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Résumé

L’objectif de ce protocole est de fournir un guide détaillé, étape par étape, pour l’assemblage de constructions multigéniques à l’aide du système modulaire de clonage basé sur le clonage Golden Gate. Il formule également des recommandations sur les étapes critiques pour assurer un assemblage optimal en fonction de nos expériences.

Résumé

La méthode de clonage golden gate permet l’assemblage rapide de plusieurs gènes dans n’importe quel arrangement défini par l’utilisateur. Il utilise des enzymes de restriction de type IIS qui coupent en dehors de leurs sites de reconnaissance et créent un court surplomb. Ce système modulaire de clonage (MoClo) utilise un flux de travail hiérarchique dans lequel différentes parties de l’ADN, telles que les promoteurs, les séquences de codage (CDS) et les terminateurs, sont d’abord clonées dans un vecteur d’entrée. Les vecteurs à entrées multiples se rassemblent ensuite en unités de transcription. Plusieurs unités de transcription se connectent alors à un plasmide multigénique. La stratégie de clonage golden gate est d’un énorme avantage car elle permet un assemblage sans cicatrice, directionnel et modulaire dans une réaction d’un pot. Le flux de travail hiérarchique permet généralement le clonage facile d’une grande variété de constructions multigéniques sans avoir besoin de séquençage au-delà des vecteurs d’entrée. L’utilisation d’abandons de protéines fluorescentes permet un dépistage visuel facile. Ces travaux fournissent un protocole détaillé, étape par étape pour l’assemblage de plasmides multigéniques à l’aide du kit modulaire de clonage de levures (MoClo). Nous montrons des résultats optimaux et sous-optimaux de l’assemblage de plasmides multigéniques et fournissons un guide pour le dépistage des colonies. Cette stratégie de clonage est très applicable pour l’ingénierie métabolique de levure et d’autres situations dans lesquelles le clonage plasmide multigénique est exigé.

Introduction

La biologie synthétique vise à concevoir des systèmes biologiques avec de nouvelles fonctionnalités utiles pour les industries pharmaceutiques, agricoles et chimiques. L’assemblage d’un grand nombre de fragments d’ADN d’une manière à haut débit est une technologie fondamentale en biologie synthétique. Un processus aussi compliqué peut se décomposer en plusieurs niveaux avec une complexité décroissante, un concept emprunté aux sciences fondamentales del’ingénierie 1,2. En biologie synthétique, les fragments d’ADN s’assemblent généralement hiérarchiquement en fonction de la fonctionnalité : (i) Niveau de partie : les « parties » désignent les fragments d’ADN ayant une fonction spécifique, comme un promoteur, une séquence de codage, un terminateur, une origine de réplication; (ii) Niveau des unités de transcription (TU) : un TU se compose d’un promoteur, d’une séquence de codage et d’un terminateur capable de transcrire un seul gène; (iii) Niveau multigénique : un plasmide multigénique contient plusieurs OV souvent constitués d’une voie métabolique entière. Cet assemblage hiérarchique lancé par la communauté BioBrick est le concept fondamental pour l’assemblage de grands ensembles d’ADN en biologie synthétique3.

Au cours de la dernièredécennie 4,5,6,7, la technique de clonage Golden Gate a considérablement facilité l’assemblage hiérarchique de l’ADN2. Beaucoup d’autres méthodes de clonage en plusieurs parties, telles que le clonage Gibson8, le clonage indépendant de ligature (SLIC)9, le clonage à base d’excision uracil (USER)10, la réaction du cycle ligase (LCR)11, et la recombinaison in vivo (Assembleur d’ADN)12,13, ont également été développés jusqu’à présent. Mais le clonage Golden Gate est une méthode idéale d’assemblage de l’ADN parce qu’il est indépendant des séquences spécifiques aux gènes, permettant un assemblage sans cicatrice, directionnel et modulaire dans une réaction d’un pot. Le clonage golden gate tire parti des enzymes de restriction de type IIS qui reconnaissent une séquence non palindromic pour créer des surplombs décalés à l’extérieur du site de reconnaissance2. Un ligase rejoint alors les fragments d’ADN annelés pour obtenir un assemblage en plusieurs parties. L’application de cette stratégie de clonage au système modulaire de clonage (MoClo) a permis l’assemblage de jusqu’à 10 fragments d’ADN avec plus de 90% de transformateurs filtrés contenant la construction correctement assemblée4.

