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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte, schrittweise Anleitung für die Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit dem modularen Klonsystem auf Basis des Golden Gate Klonens bereitzustellen. Es gibt auch Empfehlungen zu kritischen Schritten, um eine optimale Montage auf der Grundlage unserer Erfahrungen zu gewährleisten.

Zusammenfassung

Die Golden Gate Klonmethode ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Gene in jeder benutzerdefinierten Anordnung. Es verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme, die außerhalb ihrer Erkennungsstellen schneiden und einen kurzen Überhang erzeugen. Dieses modulare Klonsystem (MoClo) verwendet einen hierarchischen Workflow, in dem verschiedene DNA-Teile wie Promotoren, Codierungssequenzen (CDS) und Terminatoren zunächst in einen Eintragsvektor geklont werden. Mehrere Eintragsvektoren werden dann zu Transkriptionseinheiten zusammengesetzt. Mehrere Transkriptionseinheiten verbinden sich dann mit einem Multigen-Plasmid. Die Golden Gate Klonstrategie ist von enormem Vorteil, da sie eine narbenlose, richtungsweisende und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Der hierarchische Workflow ermöglicht in der Regel das einfache Klonen einer Vielzahl von Multigenkonstrukten, ohne dass eine Sequenzierung über Eingabevektoren hinaus erforderlich ist. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinaussetzern ermöglicht ein einfaches visuelles Screening. Diese Arbeit bietet ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden mit dem Hefe-Modul-Klonen (MoClo) Kit. Wir zeigen optimale und suboptimale Ergebnisse der Multi-Gen-Plasmid-Montage und bieten eine Anleitung für das Screening auf Kolonien. Diese Klonstrategie ist hochanwendbar für Hefestoffwechseltechnik und andere Situationen, in denen Multi-Gen-Plasmid-Klonen erforderlich ist.

Einleitung

Synthetische Biologie zielt darauf ab, biologische Systeme mit neuen Funktionalitäten zu entwickeln, die für die pharmazeutische, landwirtschaftliche und chemische Industrie nützlich sind. Die Zusammenstellung einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten auf hochdurchsatzweise ist eine grundlegende Technologie in der synthetischen Biologie. Solch ein komplizierter Prozess kann in mehrere Ebenen mit abnehmender Komplexität zerbrechen, ein Konzept, das aus den grundlegenden Ingenieurwissenschaftenentlehntist 1,2. In der synthetischen Biologie fügen sich DNA-Fragmente in der Regel hierarchisch auf der Grundlage der Funktionalität zusammen: (i) Bauteilebene: "Teile" bezieht sich auf DNA-Fragmente mit einer bestimmten Funktion, wie z. B. einem Promotor, einer Codierungssequenz, einem Terminator, einem Ursprung der Replikation; ii) Transkriptionseinheiten (TU) Ebene: eine TU besteht aus einem Promotor, einer Kodierungssequenz und einem Terminator, der in der Lage ist, ein einzelnes Gen zu transkribieren; (iii) Multigen-Niveau: Ein Multigen-Plasmid enthält mehrere TUs, die häufig aus einem gesamten Stoffwechselweg bestehen. Diese hierarchische Montage, die von der BioBrick-Community entwickelt wurde, ist das grundlegende Konzept für die Montage großer DNAs-Sets in der Synthetischen Biologie3.

In den letzten zehn Jahren4,5,6,7, hat die Golden Gate Klontechnik die hierarchische DNA-Montage erheblich erleichtert2. Viele andere mehrteilige Klonverfahren, wie Gibson Klonen8, ligationsunabhängiges Klonen (SLIC)9, uracil Exzision-basiertes Klonen (USER)10, die Ligase-Cycling-Reaktion (LCR)11und die in vivo-Rekombination (DNA Assembler)12,13, wurden bisher entwickelt. Aber Golden Gate Klonen ist eine ideale DNA-Montagemethode, da es unabhängig von genspezifischen Sequenzen ist und eine narbenlose, gerichtete und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Golden Gate Klonen nutzt Typ IIS-Restriktionsenzyme, die eine nicht-palindromische Sequenz erkennen, um gestaffelte Überhänge außerhalb der Erkennungsstelle2zu erzeugen. Ein Ligase schließt sich dann den geglühten DNA-Fragmenten an, um eine mehrteilige Baugruppe zu erhalten. Die Anwendung dieser Klonstrategie auf das modulare Klonsystem (MoClo) hat die Zusammenstellung von bis zu 10 DNA-Fragmenten mit über 90% transformierten Transformationsmitteln ermöglicht, die das richtig montierte Konstrukt4enthalten.

