使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装

摘要

该协议的目标是提供一个详细的，分步指南，以组装多基因结构使用模块化克隆系统的基础上，金门克隆。它还根据我们的经验就确保最佳装配的关键步骤提出了建议。

摘要

金门克隆法使多个基因在任何用户定义的排列中能够快速组装。它使用 IIS 型限制酶，这些酶在识别站点之外切开，并创建短悬架。此模块化克隆 （MoClo） 系统使用分层工作流，其中不同 DNA 部分（如发起器、编码序列 （CDS） 和终结者）首先被克隆到条目载体中。然后，多个入口载体组装成转录单元。几个转录单元然后连接到多基因质粒。金门克隆战略具有巨大的优势，因为它允许无疤痕、定向和模块化组装在一锅反应中。分层工作流通常能够对多种多基因构造进行传真克隆，无需在进入载体之外进行测序。荧光蛋白的使用使视觉筛查变得简单。这项工作提供了一个详细的，分步协议，使用酵母模块化克隆（MoClo）套件组装多基因质粒。我们展示了多基因质粒组装的最佳和次优结果，并为菌落的筛选提供了指南。这种克隆策略非常适用于酵母代谢工程和其他需要多基因质粒克隆的情况。

引言

合成生物学旨在设计具有对制药、农业和化学工业有用的新功能的生物系统。以高通量方式组装大量DNA片段是合成生物学的基础技术。这样一个复杂的过程可以分解成多个层次，降低复杂性，一个概念借用的基础工程科学^1，2。在合成生物学中，DNA片段通常根据功能分层组装:（一） 部分级别:"部分"是指具有特定功能的 DNA 片段，如发起人、编码序列、终结者、复制来源:（二） 转录单位（TU）水平:TU由发起人、编码序列和能够转录单个基因的终结者组成:（三） 多基因水平:多基因质粒包含多个 TUs，通常由整个代谢通路组成。这种由BioBrick社区开创的分层组装是合成生物学³中大型DNAs组装的基础概念。

在过去的^十年里，金门克隆技术极大地促进了分层DNA组装^2。许多其他多部分克隆方法，如吉布森克隆^8，结扎独立克隆（SLIC）9，尿素切除为基础的克隆（用户^）10，韧带循环反应（LCR）11，并在体内重组（DNA组装^{）12，13，}也已开发至今。但金门克隆是一种理想的DNA组装方法，因为它独立于基因特异性序列，允许无疤痕、定向和模块化组装在单锅反应中。金门克隆利用IIS型限制酶，识别非单体序列，在识别站点²外产生交错悬垂。然后，一个韧带加入退化的DNA片段，以获得一个多部分的组装。将这种克隆策略应用于模块化克隆（MoClo）系统，使多达10个DNA片段得以组装，90%以上的转化器被筛选出含有正确组装的构造^4。

MoClo 系统提供了巨大的优势，加速了合成生物学的设计构建测试周期。首先，可互换部件使组合克隆能够快速测试大量的参数空间。例如，优化代谢通路通常需要循环通过每个基因的许多促进器来平衡通路通量。MoClo 系统可以轻松地处理如此苛刻的克隆任务。其次，需要对部分质粒进行排序，但通常不是TU或多基因质粒。在大多数情况下，通过菌落 PCR 或限制消化进行筛查足以在 TU 和多基因质粒水平上进行验证。这是因为克隆部分质粒是唯一需要PCR的步骤，它经常引入突变。第三，MoClo系统是构建多基因复杂代谢通路的理想之选。最后，由于普遍悬垂，部分质粒可以重复使用，并与整个生物工程社区共享。目前，MoClo套件可用于植物14，15，5，16，17，真菌6，18，19，20，21，22，细菌7，23，24，25，26，27和动物28，29。一个多王国的MoClo平台也于^最近30日推出。

对于糖精，李等人^已经开发出一种多才多艺的MoClo工具包，这是酵母合成生物学界的极好资源。该套件采用方便的 96 井格式，定义了八种类型的可互换 DNA 部件，包括各种功能良好的促进剂、荧光蛋白、终结者、肽标签、选择标记、复制源和基因组编辑工具。此工具包允许将多达 5 个转录单元组装成多基因质粒。这些功能对于酵母代谢工程很有价值，在酵母代谢工程中，部分或整个途径被过度表达以产生有针对性的化学物质。利用这个工具包，研究人员优化了杰拉尼奥尔、利纳洛尔^31、青霉素^32、粘液酸^33、蓝蓝³⁴和酵母β35的生产。