Le système MoClo offre d’énormes avantages qui ont accéléré le cycle de conception-construction-test de la biologie synthétique. Tout d’abord, les parties interchangeables permettent au clonage combinatoire de tester rapidement un grand espace de paramètres. Par exemple, l’optimisation d’une voie métabolique nécessite généralement le vélo à travers de nombreux promoteurs pour chaque gène pour équilibrer le flux de la voie. Le système MoClo peut facilement gérer des tâches de clonage aussi exigeantes. Deuxièmement, il faut séquencer la partie plasmide, mais généralement pas la TU ou les plasmides multigéniques. Dans la plupart des cas, le criblage par PCR de colonie ou digestion de restriction est suffisant pour la vérification au niveau de TU et de plasmide multi-gène. C’est parce que le clonage de la partie plasmide est la seule étape nécessitant pcr, qui introduit fréquemment des mutations. Troisièmement, le système MoClo est idéal pour la construction de voies métaboliques complexes multigéniques. Enfin, en raison des surplombs universels, la partie plasmide peut être réutilisée et partagée avec l’ensemble de la communauté de la bioingénierie. Actuellement, moclo kits sont disponibles pour les plantes14,15,5,16,17, champignons6,18,19,20,21,22, bactéries7,23,24,25,26,27, et les animaux28,29. Une plate-forme MoClo multi-royaume a également été introduit récemment30.

Pour Saccharomyces cerevisiae, Lee et coll.6 ont développé une boîte à outils MoClo polyvalente, une excellente ressource pour la communauté de la biologie synthétique de la levure. Ce kit est livré dans un format pratique de 96 puits et définit huit types de pièces d’ADN interchangeables avec une collection diversifiée de promoteurs bien caractérisés, protéines fluorescentes, terminators, étiquettes peptidiques, marqueurs de sélection, l’origine de la réplication, et les outils d’édition du génome. Cette boîte à outils permet l’assemblage d’un jusqu’à cinq unités de transcription dans un plasmide multigénique. Ces caractéristiques sont précieuses pour l’ingénierie métabolique de levure, dans laquelle les voies partielles ou entières sont sur-exprimées pour produire des produits chimiques ciblés. À l’aide de ce kit, les chercheurs ont optimisé la production de géraniol, linalool31, pénicilline32, acide muconique33, indigo34, et betalain35 dans la levure.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape pour guider l’utilisation de la boîte à outils MoClo pour générer des voies multigéniques pour l’expression épisomale ou génomique. Grâce à l’utilisation intensive de ce kit, nous avons constaté que la mesure précise des concentrations d’ADN est essentielle pour assurer la distribution équimolaire de chaque partie de la réaction du Golden Gate. Nous recommandons également la ligase D’ADN T4 sur la ligase d’ADN T7 parce que le premier fonctionne mieux avec un plus grand nombre de surplombs36. Enfin, tous les sites de reconnaissance interne de BsmBI et BsaI doivent être supprimés ou domestiqués avant l’assemblage. Alternativement, on peut envisager de synthétiser les pièces pour supprimer plusieurs sites internes et d’atteindre l’optimisation simultanée du codon. Nous démontrons comment utiliser cette boîte à outils en exprimant une voie à cinq gènes pour la production de β-carotène et de lycopène dans S. cerevisiae. Nous montrons en outre comment assommer le locus ADE2 à l’aide des outils d’édition du génome de ce kit. Ces expériences basées sur les couleurs ont été sélectionnées pour une visualisation facile. Nous démontrons également comment générer des protéines de fusion et créer des mutations d’acides aminés utilisant le clonage golden gate.

Protocole

REMARQUE : Le protocole hiérarchique de clonage offert dans cette boîte à outils peut être divisé en trois étapes principales : 1. Clonage des plasmides de la partie; 2. Unités de transcription du clonage (ET); 3. Clonage de plasmides multigéniques (Figure 1). Ce protocole commence à partir de la conception de l’amorce et se termine par des applications du plasmide multigénique cloné.