Das MoClo-System bietet enorme Vorteile, die den Design-Build-Test-Zyklus der synthetischen Biologie beschleunigt haben. Erstens ermöglichen die austauschbaren Teile das kombinatorische Klonen, um einen großen Parameterraum schnell zu testen. Zum Beispiel erfordert die Optimierung eines Stoffwechselwegs in der Regel radfahren durch viele Promotoren für jedes Gen, um den Pfadfluss auszugleichen. Das MoClo-System kann solche anspruchsvollen Klonaufgaben problemlos bewältigen. Zweitens muss man das Teilplasmid sequenzieren, aber in der Regel nicht die TU oder die Multi-Gen-Plasmide. In den meisten Fällen reicht ein Screening nach Kolonie-PCR oder Restriktionsverdauung für die Überprüfung auf TU- und Multigen-Plasmid-Ebene aus. Dies liegt daran, dass das Klonen des Teilplasmids der einzige Schritt ist, der PCR erfordert, was häufig Mutationen einführt. Drittens ist das MoClo-System ideal für den Aufbau von multigenkomplexen Stoffwechselwegen. Schließlich können die Teilplasmide aufgrund der universellen Überhänge wiederverwendet und mit der gesamten Bioengineering-Community geteilt werden. Derzeit sind MoClo Kits für Pflanzen14,15,5,16,17, Pilze6,18,19,20,21,22, Bakterien7,23,24,25,26,27, und Tiere28,29. Eine Multi-Königreich MoClo Plattform wurde auch vor kurzemeingeführt 30.

Für Saccharomyces cerevisiaehaben Lee et al.6 ein vielseitiges MoClo Toolkit entwickelt, eine ausgezeichnete Ressource für die Gemeinschaft der synthetischen Hefebiologie. Dieses Kit ist in einem praktischen 96-Well-Format erhältlich und definiert acht Arten austauschbarer DNA-Teile mit einer vielfältigen Sammlung von gut charakterisierten Promotoren, fluoreszierenden Proteinen, Terminatoren, Peptid-Tags, Selektionsmarkern, Herkunft der Replikation und Genombearbeitungswerkzeugen. Dieses Toolkit ermöglicht die Zusammenstellung von bis zu fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid. Diese Eigenschaften sind wertvoll für Hefe-Stoffwechsel-Engineering, in dem teilweise oder ganze Wege überexprimiert werden, um gezielte Chemikalien zu produzieren. Mit diesem Kit, Forscher haben die Produktion von Geraniol optimiert, Linalool31, Penicillin32, Muconic Säure33, Indigo34, und Betalain35 in Hefe.

Hier stellen wir ein detailliertes, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, das die Verwendung des MoClo-Toolkits zur Erzeugung von Multigen-Signalpfaden für episomale oder genomische Expressionen leitet. Durch den umfangreichen Einsatz dieses Kits haben wir festgestellt, dass die genaue Messung von DNA-Konzentrationen der Schlüssel ist, um die Äquimolarverteilung jedes Teils in der Golden Gate-Reaktion sicherzustellen. Wir empfehlen auch die T4 DNA Ligase über die T7 DNA Ligase, weil erstere besser funktioniert mit einer größeren Anzahl von Überhängen36. Schließlich müssen alle internen Erkennungsstellen von BsmBI und BsaI vor der Montage entfernt oder domestiziert werden. Alternativ kann man erwägen, Teile zu synthetisieren, um mehrere interne Sites zu entfernen und gleichzeitige Codon-Optimierung zu erreichen. Wir zeigen, wie dieses Toolkit verwendet wird, indem wir einen Fünf-Gen-Weg für die β-Carotin- und Lycopinproduktion in S. cerevisiae exemiten. Wir zeigen weiter, wie man den ADE2-Lokus mit den Genom-Editing-Tools aus diesem Kit ausschaltet. Diese farbbasierten Experimente wurden für eine einfache Visualisierung ausgewählt. Wir zeigen auch, wie Fusionsproteine erzeugt und Aminosäuremutationen mit Golden Gate Klonen erzeugt werden.