在这里，我们提供详细的分步协议，以指导使用 MoClo 工具包生成表皮或基因组表达的多基因通路。通过广泛使用这个工具包，我们发现，DNA浓度的准确测量是确保金门反应中每个部分的等价分布的关键。我们还建议T4DNA韧带超过T7DNA韧带，因为前者更好地工作与更多的悬垂^36。最后，BsmBI 和 BsaI 的任何内部识别站点必须在组装前删除或驯化。或者，可以考虑合成部件以删除多个内部站点，并实现同步的 codon 优化。我们演示了如何使用这个工具包，表达一个五基因通路，用于β胡萝卜素和番茄红素生产在 塞雷维西亚。 我们进一步展示如何使用本套件中的基因组编辑工具敲除 ADE2 轨迹。这些基于颜色的实验被选为易于可视化的实验。我们还演示了如何产生融合蛋白，并利用金门克隆产生氨基酸突变。

研究方案

注:本工具包中提供的分层克隆协议可分为三个主要步骤:1. 克隆部分质粒:2. 克隆转录单位（TUs）:3. 克隆多基因质粒（图1）。此协议从入门设计开始，以克隆多基因质粒的应用结束。

1. 克隆部分质粒（pYTK001） 的引金设计:

1. 设计包含侧翼核苷酸 TTT 的前进和反向底漆，这是一个具有额外核苷酸 （CGTCTCN） 的 BsmBI 识别站点，一个 4 核苷酸 （nt） 悬垂 （TCGG） 与入口载体的重叠 （TCGG） 相补充， BsaI 识别站点具有额外的核苷酸 （GGTCTCN） 和 4 nt 部分特定悬架，此外还有模板特定序列（图 2A）。金布拉德 4.0³⁷ 和金图尼西^{斯 38} 是一些在线软件， 可用于金门特定的引言设计。
2. 如果 BsaI 或 BsmBI 识别站点存在任何部分，请在金门大会³⁹之前使用驯化步骤改变这些站点。对于集成质粒（参见第 4 步），驯化任何 NotI 识别站点。将一部分与一个不良识别站点驯化，将该部分分成两个子部分，靠近不良网站（图2A）:
   1. 以与步骤 1.1 相同的方式设计第一个子部分的前进引金。但设计反向引座与BsmBI网站和4nt基因特异性悬垂只。
   2. 设计第二个子部分前向引座与 BsmBI 站点和 4 nt 基因特异性悬垂只有重叠与第一个子部分的反向引引号。以与步骤 1.1 相同的方式设计第二个子部分的反向引号。
   3. 在引号的基因特定区域，在反向（第 1.2.1 步）或前向引金（步骤 1.2.2）中引入所需的突变。
      注:或者，BsmBI 和 BsaI 无和科顿优化部分可以进行商业合成。对于编码序列（CDS），同义突变可以很容易地结合在氨基酸科顿的第三核苷酸。然而，对于发起人和终结者^{，建议使用}记者分析检查变异的发起人或终结者活动。如果序列末尾有不良限制站点，则可以使用较长的反向引物进行变异。如果存在多个不良网站，则允许突变多个站点的站点定向突变可能会执行⁴⁰个。
3. 偶尔，将两种蛋白质与中间的链接器融合为单个部分是可取的（图2A）。该链接器有助于确保两种单个蛋白质⁴¹的结构完整性。
   1. 第一个基因的前引因与步骤 1.1 相同。在反向引座中，包括 BsmBI 站点、4 nt 基因特异性悬垂和链接器序列。4 nt悬垂可以是链接器或第二基因的前几个核苷酸。
   2. 对于第二个基因，设计前引因，使其具有 BsmBI 识别位点和 4 nt 悬垂补充第一个基因的反向引因。将第二个基因的反向引引器设计为步骤 1.1。
4. 要通过聚合酶链反应 （PCR）⁴²放大部件，请使用高保真脱氧核糖核酸聚合酶放大基因组脱氧核糖核酸、cDNA 或质粒中的部件。在 1% 的蔗糖凝胶上检查 PCR 产品，然后进行凝胶净化。强烈建议使用纯化脱氧核糖核酸，如果凝胶纯化是费力的，至少使用旋转柱来净化PCR产品。

