استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Summary

هنا، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج)، والطرد المركزي التدرج الجلسرين في وجود crosslinker، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرا إلى مجمع اللصق.

Abstract

الربط قبل مرنا هي عملية ديناميكية للغاية التي تنطوي على العديد من الإعادة ترتيب الجزيئية من الربط الفرعي اللصقات أثناء التجميع، وتجهيز الحمض النووي الريبي، والإفراج عن المكونات المعقدة. وقد استخدم الطرد المركزي التدرج الجلسرين لفصل البروتين أو RNP (ريبونوكليوبروتين) مجمعات للدراسات الوظيفية والهيكلية. هنا ، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج) ، والتي وضعت لأول مرة لتنقية واستقرار المجمعات الجزيئية الكلية للجسيم واحد المجهر الكريكترون المبرد ، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرة لمجمع الربط. وتستند هذه الطريقة إلى الطرد المركزي للعينات في تركيز متزايد من كاشف التثبيت لتحقيق الاستقرار في المجمعات. بعد الطرد المركزي من خلاصات الخميرة الإجمالية المحملة على تدرجات الجلسرين ، يتم تحليل الكسور المستردة بواسطة نقطة لطخة لتحديد المجمعات الفرعية اللصق وتحديد وجود عوامل الربط الفردية.

Introduction

الربط هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب ربط وإطلاق العديد من العوامل بطريقة منسقة. وتشمل هذه العوامل الربط البروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي, ATPases, هيليكيس, كيناس البروتين وفوسفاتاسيس, ليغاسي في كل مكان, من بين أمور أخرى^1,2,3; وللسماح لإعادة ترتيب الجزيئية أن يحدث، بعض هذه العوامل ربط عابر جدا إلى الربط الفرعي، مما يجعل عزل وتحديد هذه المجمعات المتوسطة RNP صعبة للغاية.

هنا، استخدمنا طريقة Grafix^4،5 لتحقيق الاستقرار في التفاعل بين عامل الربط الخميرة Cwc24 مع^{B act} complex⁶ للسماح بتحديد العوامل الأخرى المرتبطة بيكوبليكس وتحديد ما إذا كان وpp19 ubiquitin ligase يلعب أي دور في ربط أو الافراج عن Cwc24 إلى تسعة عشر (NTC) المعقدة و إلى نهاية 5 'من intron قبل التنشيط وأول رد فعل عبر الترانس يأخذ مكان. ميزة تعريض الجزيئات الكلية لتركيز متزايد من crosslinker على طول التدرج الجلسرين هو أنه يتجنب الوصلات المتقاطعة بين المجمعات^4،5، وبالتالي ، تشكيل المجاميع.

وقد استخدمت هذه الطريقة كتكميل للبروتين coimmunoprecipitation والانسحاب إلى أسفل المقايسات، والتي، على الرغم من السماح لعزل المجمعات الكبيرة، قد لا تكون موثوقة للحفاظ على التفاعلات العابرة داخل المجمعات الديناميكية الكبيرة^7،8. استخدام الكواشف التثبيت في التدرج الجلسرين يستقر الربط من هذه العوامل، مما يسمح لتأكيد التفاعلات من بروتينات محددة مع الربط subcomplexes. ولأن الوصلة المتقاطعة المختارة لا رجعة فيها كيميائيا، فقد تم تحليل البروتينات الموجودة في الكسور المستردة بواسطة لطخة نقطة بعد الطرد المركزي المتدرجة.

Protocol

1. الخميرة إعداد استخراج مجموع

1. تنمو خلايا الخميرة التعبير عن واحدة من عوامل الربط تنصهر على علامة TAP⁹ في 1 L YNB-غلو وسائل الإعلام (الخميرة النيتروجين الأساس تكملها 2٪ م / v الجلوكوز) مع الأحماض الأمينية المناسبة أو القواعد النووية, في هذه الحالة، أدينين (20 ميكروغرام/ مل)، ليوستين (30 ميكروغرام/مل)، تريبتوفان (30 ميكروغرام/مل)، حتى OD₆₀₀ = 1.0.
2. جمع الخلايا من الثقافة 1 لتر عن طريق الطرد المركزي في ثلاث زجاجات الطرد المركزي 500 مل في 17000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية وغسل مرتين مع 10 مل الماء البارد العقيم.
3. Resuspend خلايا الخميرة التي تم جمعها في 1/10 من حجم الخلية من العازلة الباردة A (10 مليمول L^-1 HEPES pH = 7.9، 1.5 ملليمول L^-1 MgCl₂، 50 ملليمول L^-1 KCl ، 5٪ v / v الجلسرين ، 0.5 ملليمول L^-1 DTT ، كوكتيل مثبطات Protease الخالي من EDTA).
4. تجميد قطرات صغيرة من تعليق الخلية في النيتروجين السائل. يمكن الحصول على قطرات صغيرة عن طريق pipetting محلول الخلية resuspended وإسقاط 50 ميكرولتر مباشرة إلى النيتروجين السائل.
   تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل إصابات ملامسة للبشرة أو العينين. التعامل مع استخدام معدات السلامة المخصصة.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين قطرات تجميد تعليق الخلية عند -80 درجة مئوية.
5. إعداد خلايا الخميرة lysates عن طريق طحن في جهاز مطحنة الكرة من خلال ست دورات في 20 هرتز / ثانية لمدة 3 دقائق.
   ملاحظة: بعد كل دورة، تزج الحاوية التي تؤوي الخلايا المجمدة في النيتروجين السائل لتجنب ذوبان. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين المستخلصات المجمدة عند -80 درجة مئوية. ويمكن أيضا أن تكون مستعدة مقتطفات الربط الخميرة باستخدام المتجانسات لlysate spheroplasts¹⁰، أو باستخدام هاون والحشرات^11،12.
6. تذوب استخراج عن طريق وضع الأنابيب التي تحتوي عليها في الماء في درجة حرارة الغرفة، ويهتز في بعض الأحيان.
7. مستخلصات الطرد المركزي عند 45,000 × غرام ل 1 ساعة عند 4 °C.
8. قياس محتوى البروتين من supernatant تطهيرها من قبل طريقة BCA¹³.
9. إعداد aliquots من مقتطفات، وتجميد سريع لهم في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. إعداد التدرج الجلسرين

1. إعداد اثنين من حلول الجلسرين في المخزن المؤقت A, واحد يحتوي على 10٪ v/v والآخر يحتوي على 30٪ v/v الجلسرين.
2. إضافة عامل الربط الجلوتارارالدهيد إلى 0.1٪ v/v في محلول 30٪ v/v الجلسرين ومزيج لتجانس.
   تنبيه: التعامل مع الجلوتارالدهيد داخل غطاء الدخان باستخدام معدات السلامة المناسبة.
3. أضف 6 مل من محلول الجلسرين البارد 10٪ v/v في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 12 مل (14 × 89 مم).
4. إضافة 6 مل من الباردة 30٪ v/v محلول الجلسرين تكملها الجلوتارارالدهيد مع حقنة تعلق على إبرة طويلة المقدمة مع جهاز ماجستير التدرج في الجزء السفلي من الأنبوب, فقط تحت 10٪ v/v حل الجلسرين.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن يكون الحل 10٪ v/v الجلسرين pipetted بعناية على الجزء العلوي من الحل 30٪ v/v الجلسرين / الجلوتارالدهيد.
5. استخدم الجهاز الرئيسي التدرج لإنشاء تدرج كثافة مستمر.
   ملاحظة: في الجهاز الرئيسي المتدرجة، يتم وضع الأنابيب في رف مناسب وتدويرها لفترة وجيزة، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لتحديد المعلمات (الوقت / الزاوية / السرعة). في هذا العمل استخدمنا: 2:25 دقيقة / 81.5 درجة / 11 دورة في الدقيقة.
6. إضافة بعناية 200 μL من 7٪ v/v الجلسرين / العازلة وسادة على الجزء العلوي قبل إضافة مقتطفات الخلية.
   ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الجلسرين للوسادة أقل من محلول الجلسرين الأقل تركيزا المستخدم لإنشاء التدرج الخطي.

3. مقتطفات الطرد المركزي

1. تحميل ما يقرب من 2 ملغ من البروتين الكلي على رأس كل 12 مل خطية الجلسرين الانحدار 10٪-30٪ الغلوتارارالدهيد مع وسادة.
2. ضع الأنابيب في دوار دلو أرجوحة مبرد مسبقا.
   ملاحظة: التعامل مع الأنابيب بلطف لتجنب الاختلاط قبل الطرد الفائق.
3. جهاز طرد مركزي عند 194,000 x g لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
4. Aliquot كل أنبوب 12 مل في أربعة وعشرين 500 ميكرولتر الكسور باستخدام نظام EconoSystem تكييفها أو عن طريق الأنابيب بعناية.
   ملاحظة: يتكون نظام EconoSystem المكيف من مضخة تعلجية وكاشف الأشعة فوق البنفسجية وجامع الكسور المتصل بجهاز ثقب الأنبوب. ويمكن رصد ملامح الترسيب عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر.
5. استخدام 40٪ v/v حل الجلسرين من خلال مضخة التجبير لدفع الجلسرين 10٪-30٪ الانحدار من الأنبوب إلى جامع الكسور.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين الكسور في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. تحميل 50 ميكرولتر من كل كسر مباشرة على أغشية النيتروسليلوز على بقعة نقطة أو فتحة جهاز لطخة. الكشف عن البروتين عن طريق المناعة باستخدام الأجسام المضادة ضد CBP (1:6،000، للكشف عن الجزء CBP من علامة TAP) ومكافحة أرنب IgG المقترنة مع الفجل Peroxidase (1:15،000) كأجسام مضادة ثانوية.

النتائج

لتحليل الملف الشخصي للترسيب Cwc24-TAP وتحديد ما إذا كانت طريقة Grafix فعالة لتحقيق الاستقرار في ربطها بالربط subcomplexes ، فصلنا إجمالي مستخلصات الخميرة من الخلايا التي تعبر عن Cwc24-TAP من خلال الطرد المركزي على تدرجات الجلسرين ، في وجود أو عدم وجود glutaraldehyde كعامل ربط متقاطع. ثم تم تحليل عينات من أربعة وع?...

Discussion

البروتين البروتين والريبونوكليك الأحماض البروتين التفاعلات يمكن استقرت باستخدام عوامل الربط المتبادل. من المهم أن يكون المركب الناتج مستقرا لتحمل الطرد المركزي الفائق على تدرج الجلسرين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تسمح شروط المخزن المؤقت التفاعل ولكن تكون صارمة بما يكفي لتجنب الربط غير مح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059