Protokoll

HINWEIS: Das hierarchische Klonprotokoll, das in diesem Toolkit angeboten wird, kann in drei Hauptschritte unterteilt werden: 1. Klonen von Teilplasmiden; 2. Klontranskriptionseinheiten (TUs); 3. Klonen von Multigenplasmiden (Abbildung 1). Dieses Protokoll beginnt mit dem Primer-Design und endet mit Anwendungen des geklonten Multi-Gen-Plasmids.

1. Primer-Design zum Klonen des Teilplasmids (pYTK001):

  1. Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen mit flankierenden Nukleotiden TTT am 5'-Ende, einer BsmBI-Erkennungsstelle mit einem zusätzlichen Nukleotid (CGTCTCN), einem 4-Nukleotiden(nt) Überhang (TCGG), der den des Eintragsvektors ergänzt, eine BsaI-Erkennungssite mit einem zusätzlichen Nukleotid (GGTCTCN) und einem 4-nt-teilspezifischen Überhang zusätzlich zur vorlagenspezifischen Sequenz (Abbildung 2A). GoldenBraid 4.037 und GoldenMutagenesis38 sind einige der Online-Software, die für Golden Gate spezifische Primer Design verwendet werden kann.
  2. Wenn BsaI- oder BsmBI-Erkennungssites in einem Teil vorhanden sind, verwenden Sie einen Domestizierungsschritt, um diese Standorte vor der Golden Gate-Baugruppe39zu mutieren. Für integrative Plasmide (siehe Schritt 4) domestizieren Sie jede NotI-Erkennungsstelle. Um ein Teil mit einem unerwünschten Erkennungsplatz zu domestizieren, teilen Sie das Teil in zwei Unterteile in der Nähe der unerwünschten Stelle auf (Abbildung 2A):
    1. Entwerfen Sie die Vorwärtsgrundierung des ersten Teils auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.1. entwerfen Sie jedoch die umgekehrte Grundierung mit der BsmBI-Site und einem 4-nt-genspezifischen Überhang.
    2. Entwerfen Sie den zweiten Teil-Vorwärts-Primer mit der BsmBI-Site und dem 4-nt-genspezifischen Überhang nur, der sich mit der umgekehrten Grundierung des ersten Teils überlappt. Entwerfen Sie die Umgekehrte Grundierung des zweiten Teilteils auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.1.
    3. Führen Sie die gewünschte Mutation(en) entweder in der umgekehrten (für Schritt 1.2.1) oder vorwärts primer (Schritt 1.2.2) in der genspezifischen Region des Primers ein.
      HINWEIS: Alternativ kann ein BsmBI- und BsaI-freies und codonoptimiertes Teil kommerziell synthetisiert werden. Für die Codierung von Sequenzen (CDS) kann eine synonyme Mutation leicht am dritten Nukleotid eines Aminosäure-Codons eingebaut werden. Für Promoter und Terminatoren wird jedoch empfohlen, die mutierte Promoter- oder Terminatoraktivität mit einem Reporter-Assay zu überprüfen39. Wenn es eine unerwünschte Einschränkungsstelle gegen Ende der Sequenz gibt, kann sie mit einem längeren Reverse Primer mutiert werden. Wenn mehrere unerwünschte Standorte vorhanden sind, kann eine standortgesteuerte Mutagenese durchgeführt werden, die eine mutation mehrerer Standorte ermöglicht40.
  3. Gelegentlich ist es wünschenswert, zwei Proteine als ein einzelnes Teil mit einem Linker dazwischen zu verschmelzen (Abbildung 2A). Der Linker trägt dazu bei, die strukturelle Integrität der beiden einzelnen Proteine zu gewährleisten41.
    1. Die Vorwärtsgrundierung für das erste Gen ist die gleiche wie in Schritt 1.1. In der umgekehrten Grundierung sind eine BsmBI-Site, ein 4-nt-genspezifischer Überhang und eine Linkersequenz enthalten. Der 4-nt-Überhang kann entweder die ersten Nukleotide des Linkers oder des zweiten Gens sein.
    2. Für das zweite Gen entwerfen Sie die Vorwärtsgrundierung so, dass sie eine BsmBI-Erkennungsstelle und einen 4-nt-Überhang hat, der den des Umgekehrten Primers des ersten Gens ergänzt. Entwerfen Sie die Umgekehrte Grundierung des zweiten Gens wie in Schritt 1.1.
  4. Um die Teile durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)42zu verstärken, verwenden Sie eine hochtreue DNA-Polymerase, um die Teile entweder aus einer genomischen DNA, einer cDNA oder einem Plasmid zu verstärken. Überprüfen Sie das PCR-Produkt auf einem 1% Agarose-Gel gefolgt von Gel-Reinigung. Die Verwendung von gereinigter DNA wird dringend empfohlen, wenn die Gelreinigung mühsam ist, verwenden Sie mindestens eine Spin-Säule, um das PCR-Produkt zu reinigen.