2. 将零件克隆到进入载体 （pYTK001） 以创建部分质粒 （图 2B）

1. 要设置金门反应组合，添加每个 PCR 产品和入口矢量 （pYTK001） 的 20 fmol、10X T4 韧带缓冲器的 1μL、Esp3I 的 0.5μL（BsmBI 的高效异构体）和 0.5μL 的 T4 韧带。添加ddH₂O，使总容量达到10μL。
2. 要建立克隆反应，请在恒温器中运行以下程序:25-35 个周期，37 °C，持续 5 分钟（消化）和 16 °C 5 分钟（液化），然后在 50 °C 进行最终消化 10 分钟，酶在 80 °C 下灭活 10 分钟。
   注:当将多个DNA片段同时克隆到进入载体时，例如在克隆融合基因或驯化基因期间，建议进行35个周期的消化/配结。
3. 通过热冲击将整个反应混合物转化为DH5+菌株或等效 的大肠杆菌 化学能力细胞。建议将整个 10 μL 克隆产品转换为 35 μL 化学能力 大肠杆菌 细胞（2 X 10⁵ cfu/mL，从将 5 ng pYTK001 转换为主管细胞的 100 μL 计算 cfu）。铺在溶酶体汤 （LB） 板上，含有 35 微克/毫升氯霉素 （Cm）。在37°C的夜间孵化。
4. 16-18小时后，将盘子从孵化器中取出，并将板保持在4°C约5小时，让超级文件夹绿色荧光蛋白（sfGFP）发展为更强烈的绿色。
5. 为了便于筛选，将板放在紫外线 （UV） 或蓝光透光器上。含有菌落的sfGFP会在紫外线下荧光。
6. 绿色殖民地是负面的，因为它们包含未切割的 pYTK001。白人殖民地可能是积极的。克隆通常是成功的，如果有约30-100%的白色殖民地。通过菌落 PCR 或限制消化（建议酶:BsaI-HFv2）对几个白色菌落进行进一步筛查。
7. 从几个可能正确的殖民地净化斑块，并通过桑格测序确认序列。

3. 将部分质粒组装成"盒式"质粒

注:盒式质粒包含用户定义的转录单元 （TU），由发起人、CDS 和终结者组成。盒式质粒允许单个基因的表达。如果盒式质粒将组装成多基因质粒，那么第一步是确定多基因质粒中 TUs 的数量和顺序。这些将决定在盒式质粒中使用哪些连接器，因为连接器链接多基因质粒中的 TUs。第一个 TU 的左连接器应该是 ConLS，最后一个 TU 的右连接器应该是 ConRE 。它们将与康尔斯和康雷的多基因质粒重叠。其余的连接器应处于不断增加的数字顺序中。例如，如果多基因质粒包含四个 TUs，则连接器组合为康尔斯-TU1-ConR1、康尔1-TU2-康瑞尔 2、康尔2-TU3-康瑞和康尔3-TU4-ConRE（图 1）。