1. Conception d’amorce pour clonage de la partie plasmide (pYTK001) :

  1. Concevoir les amorces avant et arrière contenant des nucléotides flanqués TTT à l’extrémité 5', un site de reconnaissance BsmBI avec un nucléotide supplémentaire (CGTCTCN), un surplomb de 4 nucléotides (nt) (TCGG) complémentaire à celui du vecteur d’entrée, un site de reconnaissance BsaI avec un nucléotide supplémentaire (GGTCTCN), et un surplomb spécifique à une partie de 4 nt, en plus de la séquence spécifique au modèle (figure 2A). GoldenBraid 4.037 et GoldenMutagenesis38 sont quelques-uns des logiciels en ligne qui peuvent être utilisés pour golden gate conception d’amorce spécifique.
  2. Si des sites de reconnaissance BsaI ou BsmBI sont présents dans n’importe quelle partie, utilisez une étape de domestication pour muter ces sites avant l’assemblage du Golden Gate39. Pour les plasmides intégratifs (voir l’étape 4), domestiquer n’importe quel site de reconnaissance NotI. Pour domestiquer une pièce avec un site de reconnaissance indésirable, divisez la pièce en deux sous-parties près du site indésirable (figure 2A) :
    1. Concevoir l’amorce avant du premier compartiment de la même manière qu’à l’étape 1.1. mais concevoir l’amorce inverse avec le site BsmBI et un 4-nt gène spécifique surplomb seulement.
    2. Concevoir la deuxième amorce avant de la deuxième sous-partie avec le site BsmBI et le surplomb spécifique au gène 4 nt seulement qui chevauche l’amorce inverse de la première sous-partie. Concevez l’amorce inverse de la deuxième sous-partie de la même manière qu’à l’étape 1.1.
    3. Introduire la mutation désirée dans l’inverse (pour l’étape 1.2.1) ou l’amorce avant (étape 1.2.2) à la région spécifique au gène de l’amorce.
      REMARQUE : Alternativement, une pièce sans BsmBI et BsaI et optimisée pour le codon peut être synthétisée commercialement. Pour les séquences de codage (CDS), une mutation synonyme peut être facilement incorporée au troisième nucléotide d’un codon d’acide aminé. Pour les promoteurs et les terminators, cependant, la vérification du promoteur muté ou de l’activité terminator à l’aide d’un essai de journalisteest recommandée 39. S’il y a un site de restriction indésirable vers la fin de la séquence, il peut être muté à l’aide d’une amorce inverse plus longue. Si plusieurs sites indésirables sont présents, la mutagenèse dirigée par le site permettant la mutation de plusieurs sites peut être effectuée40.
  3. À l’occasion, il est souhaitable de fusionner deux protéines en une seule partie avec un lien entre les deux (figure 2A). Le linker aide à assurer l’intégrité structurale des deux protéines individuelles41.
    1. L’amorce avant du premier gène est la même qu’à l’étape 1.1. Dans l’amorce inverse, inclure un site BsmBI, un surplomb spécifique au gène 4 nt, et une séquence de liaison. Le surplomb de 4 nt peut être soit le linker ou les premiers nucléotides du deuxième gène.
    2. Pour le deuxième gène, concevoir l’amorce avant de telle sorte qu’il a un site de reconnaissance BsmBI et un surplomb de 4 nt complémentaire à celui de l’amorce inverse du premier gène. Concevoir l’amorce inverse du deuxième gène comme à l’étape 1.1.
  4. Pour amplifier les pièces par réaction en chaîne de polymésase (PCR)42,utilisez une polymése d’ADN haute fidélité pour amplifier les parties d’un ADN génomique, d’un CDNA ou d’un plasmide. Vérifiez le produit PCR sur un gel d’agarose de 1% suivi d’une purification par gel. L’utilisation de l’ADN purifié est fortement recommandée, si la purification du gel est laborieuse, utilisez au moins une colonne de spin pour purifier le produit PCR.