2. Klonen von Teilen in den Eintragsvektor (pYTK001), um Teilplasmide zu erstellen (Abbildung 2B)

  1. Um den Golden Gate-Reaktionsmix einzurichten, fügen Sie 20 Fmol jedes PCR-Produkts und den Eintragsvektor (pYTK001), 1 l 10X T4 Ligase-Puffer, 0,5 l Esp3I (ein hocheffizientes Isoschizomer von BsmBI) und 0,5 l T4-Ligase hinzu. Fügen Sie ddH2O hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 L zu erhöhen.
  2. Um die Klonreaktion einzurichten, führen Sie folgendes Programm in einem Thermocycler durch: 25-35 Zyklen von 37 °C für 5 min (Verdauung) und 16 °C für 5 min (Ligation), gefolgt von einer abschließenden Verdauung bei 50 °C für 10 min und Enzyminaktivierung bei 80 °C für 10 min.
    HINWEIS: Beim gleichzeitigen Klonen mehrerer DNA-Stücke in den Eintrittsvektor werden 35 Zyklen der Verdauung/Ligation empfohlen, z. B. beim Klonen von Fusionsgenen oder beim Domestizieren eines Gens.
  3. Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix durch Hitzeschock in den DH5-Stamm oder gleichwertige escherichia coli chemisch kompetente Zellen. Es wird empfohlen, das gesamte geklonte Produkt von 10 l in 35 l chemisch kompetente E. coli-Zellen (2 X 105 cfu/ml, cfu wird aus der Umwandlung von 5 ng pYTK001 in 100 l der zuständigen Zellen) umzuwandeln. Auf einer Lysogeny-Broth-Platte (LB) mit 35 g/ml Chloramphenicol (Cm) verteilen. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
  4. Nach 16-18 h die Platte aus dem Inkubator nehmen und die Platte bei 4 °C ca. 5 h halten, um den Superordner grünes fluoreszierendes Protein (sfGFP) für eine intensivere grüne Farbe entwickeln zu lassen.
  5. Zur einfacheren Abschirmung legen Sie die Platte auf einen ultravioletten (UV) oder einen Blaulichttransilluminator. Die sfGFP enthält Kolonien wird unter dem UV-Licht fluoreszieren.
  6. Die grünen Kolonien sind negativ, weil sie die ungeschnittene pYTK001 enthalten. Die weißen Kolonien sind wahrscheinlich positiv. Das Klonen ist in der Regel erfolgreich, wenn es 30-100% weiße Kolonien gibt. Führen Sie ein weiteres Screening von einigen weißen Kolonien durch Kolonie PCR oder Einschränkung Verdauungen (vorgeschlagenes Enzym: BsaI-HFv2).
  7. Reinigen Sie Plasmide aus einigen der potenziell korrekten Kolonien und bestätigen Sie die Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung.