1. 在组装转录单元之前，建议使用以下六个部分组装中间载体:左连接器、sfGFP 辍学 （pYTK047）、右连接器、酵母选择标记、复制酵母源和具有mRFP1、大肠杆菌原产地和抗双霉素基因 （pYTK083） （图 3）的部分质粒。
   1. 净化上述六个质粒。使用紫外线-维斯光谱仪或荧光测定记录其浓度，并用ddH₂O稀释每个质粒，使1μL具有20毫升的DNA。使用在线计算器计算DNA摩尔浓度。
      注:准确测量DNA浓度并精确输送以使组件工作非常重要，尤其是对于具有五到七个部分质粒的组件。每个质粒的DNA浓度小错误可导致克隆效率显著降低。
   2. 添加每个质粒的 1μL、1 μL 的 10X T4 韧带缓冲器、0.5 μL 的 BsaI-HFv2（BsaI 的高效版本）和 0.5 μL 的 T4 韧带。通过添加ddH₂O将音量放大到10μL。
   3. 要设置克隆反应，请在恒温器中运行以下程序:25-35 个周期，37 °C，持续 5 分钟（消化），16 °C 5 分钟（液化）。省略最终的消化和热灭活步骤，因为 BsaI 站点需要保留在中间矢量（图 3）中。
   4. 将整个反应组合转换为DH5+菌株或其他大 肠杆菌 能力细胞。铺在 LB 板上，含 50 微克/毫升苯甲酸素 （Cb） 或安比西林。在37°C的夜间孵化。
      注:卡本西林是安培林的一个稳定的模拟。
   5. 16-18小时后，将盘子从孵化器中取出。该板块将包含淡红色和淡绿色殖民地（图6C和6D）。将板保持在4°C约5小时，让mRFP1和sfGFP成熟。使用紫外线或蓝光透光器识别绿色殖民地，其中包含可能正确的中间载体。
   6. 在LB+Cb板上划出绿色殖民地，并在37°C的夜间孵化。第二天，在LB+Cm板上再次出现，并在37°C的夜间孵化。生长在LB+Cm板上的菌落含有组装不当的质粒，因为保留了抗Cm部分载体。
   7. 选择在LB +Cm板上不生长的菌落，并进行限制消化（建议酶:BsaI-HFv2，Esp3I），以确认正确组装的质粒。或者，使用殖民地 PCR 进行筛查。
2. 中间向量成功组装后，下一步是组装转录单元。这是一个4件装配，具有以下部分:中间矢量、发起人、CDS 和终结者。
   1. 净化四部分质粒。记录其浓度并稀释每个质粒，使 1 μL 具有 20 fmol 的 DNA。
   2. 要设置反应组合，请按照步骤 3.1.2 执行。
   3. 要设置克隆反应，请按照步骤 2.2 执行。
   4. 将整个克隆反应混合物转换为 DH5® 或相当于 LB + Cb 上的 大肠杆菌 称职细胞和板，在 37 °C 的夜间孵化。
   5. 16-18小时后，从孵化器取出盘子。白色和淡绿色的殖民地将出现（图6E和6F）。将盘子保持在4°C左右5小时，让sfGFP成熟。使用紫外线或蓝光半透明灯识别非荧光白色菌落。这些包含可能正确的转录单元。
   6. 条纹和成长8-10个白色殖民地，并执行殖民地PCR。净化来自殖民地的质粒，这些斑块从殖民地PCR检测呈阳性。进行限制消化（建议酶:Esp3I），以进一步确认组装。
      注意:测序转录单元通常没有必要，因为克隆只涉及限制消化和结膜。所有感兴趣的序列已在部分质粒级别得到确认。

4. 将盒式磁带拼贴成"多基因"质粒:

注:多基因质粒允许多个基因的表达。根据下游应用，多基因质粒可以复制或集成。复制质粒具有复制的酵母来源:因此，当酵母细胞分裂时，它可以稳定地维持。整合质粒没有复制的酵母来源。相反，它们有5'和3'的同源性手臂，允许通过同源重组将多个基因整合到基因组的特定部位。

1. 对于多基因质粒，首先组装中间载体。
   1. 要组装复制的中间矢量（图 4A），组装以下六个部分:左连接器 （ConLS'-pYTK008）、sfGFP 辍学 （pYTK047）、右连接器 （ConRE'-pYTK072）、酵母选择标记、 复制的酵母来源，与mRFP1， 复制大 肠杆菌 起源，和耐卡纳霉素基因（pYTK084）的部分质粒。
      1. 对于装配，请按照步骤从 3.1.1 到 3.1.3。
      2. 将整个克隆反应混合物转换为DH5®或等效 大肠杆菌 称职细胞，在LB上将板加50微克/毫升卡那霉素（Km）。在37°C的夜间孵化。
      3. 对于基于红色/绿色的筛选，请按照步骤 3.1.5 进行。
      4. 用于筛选错误组合，在 LB + Km 板上条纹并生长绿色菌落。然后按照步骤3.1.6。
   2. 对于综合多基因载体（图4B），先确定感兴趣的基因组轨迹，然后设计大约500个5'和3'同源性手臂碱基对，以整合到该轨迹。
      1. 将酵母基因组DNA中的5'和3'同源性手臂克隆到入口载体-pYTK001中。按照步骤1和2。
      2. 组装以下七个质粒:左连接器（康尔斯-pYTK008）、sfGFP辍学（pYTK047）、右连接器（康瑞-pYTK072）、酵母选择标记、 3'同源性手臂，与mRFP1，复制大肠杆菌起源， 和卡那霉素耐药基因（pYTK090）和5'同源性手臂的质粒部分。
      3. 对于组装和筛选，请按照步骤 4.1.1 执行。
2. 多基因质粒的组装
   1. 净化步骤 4.1 中获得的中间载体的质粒和第 3 步获得的盒式质粒。使用紫外线-视觉光谱仪或荧光测定记录其浓度。在ddH₂O中稀释每个，使1μL具有20个fmolDNA。
   2. 添加 1μL 的中间矢量、每个转录单元的 1 μL、1 μL 的 10x T4 连气缓冲器、0.5μL 的 Esp3I 和 0.5 μL 的 T4 连气。将使用ddH₂O的音量调至10μL。
   3. 要设置克隆反应，请按照步骤 2.2 执行。
   4. 将整个克隆反应混合物转换为DH5+或等效 大肠杆菌 称职细胞，并在LB+Km.孵化板上过夜37°C。
   5. 按照步骤 3.2.5 执行绿色/白色筛选。
   6. 净化几个白色菌落的质粒，并进行限制消化。建议使用 NotI-HF 酶，因为 大肠杆菌 原产地和 Km 选择标记部分分别有两个 NotI 站点（图 4B）。如果组装的质粒非常大，则可以选择另一个限制站点进行进一步确认。或者，在进行限制消化之前，使用殖民地 PCR 进行筛选。