2. Clonage des parties dans le vecteur d’entrée (pYTK001) pour créer des plasmides partie (Figure 2B)

  1. Pour configurer le mélange de réaction golden gate, ajouter 20 fmol de chaque produit PCR et le vecteur d’entrée (pYTK001), 1 μL de tampon ligase 10X T4, 0,5 μL d’Esp3I (un isoschizomer très efficace de BsmBI), et 0,5 μL de ligase T4. Ajouter ddH2O pour porter le volume total à 10 μL.
  2. Pour configurer la réaction de clonage, exécutez le programme suivant dans un thermocycler : 25-35 cycles de 37 °C pendant 5 min (digestion) et 16 °C pendant 5 min (ligature), suivi d’une digestion finale à 50 °C pendant 10 min et de l’inactivation enzymatique à 80 °C pendant 10 min.
    REMARQUE : 35 cycles de digestion/ligature sont recommandés lors du clonage simultané de plusieurs morceaux d’ADN dans le vecteur d’entrée, par exemple lors du clonage de gènes de fusion ou de la domestication d’un gène.
  3. Transformez l’ensemble du mélange de réaction en la souche DH5α ou en cellules escherichia coli équivalentes chimiquement compétentes par choc thermique. Il est recommandé de transformer l’ensemble du produit cloné de 10 μL en cellules E. coli 35 μL chimiquement compétentes (2 X10 5 cfu/mL, cfu est calculé à partir de la transformation de 5 ng pYTK001 en 100 μL des cellules compétentes). Étendre sur une plaque de bouillon de lysogène (LB) avec 35 μg/mL de chloramphénicol (Cm). Incuber à 37 °C pendant la nuit.
  4. Après 16-18 h, sortez la plaque de l’incubateur et gardez la plaque à 4 °C pendant environ 5 h pour laisser la protéine fluorescente verte super dossier (sfGFP) se développer pour une couleur verte plus intense.
  5. Pour faciliter le criblage, placez la plaque sur un ultraviolet (UV) ou un transilluminateur de lumière bleue. Le sfGFP contenant des colonies fluore sous la lumière UV.
  6. Les colonies vertes sont négatives parce qu’elles contiennent le pYTK001 non coupé. Les colonies blanches sont probablement positives. Le clonage est généralement réussi s’il y a ~30-100% colonies blanches. Effectuer un dépistage plus long de quelques colonies blanches par pcr colonie ou digestions de restriction (enzyme suggérée: BsaI-HFv2).
  7. Purifier les plasmides de quelques-unes des colonies potentiellement correctes et confirmer les séquences par séquençage Sanger.

3. Assembler des plasmides de pièce en plasmides de « cassette »

REMARQUE : Un plasmide de cassette contient une unité de transcription définie par l’utilisateur (TU) composée d’un promoteur, d’un CDS et d’un terminateur. Un plasmide cassette permet l’expression d’un seul gène. Si les plasmides de cassette seront assemblés dans un plasmide multigénique, alors la première étape consiste à déterminer le nombre et l’ordre des OV dans le plasmide multigénique. Ceux-ci détermineront quels connecteurs utiliser dans les plasmides de cassette puisque les connecteurs relient les OV dans le plasmide multigénique. Le premier connecteur gauche du TU doit être ConLS, et le connecteur droit du dernier TU doit être ConRE. Ils chevaucheront les plasmides multigéniques conLS et ConRE. Le reste des connecteurs doit être dans l’ordre numérique croissant. Par exemple, si le plasmide multigénique contient quatre OV, les combinaisons de connecteurs seraient ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 et ConL3-TU4-ConRE (figure 1).

  1. Avant d’assembler des unités de transcription, il est recommandé d’assembler un vecteur intermédiaire avec les six parties suivantes : le connecteur gauche, le décrochage sfGFP (pYTK047), le connecteur droit, un marqueur de sélection de levure, une origine de levure de réplication et la partie plasmide avec un mRFP1, une origine E. coli et le gène résistant à l’ampicilline (pYTK083) ( figure3).
    1. Purifier les six plasmides ci-dessus. Enregistrez leurs concentrations à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis ou d’un essai à base de fluorescence et diluez chaque plasmide avec ddH2O de sorte que 1 μL ait 20 fmol d’ADN. Calculez la concentration de molaire d’ADN à l’aide d’une calculatrice en ligne.
      REMARQUE : Il est très important de mesurer avec précision les concentrations d’ADN et de pipet précisément pour que l’assemblage fonctionne, en particulier pour les assemblages avec des plasmides en cinq à sept parties. De petites erreurs dans la concentration d’ADN de chaque plasmide peuvent entraîner une diminution significative de l’efficacité du clonage.
    2. Ajouter 1 μL de chaque plasmide, 1 μL de tampon ligase 10X T4, 0,5 μL de BsaI-HFv2 (une version très efficace de BsaI) et 0,5 μL de ligase T4. Composent le volume jusqu’à 10 μL en ajoutant ddH2O.
    3. Pour configurer la réaction de clonage, exécutez le programme suivant dans le thermocycleur : 25-35 cycles de 37 °C pendant 5 min (digestion) et 16 °C pendant 5 min (ligature). Omettez les étapes finales de digestion et d’inactivation thermique, car les sites BsaI doivent être conservés dans le vecteur intermédiaire (figure 3).
    4. Transformez l’ensemble du mélange de réaction en souche DH5α ou en autres cellules compétentes d’E. coli. Étendre sur une plaque LB avec 50 μg/mL de carbenicilline (Cb) ou d’ampicilline. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : La carbenicilline est un analogue stable de l’ampicilline.
    5. Après 16-18 h, sortir la plaque de l’incubateur. La plaque contiendra à la fois des colonies rouge pâle et vert pâle(figures 6C et 6D). Gardez la plaque à 4 °C pendant environ 5 h pour laisser le mRFP1 et le fpSG mûrir. Utilisez un uv ou un transilluminateur de lumière bleue pour identifier les colonies vertes, qui contiennent le vecteur intermédiaire potentiellement correct.
    6. Strier les colonies vertes sur une plaque LB + Cb et incuber à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, stries à nouveau sur une plaque LB + Cm et incuber à 37 °C pendant la nuit. Les colonies qui poussent sur les plaques LB + Cm contiennent des plasmides mal assemblés parce que les vecteurs de pièce résistants au Cm sont conservés.
    7. Choisissez les colonies qui ne poussent pas sur la plaque LB + Cm et effectuez des digestions de restriction (enzymes suggérées : BsaI-HFv2, Esp3I) pour confirmer le plasmide correctement assemblé. Vous pouvez également utiliser le PCR de la colonie pour le dépistage.
  2. Une fois que le vecteur intermédiaire a été assemblé avec succès, l’étape suivante consiste à assembler des unités de transcription. Il s’agit d’un assemblage de 4 pièces avec les parties suivantes: le vecteur intermédiaire, un promoteur, un CDS, et un terminator.
    1. Purifier les plasmides en quatre parties. Enregistrez leurs concentrations et diluez chacun des plasmides de sorte que 1 μL ait 20 fmol d’ADN.
    2. Pour configurer le mélange de réactions, suivez l’étape 3.1.2.
    3. Pour configurer la réaction de clonage, suivez l’étape 2.2.
    4. Transformez l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules compétentes DH5α ou équivalent e. coli et plaquez sur LB + Cb. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
    5. Après 16-18 h, sortez la plaque de l’incubateur. Des colonies blanches et vert pâle apparaîtront( Figures 6E et 6F). Gardez la plaque à 4 °C pendant environ 5 h pour laisser le sfGFP mûrir. Utilisez un uv ou un transilluminateur de lumière bleue pour identifier les colonies blanches non fluorescentes. Ceux-ci contiennent les unités de transcription potentiellement correctes.
    6. Strié et cultiver 8-10 colonies blanches et effectuer une colonie PCR. Purifier les plasmides des colonies qui sont positifs à la colonie PCR. Effectuer la digestion de restriction (enzyme suggérée : Esp3I) pour confirmer davantage l’assemblage.
      REMARQUE : Les unités de transcription de séquençage ne sont généralement pas nécessaires parce que le clonage implique seulement la digestion et la ligature de restriction. Toutes les séquences d’intérêt ont été confirmées au niveau plasmide de pièce.

4. Assemblage de plasmides de cassette en plasmides « multigéniques » :

REMARQUE : Les plasmides multigéniques permettent l’expression de plus d’un gène. Selon l’application en aval, les plasmides multigéniques peuvent être réplicateurs ou intégratifs. Les plasmides réplicateurs ont l’origine de levure de la réplication ; par conséquent, il peut être maintenu de façon durable lorsque la cellule de levure se divise. Les plasmides intégrateurs n’ont pas l’origine de levure de la réplication. Au lieu de cela, ils ont des bras homologiques de 5' et 3' permettant l’intégration de gènes multiples dans des loci spécifiques du génome par recombinaison homologue.

  1. Pour les plasmides multigéniques, assemblez d’abord un vecteur intermédiaire.
    1. Pour assembler des vecteurs intermédiaires réplicateurs(figure 4A),assemblez les six parties suivantes : le connecteur gauche (ConLS'-pYTK008), le décrochage du fpSG (pYTK047), le connecteur droit (ConRE'-pYTK072), un marqueur de sélection de levures, une origine de levure de réplication, et la partie plasmide avec mRFP1, une origine E. coli de réplication, et le gène résistant à la kanamycine (pYTK084).
      1. Pour l’assemblage, suivez les étapes de 3.1.1 à 3.1.3.
      2. Transformez l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules compétentes DH5α ou E. coli équivalentes, et plaquez sur LB plus 50 μg/mL kanamycine (Km). Incuber à 37 °C pendant la nuit.
      3. Pour le dépistage couleur rouge/vert, suivez l’étape 3.1.5.
      4. Pour le criblage des démontages, stries et cultiver les colonies vertes sur une plaque LB + Km. Suivez ensuite l’étape 3.1.6.
    2. Pour les vecteurs multigéniques intégratifs (figure 4B), déterminer le lieu génomique d’intérêt d’abord, puis concevoir environ 500 paires de base de 5' et 3 ' bras homologiques pour l’intégration à ce locus.
      1. Cloner les bras homologiques de 5' et 3' de l’ADN génomique de levure dans l’entrée vectorielle-pYTK001. Suivez les étapes 1 et 2.
      2. Assembler les sept plasmides suivants : le connecteur gauche (ConLS'-pYTK008), le décrochage sfGFP (pYTK047), le connecteur droit (ConRE'-pYTK072), un marqueur de sélection de levures, le bras d’homologie de 3', la partie plasmide avec mRFP1, e. coli origine de la réplication, et le gène kanamycine-résistant (pYTK090), et le bras d’homologie de 5'.
      3. Pour l’assemblage et le criblage, suivez l’étape 4.1.1.
  2. Assemblage du plasmide multigénique
    1. Purifier les plasmides du vecteur intermédiaire obtenu à l’étape 4.1 et les plasmides de cassette de l’étape 3. Enregistrez leurs concentrations à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis ou d’un test à base de fluorescence. Diluer chacun dans ddH2O de sorte que 1 μL a 20 ADN de fmol.
    2. Ajouter 1 μL de vecteur intermédiaire, 1 μL de chaque unité de transcription, 1 μL de tampon ligase 10x T4, 0,5 μL d’Esp3I et 0,5 μL de ligase T4. Porter le volume à 10 μL d’utilisation de ddH2O.
    3. Pour configurer la réaction de clonage, suivez l’étape 2.2.
    4. Transformez l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules compétentes DH5α ou E. coli équivalentes, et plaquez sur LB + Km. Incubez à 37 °C pendant la nuit.
    5. Effectuez le criblage vert/blanc comme à l’étape 3.2.5.
    6. Purifier les plasmides de quelques colonies blanches et effectuer des digestions de restriction. L’utilisation de l’enzyme NotI-HF est recommandée parce qu’il existe deux sites NotI à l’origine d’E. coli et à la partie marqueur de sélection km, respectivement (figure 4B). Si le plasmide assemblé est très grand, un autre site de restriction peut être choisi pour une confirmation supplémentaire. Alternativement, l’écran avec pcr colonie avant de procéder à la digestion de restriction.

5. Application de plasmides multigéniques pour l’expression chromosomique ou plasmide des gènes

  1. Intégration du plasmide multigénique dans le génome de la levure pour l’expression chromosomique des gènes( Figure 5)
    1. Concevoir un ARN guide (ARNg) pour le locus désiré. Il est recommandé d’utiliser plusieurs ressources en ligne, telles que Benchling, CRISPRdirect43et CHOPCHOP44,pour déterminer la spécificité maximale sur la cible.
    2. Cloner le gRNA synthétisé de 20 nt dans le plasmide pCAS45 par clonage Gibson. Linéariser le plasmide pCAS par PCR à l’aide d’une paire d’amorce inversée se liant aux 3' du ribozyme HDV et aux 5' du tracrRNA respectivement (Figure 5). Alternativement, clonez le gRNA dans le plasmide d’abandon de sgRNA (pYTK050) et assemblez le plasmide d’abandon dans un plasmide de cassette avec des linkers. Assemblez ensuite le Cas9 TU avec le plasmide de la partie Cas9 (pYTK036). Enfin, assemblez le Cas9 TU et le SGRNA TU en un plasmide multigénique réplicatif.
    3. Linéariser 5-15 μg de plasmide multigénique intégratif avec 1 μL d’enzyme NotI-HF pendant la nuit. Transformez 1 μg de pCAS-gRNA et le plasmide multigénique intégratif linéarisé en S. cerevisiae. Préparer des cellules compétentes à l’aide d’un kit de transformation de levure disponible dans le commerce ou en suivant le protocole de Geitz et Schiestl, 200746.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de purifier le plasmide multigénique linéarisé après la digestion noti.
    4. Pelleter les cellules après la récupération, jeter le supernatant, laver avec un volume égal d’eau. Plaques de levure cellules sur le milieu synthétique complet (CSM) plaque d’abandon ou l’extrait de levure peptone dextrose moyenne (YPD) plaque avec des antibiotiques, selon le marqueur sélectif de levure. Incuber à 37 °C pendant deux jours pour que les colonies se forment. Dans le cas où aucune colonie n’est observée, incuber pendant un à deux jours supplémentaires à 30°C.
    5. Filtrer les colonies de levures pour l’intégration par la colonie PCR47.
    6. Pour guérir le pCAS, strier la colonie avec l’intégration correcte sur une plaque YPD non sélective. Poussez à 30 °C pendant la nuit. Striez une colonie de la plaque YPD sur une plaque YPD fraîche. Encore une fois, poussez à 30 °C pendant la nuit. Stries d’une colonie de la deuxième plaque YPD à un YPD plus 100 μg/mL nourseothricin, le marqueur de sélection de pCAS. Le durcissement réussi se produit quand les cellules de levure ne se développent pas sur la plaque sélective.
      REMARQUE: Si le plasmide pCAS n’est pas guéri en deux tours de YPD non sélectif, stries à nouveau sur un YPD frais pour un autre 1-2 tours.
  2. Transformation du plasmide multigénique réplicatif pour l’expression plasmide des gènes
    1. Transformer 100 ng-1 μg de plasmide multigénique pur en cellules compétentes S. cerevisiae.
    2. Plaquez les cellules de levure immédiatement après la transformation sur la plaque d’abandon CSM ou YPD plus plaque antibiotique, selon le marqueur de sélection de levure utilisé. Incuber à 30°C pendant 2-3 jours pour que les colonies se forment.

Résultats

Voici les résultats de quatre plasmides multigéniques réplicateurs pour la production de β-carotène (jaune) et de lycopène (rouge). Un plasmide multigénique intégratif pour perturber le locus ADE2 a été construit, dont les colonies sont rouges.

Clonage des CDS dans le vecteur d’entrée (pYTK001)
ERG20 a été amplifié à partir du génome de levure et les trois gènes caroténo?...

Discussion

Le kit de clonage moclo développé par Lee et coll. fournit une excellente ressource pour l’assemblage rapide d’une à cinq unités de transcription dans un plasmide multigénique, soit pour la réplication ou l’intégration dans le génome de la levure. L’utilisation de ce kit élimine le goulot d’étranglement de clonage qui prend beaucoup de temps qui existe fréquemment pour exprimer plusieurs gènes dans la levure.

Nous avons testé cinq conditions différentes pour les cycles ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par la Research Foundation de l’Université d’État de New York (Prix #: 71272) et le Prix IMPACT de l’Université à Buffalo (Prix #: 000077).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm Glass beadsRPI research products9831For lysing yeast cells
Bacto AgarBD & Company214010Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto PeptoneBD& Company211677Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Sa highly efficient version of BsaI restriction enzyme
CarbenicillinFisher Bioreagents4800-94-6Antibiotic for screening at the transcription unit level
ChloramphenicolFisher Bioreagents56-75-7Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsBD & Company291940Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs for PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Sa highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001For yeast transformation
HexanesFisher ChemicalH302-1For carotenoid extraction from yeast cells
KanamycinFisher Bioreagents25389-94-0Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
LycopeneCayman chemicalsNC1142173For lycopene quantification
MoClo YTKAddgene1000000061Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LFor plasmid purification from E.coli
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND2000cFor measuring accurate DNA concentrations
NotI-HFNew England BiolabsR3189SRestriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin SulphateGoldbioN-500-100Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)New England BiolabsB0518SBuffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530SHigh fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494Addgene100539Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz CuvetteThermo Electron10050801For quantifing carotenoids
T4 ligaseNew England BiolabsM0202SLigase for Golden Gate cloning
ThermocyclerBIO-RAD1851148For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue HomogenizerBullet BlenderModel: BBX24For homogenization of yeast cells
UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificGenesys 150For quantifing carotenoids
Yeast ExtractFisher BioreagentsBP1422-500Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-caroteneAlfa AesarAAH6010603For β-carotene quantification

Références

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