3. Zusammenstellung von Teilplasmiden zu "Kassetten"-Plasmiden

HINWEIS: Ein Kassettenplasmid enthält eine benutzerdefinierte Transkriptionseinheit (TU), die aus einem Promotor, einem CDS und einem Terminator besteht. Ein Kassettenplasmid ermöglicht die Expression eines einzelnen Gens. Wenn die Kassettenplasmide zu einem Multi-Gen-Plasmid zusammengesetzt werden, dann ist der erste Schritt, die Anzahl und die Reihenfolge der TUs im Multi-Gen-Plasmid zu bestimmen. Diese bestimmen, welche Steckverbinder in den Kassettenplasmiden verwendet werden sollen, da Steckverbinder TUs im Multigen-Plasmid verbinden. Der linke Stecker der ersten TU sollte ConLS sein, und der rechte Stecker der letzten TU sollte ConRE sein. Sie überschneiden sich mit ConLS' und ConRE' von Multi-Gen-Plasmiden. Der Rest der Steckverbinder sollte in der zunehmenden numerischen Reihenfolge sein. Wenn das Multigen-Plasmid beispielsweise vier TUs enthält, wären die Steckverbinderkombinationen ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 und ConL3-TU4-ConRE (Abbildung 1).

  1. Vor der Montage von Transkriptionseinheiten wird die Montage eines Zwischenvektors mit den folgenden sechs Teilen empfohlen: der linke Stecker, der sfGFP-Aussetzer (pYTK047), der rechte Stecker, ein Hefeauswahlmarker, ein Hefeursprung der Replikation und das Teilplasmid mit einem mRFP1, ein E. coli-Ursprung und das ampicillinresistente Gen (pYTK083) (Abbildung 3).
    1. Reinigen Sie die oben genannten sechs Plasmide. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer oder einem fluoreszenzbasierten Assay auf und verdünnen Sie jedes Plasmid mit ddH2O, so dass 1 l 20 Fmol DNA enthält. Berechnen Sie die DNA-Molar-Konzentration mit einem Online-Rechner.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die DNA-Konzentrationen genau zu messen und präzise zu pipetieren, damit die Baugruppe funktioniert, insbesondere für Baugruppen mit fünf- bis siebenteiligen Plasmiden. Kleine Fehler in der DNA-Konzentration jedes Plasmids können zu einer signifikanten Abnahme der Kloneffizienz führen.
    2. Fügen Sie 1 l von jedem Plasmid, 1 l 10X T4 Ligase Puffer, 0,5 l BsaI-HFv2 (eine hocheffiziente Version von BsaI) und 0,5 l T4 Ligase hinzu. Machen Sie das Volumen auf 10 l, indem Sie ddH2O hinzufügen.
    3. Um die Klonreaktion einzurichten, führen Sie im Thermocycler folgendes Programm aus: 25-35 Zyklen von 37 °C für 5 min (Verdauung) und 16 °C für 5 min (Ligation). Lassen Sie die letzten Verdauungs- und Wärmeinaktivierungsschritte aus, da die BsaI-Standorte im Zwischenvektor beibehalten werden müssen (Abbildung 3).
    4. Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix in den DH5-Stamm oder andere E. coli-kompetente Zellen. Auf einer LB-Platte mit 50 g/ml Carbenicillin (Cb) oder Ampicillin verteilen. Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Carbenicillin ist ein stabiles Analogon von Ampicillin.
    5. Nach 16-18 h die Platte aus dem Inkubator nehmen. Die Platte wird sowohl blassrote als auch hellgrüne Kolonien enthalten (Abbildungen 6C und 6D). Halten Sie die Platte bei 4 °C für ca. 5 h, um die mRFP1 und sfGFP reifen zu lassen. Verwenden Sie einen UV- oder einen Blaulichttransilluminator, um die grünen Kolonien zu identifizieren, die den potenziell korrekten Zwischenvektor enthalten.
    6. Die grünen Kolonien auf einer LB + Cb-Platte ausstreifen und über Nacht bei 37 °C bebrüten. Am nächsten Tag wieder auf einer LB + Cm Platte ausstreifen und über Nacht bei 37 °C brüten. Die Kolonien, die auf LB + Cm-Platten wachsen, enthalten falsch zusammengesetzte Plasmide, da Cm-resistente Teilevektoren erhalten bleiben.
    7. Wählen Sie die Kolonien, die nicht auf der LB + Cm Platte wachsen und führen Einschränkung Verdauungen (empfohlene Enzyme: BsaI-HFv2, Esp3I), um das richtig zusammengesetzte Plasmid zu bestätigen. Alternativ können Sie Kolonie-PCR zum Screening verwenden.
  2. Nachdem der Zwischenvektor erfolgreich montiert wurde, besteht der nächste Schritt darin, Transkriptionseinheiten zusammenzustellen. Dies ist eine 4-teilige Baugruppe mit den folgenden Teilen: dem Zwischenvektor, einem Promotor, einem CDS und einem Terminator.
    1. Reinigen Sie die vier teiligen Plasmide. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen auf und verdünnen Sie jedes Plasmid so, dass 1 L 20 Fmol DNA hat.
    2. Um den Reaktionsmix einzurichten, folgen Sie Schritt 3.1.2.
    3. Um die Klonreaktion einzurichten, folgen Sie Schritt 2.2.
    4. Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in die DH5- oder gleichwertige E. coli-fähigen Zellen und Platten auf LB + Cb. Inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht.
    5. Nach 16-18 h die Platte aus dem Inkubator nehmen. Weiße und hellgrüne Kolonien erscheinen (Abbildungen 6E und 6F). Halten Sie die Platte bei 4 °C für ca. 5 h, um die sfGFP reifen zu lassen. Verwenden Sie einen UV- oder einen Blaulichttransilluminator, um die nicht fluoreszierenden weißen Kolonien zu identifizieren. Diese enthalten die potenziell korrekten Transkriptionseinheiten.
    6. Streifen Sie aus und wachsen 8-10 weiße Kolonien und führen Sie eine Kolonie PCR. Reinigen Sie Plasmide aus den Kolonien, die positiv aus koloniePCR testen. Durchführung der Restriktionsverdauung (vorgeschlagenes Enzym: Esp3I), um die Montage weiter zu bestätigen.
      HINWEIS: Die Sequenzierung von Transkriptionseinheiten ist in der Regel nicht erforderlich, da das Klonen nur die Einschränkungderdung und Ligation umfasst. Alle Sequenzen von Interesse wurden auf der Ebene des Teils Plasmid bestätigt.