5. 应用多基因质粒进行染色体或质粒基基因表达

1. 将多基因质粒整合到酵母基因组中，用于染色体基因表达 （图 5）
   1. 为所需的轨迹设计一个指南RNA（gRNA）。建议使用多个在线资源，如本布林、CRISPR 直流⁴³和 CHOPCHOP^44，以确定目标特异性的最大值。
   2. 克隆合成的20nt gRNA到pCAS质粒⁴⁵ 由吉布森克隆。通过 PCR 将 pCAS 质粒线性化，使用与 HDV ribozyme 的 3' 和 5' 分别绑定的倒置引物对 （图 5）。或者，将 gRNA 克隆到 sgRNA 辍学质粒 （pYTK050）， 并将辍学的质粒组装成带链接器的盒式质粒。然后用 Cas9 部分质粒 （pYTK036） 组装 Cas9 TU。最后，将 Cas9 TU 和 sgRNA TU 组装成复制的多基因质粒。
   3. 线性化 5-15 μg 的集成多基因质粒与 1 μL 的 NotI-HF 酶过夜。将 1μg 的 pCAS-gRNA 和线性集成多基因质粒转换为 S. cerevisiae。准备称职的细胞使用市售酵母转化套件或遵循盖茨和席斯特尔的协议，2007^年46年。
      注意:在 NotI 消化后，没有必要纯化线性多基因质粒。
   4. 回收后将细胞颗粒化，丢弃超自然体，用等量的水清洗。完全合成介质 （CSM） 辍学板上的板酵母细胞或含有抗生素的酵母提取物肽脱xtrose介质 （YPD） 板，具体取决于酵母选择性标记。在37°C孵化两天，形成殖民地。如果未观察到任何殖民地，在 30°C 下再孵育一到两天。
   5. 屏幕酵母菌群由殖民地PCR⁴⁷集成。
   6. 要治愈 pCAS，在非选择性 YPD 板上正确集成，将菌落划出。在30°C的夜间生长。将一个菌落从 YPD 板条纹到新鲜的 YPD 板上。同样，在30°C的夜间增长。将殖民地从第二个 YPD 板条纹到 YPD 加 100μg/mL 努尔索西林，这是 pCAS 的选择标记。当酵母细胞不能在选择性板上生长时，就会发生成功的固化。
      注意: 如果 pCAS 质粒在两轮非选择性 YPD 中未固化，则再次在新鲜的 YPD 上进行 1-2 轮。
2. 将复制的多基因质粒转换为质粒基基因表达
   1. 将 100 ng-1 μg 纯多基因质粒转化为 S. cerevisiae 称职细胞。
   2. 板酵母细胞在转换到CSM辍学板或YPD加抗生素板后立即，取决于使用的酵母选择标记。在30°C孵化2-3天，形成殖民地。

结果

这里的结果是四个复制的多基因质粒为β胡萝卜素（黄色）和番茄红素（红色）生产。建造了一个用于破坏 ADE2 轨迹的综合多基因质粒，其殖民地是红色的。

将 CDS 克隆到输入载体 （pYTK001）
ERG20从酵母基因组和三个类胡萝卜素基因crtE，crtYB，crtI从质粒plM494⁴⁸放大到条形载体...

讨论

Lee等人开发的基于MoClo的克隆试剂盒为快速将一到五个转录单元组装成多基因质粒，用于复制或整合到酵母基因组中提供了极好的资源。该试剂盒的使用消除了酵母中表达多个基因时效的克隆瓶颈。

我们用T4DNA韧带测试了金门克隆的消化/配结周期的五种不同条件。我们发现，30个周期的消化在37°C 5分钟和结块在16°C 5分钟，然后最后消化步骤在50°C 10分钟和蛋白质灭活步骤在80?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification