desiderato. Per determinare la specificità massima su destinazione, è consigliabile utilizzare più risorse online, ad esempio Benchling, CRISPRdirect43e CHOPCHOP44.
    2. Clonare il gRNA sintetizzato da 20 nt nel pCAS plasmid45 mediante clonazione Gibson. Linearizzare il plasmide pCAS mediante PCR utilizzando una coppia di primer invertita che si lega rispettivamente al 3' del ribozima HDV e al 5' del tracrRNA (Figura 5). In alternativa, clonare il gRNA nel plasmide di abbandono di sgRNA (pYTK050) e assemblare il plasmide dropout in un plasmide a cassetta con linker. Quindi assemblare il Cas9 TU con il plasmide della parte Cas9 (pYTK036). Infine, assemblare il Cas9 TU e lo sgRNA TU in un plasmide multi-gene replicativo.
    3. Linearizzare 5-15 μg di plasmide multi-genico integrativo con 1 μL di enzima NotI-HF durante la notte. Trasforma 1 μg di pCAS-gRNA e il plasmide multi-gene integrativo linearizzato in S. cerevisiae. Preparare celle competenti utilizzando un kit di trasformazione del lievito disponibile in commercio o seguendo il protocollo di Geitz e Schiestl, 200746.
      NOTA: Non è necessario purificare il plasmide multi-gene linearizzato dopo la digestione NotI.
    4. Pellettare le cellule dopo il recupero, scartare il supernatante, lavare con lo stesso volume d'acqua. Plate cellule di lievito sulla piastra completa di abbandono del mezzo sintetico (CSM) o sulla piastra di semi di estratto di peptone di peptone destrosio (YPD) con antibiotici, a seconda del marcatore selettivo del lievito. Incubare a 37 °C per due giorni affinché si formino colonie. Nel caso in cui non si osservi alcuna colonia, incubare per un ulteriore da uno a due giorni a 30 °C.
    5. Scherma le colonie di lievito per l'integrazione per colonia PCR47.
    6. Per curare il pCAS, striature la colonia con la corretta integrazione su una piastra YPD non selettiva. Crescere a 30 °C durante la notte. Striscia una colonia dal piatto YPD su un piatto YPD fresco. Ancora una volta, crescere a 30 °C durante la notte. Striature una colonia dalla seconda placca YPD a una YPD più 100 μg/mL nourseothricin, il marcatore di selezione di pCAS. La polimerizzazione riuscita si verifica quando le cellule di lievito non riescono a crescere sulla piastra selettiva.
      NOTA: Se il plasmide pCAS non viene polimerizzato in due cicli di YPD non selettivo, strisciare di nuovo su un YPD fresco per altri 1-2 colpi.
  2. Trasformazione del plasmide multi-gene replicativo per l'espressione genica basata sul plasmide
    1. Trasforma 100 ng-1 μg plasmide multi-gene puro in cellule competenti di S. cerevisiae.
    2. Piastrere le cellule di lievito immediatamente dopo la trasformazione nella piastra di abbandono csm o YPD più piastra antibiotica, a seconda del marcatore di selezione del lievito utilizzato. Incubare a 30 °C per 2-3 giorni per formare colonie.

Risultati

Qui i risultati di quattro plasmidi multi-genico replicativi per β-carotene (giallo) e licopene (rosso). È stato costruito un plasmide multi-gene integrativo per interrompere il locus ADE2, le cui colonie sono rosse.

Clonazione di CDS nel vettore di ingresso (pYTK001)
ERG20 è stato amplificato dal genoma del lievito e dai tre geni carotenoidi crtE, crtYB, crtI d...

Discussione

Il kit di clonazione basato su MoClo sviluppato da Lee et al. L'uso di questo kit elimina il collo di bottiglia di clonazione che richiede tempo che spesso esiste per esprimere più geni nel lievito.

Abbiamo testato cinque diverse condizioni per i cicli di digestione / legatura della clonazione del Golden Gate con T4 DNA ligasi. Abbiamo scoperto che 30 cicli di digestione a 37 °C per 5 minuti e legatura a 16 °C per 5 minuti seguiti da una fase finale di digestione a 50 °C per 10 minuti e un...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Research Foundation per la State University of New York (Premio #: 71272) e dall'IMPACT Award of University at Buffalo (Premio #: 000077).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm Glass beadsRPI research products9831For lysing yeast cells
Bacto AgarBD & Company214010Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto PeptoneBD& Company211677Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Sa highly efficient version of BsaI restriction enzyme
CarbenicillinFisher Bioreagents4800-94-6Antibiotic for screening at the transcription unit level
ChloramphenicolFisher Bioreagents56-75-7Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsBD & Company291940Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs for PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Sa highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001For yeast transformation
HexanesFisher ChemicalH302-1For carotenoid extraction from yeast cells
KanamycinFisher Bioreagents25389-94-0Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
LycopeneCayman chemicalsNC1142173For lycopene quantification
MoClo YTKAddgene1000000061Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LFor plasmid purification from E.coli
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND2000cFor measuring accurate DNA concentrations
NotI-HFNew England BiolabsR3189SRestriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin SulphateGoldbioN-500-100Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)New England BiolabsB0518SBuffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530SHigh fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494Addgene100539Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz CuvetteThermo Electron10050801For quantifing carotenoids
T4 ligaseNew England BiolabsM0202SLigase for Golden Gate cloning
ThermocyclerBIO-RAD1851148For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue HomogenizerBullet BlenderModel: BBX24For homogenization of yeast cells
UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificGenesys 150For quantifing carotenoids
Yeast ExtractFisher BioreagentsBP1422-500Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-caroteneAlfa AesarAAH6010603For β-carotene quantification

Riferimenti

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