4. Zusammenstellung von Kassettenplasmiden zu "Multigen"-Plasmiden:

HINWEIS: Multi-Gen-Plasmide ermöglichen die Expression von mehr als einem Gen. Je nach nachgeschalteter Anwendung könnten Multigenplasmide replizierend oder integrativ sein. Replicative Plasmide haben den Hefeursprung der Replikation; Daher kann es stabil beibehalten werden, wenn Hefezelle teilt. Integrative Plasmide haben nicht den Hefeursprung der Replikation. Stattdessen haben sie 5' und 3' Homologiearme, die die Integration mehrerer Gene in spezifische Loci des Genoms durch homologe Rekombination ermöglichen.

  1. Für Multi-Gen-Plasmide, montieren Sie zuerst einen Zwischenvektor.
    1. Um replizierende Zwischenvektoren (Abbildung 4A) zu montieren, montieren Sie die folgenden sechs Teile: den linken Stecker (ConLS'-pYTK008), den sfGFP-Aussetzer (pYTK047), den rechten Stecker (ConRE'-pYTK072), einen Hefe-Auswahlmarker, ein Hefeursprung der Replikation und das Teilplasmid mit mRFP1, ein E. coli-Ursprung der Replikation und das Kanamycin-resistente Gen (pYTK084).
      1. Befolgen Sie für die Montage die Schritte von 3.1.1 bis 3.1.3.
      2. Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in DH5- oder gleichwertige E. coli-fähige Zellen und Platte auf LB plus 50 g/ml Kanamycin (Km). Bei 37 °C über Nacht inkubieren.
      3. Befolgen Sie für das rot/grüne farbbasierte Screening Schritt 3.1.5.
      4. Zum Abschirmen von Fehlbaugruppen streifen und wachsen die grünen Kolonien auf einer LB + Km Platte. Folgen Sie dann Schritt 3.1.6.
    2. Für integrative Multigenvektoren (Abbildung 4B) bestimmen Sie zunächst den genomischen Ort, der von Interesse ist, und entwerfen Sie dann etwa 500 Basenpaare von 5' und 3' Homologiearmen für die Integration in diesen Ort.
      1. Klonen Sie die 5' und 3' Homologiearme aus Hefegenom-DNA in den Eintrag syTK001. Befolgen Sie die Schritte 1 und 2.
      2. Montieren Sie die folgenden sieben Plasmide: den linken Stecker (ConLS'-pYTK008), den sfGFP-Aussetzer (pYTK047), den rechten Stecker (ConRE'-pYTK072), einen Hefeauswahlmarker, der 3' Homologiearm, das Teilplasmid mit mRFP1, e. coli Ursprung der Replikation, und das Kanamycin-resistente Gen (pYTK090) und der 5' Homologiearm.
      3. Be-Und-Abgleich: Schritt 4.1.1.
  2. Montage des Multigenplasmids
    1. Reinigen Sie Plasmide des in Schritt 4.1 erhaltenen Zwischenvektors und der Kassettenplasmide ab Schritt 3. Zeichnen Sie ihre Konzentrationen mit einem UV-Vis-Spektrophotometer oder einem fluoreszenzbasierten Assay auf. Verdünnen Sie jeweils in ddH2O, so dass 1 l 20 Fmol-DNA hat.
    2. Fügen Sie 1 l Zwischenvektor, 1 l jeder Transkriptionseinheit, 1 l 10x T4-Ligasepuffer, 0,5 l Esp3I und 0,5 l T4-Ligase hinzu. Bringen Sie das Volumen auf 10 L mit ddH2O.
    3. Um die Klonreaktion einzurichten, folgen Sie Schritt 2.2.
    4. Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in DH5- oder gleichwertige E. coli-fähige Zellen und Platte auf LB + Km. Inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht.
    5. Führen Sie das Grün-Weiß-Screening wie in Schritt 3.2.5 durch.
    6. Reinigen Sie Plasmide aus ein paar weißen Kolonien und führen Einschränkung Verdauungen. Die Verwendung des NotI-HF-Enzyms wird empfohlen, da es zwei NotI-Standorte am E. coli-Ursprung bzw. km-Selektionsmarkerteil gibt (Abbildung 4B). Wenn das zusammengesetzte Plasmid sehr groß ist, kann eine weitere Restriktionsstelle zur weiteren Bestätigung ausgewählt werden. Alternativ, Bildschirm mit Kolonie PCR, bevor Sie zur Einschränkung der Verdauung.

5. Anwendung von Multigenplasmiden für chromosomale oder plasmidbasierte Genexpression

  1. Integration von Multigenplasmid in das Hefegenom zur chromosomalen Genexpression (Abbildung 5)
    1. Entwerfen Sie eine Führungs-RNA (gRNA) für den gewünschten Ort. Die Verwendung mehrerer Onlineressourcen, z. B. Benchling, CRISPRdirect43und CHOPCHOP44, wird empfohlen, um die maximale Spezifität des Ziels zu bestimmen.
    2. Klonen Sie die synthetisierte 20-nt gRNA durch Klonen von Gibson in das pCAS-Plasmid45. Linearisieren Sie das pCAS-Plasmid durch PCR unter Verwendung eines umgekehrten Primer-Paares, das an das 3' des HDV-Ribozym bzw. die 5' der tracrRNA bindet (Abbildung 5). Alternativ klonen Sie die gRNA in das sgRNA-Dropout-Plasmid (pYTK050) und montieren Sie das Dropout-Plasmid mit Linkern zu einem Kassettenplasmid. Dann montieren Sie die Cas9 TU mit dem Cas9-Teilplasmid (pYTK036). Schließlich montieren Sie die Cas9 TU und die sgRNA TU zu einem replizierenden Multigenplasmid.
    3. Linearisieren Sie über Nacht 5-15 g integratives Multigen-Plasmid mit 1 L NotI-HF-Enzym. Transformieren Sie 1 g pCAS-gRNA und das linearisierte integrative Multigenplasmid in S. cerevisiae. Bereiten Sie kompetente Zellen entweder mit einem handelsüblichen Hefetransformationskit oder nach dem Protokoll von Geitz und Schiestl, 200746vor.
      HINWEIS: Es ist unnötig, das linearisierte Multigenplasmid nach der NotI-Verdauung zu reinigen.
    4. Pellet die Zellen nach der Erholung, entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie mit einem gleichen Volumen von Wasser. Plattenhefezellen auf der kompletten synthetischen Medium (CSM) Aussetzerplatte oder die Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD)-Platte mit Antibiotika, abhängig vom selektiven Hefemarker. Bei 37 °C zwei Tage lang inkubieren, damit sich Kolonien bilden können. Falls keine Kolonie beobachtet wird, brüten Sie für weitere ein bis zwei Tage bei 30°C.
    5. Bildschirm HefeKolonien für die Integration durch Kolonie PCR47.
    6. Um das pCAS zu heilen, streifen Sie die Kolonie mit der richtigen Integration auf eine nicht-selektive YPD-Platte aus. Wachsen Sie bei 30 °C über Nacht. Streichen Sie eine Kolonie von der YPD-Platte auf eine frische YPD-Platte. Wieder wachsen bei 30 °C über Nacht. Streichen Sie eine Kolonie von der zweiten YPD-Platte auf eine YPD plus 100 g/ml Nourseothricin, den Selektionsmarker von pCAS. Eine erfolgreiche Aushärtung erfolgt, wenn Hefezellen nicht auf der selektiven Platte wachsen.
      HINWEIS: Wenn das pCAS-Plasmid nicht in zwei Runden nicht-selektiver YPD ausgehärtet wird, streifen Sie für weitere 1-2 Runden erneut auf eine frische YPD.
  2. Transformierung des replizierenden Multigenplasmids für die Plasmid-basierte Genexpression
    1. Verwandeln Sie 100 ng-1 g reines Multigen-Plasmid in S. cerevisiae kompetente Zellen.
    2. Plattenhefezellen unmittelbar nach der Umwandlung auf die CSM-Aussetzerplatte oder YPD plus Antibiotikaplatte, abhängig von der verwendeten Hefeauswahlmarker. Bei 30°C für 2-3 Tage inkubieren, damit sich Kolonien bilden können.

Ergebnisse

Hier die Ergebnisse von vier replizierenden Multigenplasmiden zur β-Carotin (gelb) und Lycopin (rot). Es wurde ein integratives Multigen-Plasmid zur Störung des ADE2-Lokus konstruiert, dessen Kolonien rot sind.

Klonen von CDS in den Eintragsvektor (pYTK001)
ERG20 wurde aus dem Hefegenom und den drei Carotinoidgenen crtE, crtYB, crtI aus dem Plasmid pLM494

Diskussion

Das von Lee et al. entwickelte MoClo-basierte Klonkit bietet eine hervorragende Ressource für die schnelle Montage von ein bis fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid, entweder für die Replikation oder Integration in das Hefegenom. Die Verwendung dieses Kits eliminiert den zeitaufwändigen Klonengpass, der häufig für die Exklamierung mehrerer Gene in Hefe besteht.

Wir haben fünf verschiedene Bedingungen für die Verdauungs-/Ligationszyklen des Golden Gate Klonens mit T4 DNA...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Research Foundation for the State University of New York (Preis Nr. 71272) und dem IMPACT Award der University at Buffalo (Preis Nr.: 000077) finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mm Glass beadsRPI research products9831For lysing yeast cells
Bacto AgarBD & Company214010Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto PeptoneBD& Company211677Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Sa highly efficient version of BsaI restriction enzyme
CarbenicillinFisher Bioreagents4800-94-6Antibiotic for screening at the transcription unit level
ChloramphenicolFisher Bioreagents56-75-7Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsBD & Company291940Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs for PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Sa highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001For yeast transformation
HexanesFisher ChemicalH302-1For carotenoid extraction from yeast cells
KanamycinFisher Bioreagents25389-94-0Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
LycopeneCayman chemicalsNC1142173For lycopene quantification
MoClo YTKAddgene1000000061Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LFor plasmid purification from E.coli
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND2000cFor measuring accurate DNA concentrations
NotI-HFNew England BiolabsR3189SRestriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin SulphateGoldbioN-500-100Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)New England BiolabsB0518SBuffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530SHigh fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494Addgene100539Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz CuvetteThermo Electron10050801For quantifing carotenoids
T4 ligaseNew England BiolabsM0202SLigase for Golden Gate cloning
ThermocyclerBIO-RAD1851148For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue HomogenizerBullet BlenderModel: BBX24For homogenization of yeast cells
UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificGenesys 150For quantifing carotenoids
Yeast ExtractFisher BioreagentsBP1422-500Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-caroteneAlfa AesarAAH6010603For β-carotene quantification

Referenzen

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