Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Резюме

Здесь мы описываем использование Grafix (Gradient Fixation), центрифугирования градиента глицерина в присутствии сшивающего фактора, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом.

Аннотация

Сплайсинг премрнК является очень динамичным процессом, который включает в себя множество молекулярных перестроек подкомплексов сплайсеосом во время сборки, обработки РНК и высвобождения сложных компонентов. Градиентное центрифугирование глицерина было использовано для разделения белковых или RNP (RiboNucleoProtein) комплексов для функциональных и структурных исследований. Здесь мы описываем использование Grafix (Градиентная фиксация), который был впервые разработан для очистки и стабилизации макромолекулярных комплексов для криоэлектроно-микроскопии одиночных частиц, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом. Этот метод основан на центрифугирование образцов в возрастающую концентрацию фиксирующим реагентом для стабилизации комплексов. После центрифугирования дрожжевых общих экстрактов, нагруженных на градиенты глицерина, восстановленные фракции анализируют точечным пятном для выявления подкомплексов сплайсеосом и определения наличия отдельных факторов сплайсинга.

Введение

Сплайсинг является очень динамичным процессом, который требует скоординированного связывания и высвобождения множества факторов. Эти сплайсинговые факторы включают РНК-связывающие белки, АТФазы, геликазы, протеинкиназы и фосфатазы, убиквитиновые лигазы, среди прочих^1,2,3; и чтобы обеспечить молекулярные перестройки, некоторые из этих факторов очень временно связываются с подкомплексами сплайсеосом, что делает выделение и идентификацию этих промежуточных комплексов RNP очень сложной.

Здесь мы использовали метод^{Grafix 4,5} для стабилизации взаимодействия фактора сращивания дрожжей Cwc24 с комплексом 6^акта B, чтобы позволить^{идентифицировать} другие факторы, связанные одновременно с этим подкомплексом, и определить, играет ли убиквитин-лигаза Prp19 какую-либо роль в связывании или высвобождении Cwc24 с комплексом Nineteen (NTC) и с 5' концом интрона до активации и первой реакции трансетерификации место. Преимущество воздействия макромолекул на возрастающую концентрацию сшивки вдоль градиента глицерина заключается в том, что оно позволяет избежать межкомплексных сшивок^4,5,а значит, и образования агрегатов.

Этот метод был использован в качестве дополнения к белкам коиммунопреципитации и вытягивания анализов, которые, несмотря на возможность выделения крупных комплексов, могут быть ненадежными для поддержания переходных взаимодействий в больших динамических комплексах^7,8. Применение реагентов фиксации в градиенте глицерина стабилизирует связывание таких факторов, позволяя подтвердить взаимодействие специфических белков со сплайсинговыми подкомплексами. Поскольку выбранный сшиватель был химически необратимым, белки, присутствующие в восстановленных фракциях, анализировали методом точечного пятна после градиентного центрифугирования.

протокол

1. Общий экстракт дрожжей

1. Выращивают дрожжевые клетки, экспрессирующие один из сплайсинговых факторов, слитых с меткой TAP⁹ в 1 л YNB-клеевой среде (дрожжевая азотная основа, дополненная 2% м/об глюкозы) с соответствующими аминокислотами или нуклеиновыми основаниями, в данном случае аденин (20 мкг/мл), лейцин (30 мкг/мл), триптофан (30 мкг/мл), до ОД 600=1,0.
2. Соберите клетки из культуры 1 л путем центрифугирования в трех бутылках центрифуги по 500 мл при 17 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и дважды промыть 10 мл холодной стерильной водой.
3. Повторно суспендировали собранные дрожжевые клетки в 1/10 клеточного объема холодного буфера А (10 ммоль^L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 ммоль L^-1 MgCl2, 50 ммоль L^-1 KCl, 5% v/v глицерина, 0,5 ммоль L^-1 DTT, коктейль ингибитора протеазы без ЭДТА).
4. Заморозить небольшие капли клеточной суспензии в жидком азоте. Небольшие капли могут быть получены путем пипетирования повторно суспендированного клеточного раствора и капли 50 мкл непосредственно в жидкий азот.
   ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать травмы при контакте с кожей или глазами. Управление с использованием соответствующего защитного оборудования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Замороженные капли клеточной суспензии можно хранить при -80 °C.
5. Приготовьте лизаты дрожжевых клеток путем измельчения в шаровом устройстве через шесть циклов при частоте 20 Гц/с в течение 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого цикла погружайте контейнер с замороженными клетками в жидкий азот, чтобы избежать плавления. Здесь протокол можно приостановить. Замороженные экстракты могут храниться при -80 °C. Дрожжевые сращивающие экстракты также могут быть приготовлены с использованием гомогенизаторов для лизута сферопластов¹⁰или с использованием ступки и^{пестиков 11,12.}
6. Расплавьте экстракт, поместив содержащие их трубки в воду комнатной температуры, периодически встряхивая.
7. Центрифужные экстракты при 45 000 х г в течение 1 ч при 4 °C.
8. Количественно оценить содержание белка в очищенном супернатанте методом¹³BCA.
9. Приготовьте аликвоты экстрактов, быстро заморозьте их в жидком азоте и храните при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.

2. Подготовка градиента глицерина

1. Приготовьте два раствора глицерина в буфере А, один из которых содержит 10% v/v, а другой содержит 30% v/v глицерина.
2. Добавляют сшивающий агент глутаровый альдегид до 0,1% v/v в 30% v/v растворе глицерина и смешивают для гомогенизации.
   ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте глутаровый альдегид внутри вытяжного капота, используя соответствующее защитное оборудование.
3. Добавьте 6 мл холодного 10% v/v раствора глицерина в нижнюю часть 12 мл центрифужной трубки (14 x 89 мм).
4. Добавьте 6 мл холодного 30% v/v раствора глицерина, дополненного глутаральным альдегидом, шприцем, прикрепленным к длинной игле, снабженной устройством Gradient Master в нижней части трубки, чуть ниже 10% v/v раствора глицерина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, 10% v/v раствор глицерина может быть тщательно пипетирован поверх 30% v/v раствора глицерина/глутаральдегида.
5. Используйте устройство Gradient Master для создания непрерывного градиента плотности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В устройстве Gradient Master трубки помещаются в соответствующую стойку и поворачиваются кратковременно, следуя рекомендациям завода-изготовителя по определению параметров (время/угол/скорость). В этой работе мы использовали: 2:25 мин/81,5°/11 об/мин.
6. Осторожно добавьте 200 мкл 7% v/v глицерина/буфера подушки A сверху непосредственно перед добавлением клеточных экстрактов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация глицерина в подушке должна быть ниже, чем в менее концентрированном растворе глицерина, используемом для создания линейного градиента.

3. Центрифугирование экстрактов

1. Загрузите примерно 2 мг общего белка поверх каждого 12 мл линейного градиента глицерина 10%-30% глутарового альдегида с подушкой.
2. Поместите трубы в предварительно охлажденный ротор с поворотным ковшом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обрабатывайте трубки, чтобы избежать смешивания перед ультрацентрифугированием.
3. Центрифуга при 194 000 х г в течение 16 ч при 4 °C.
4. Aliquot каждая трубка 12 мл в двадцати четырех фракциях 500 мкл с использованием адаптированной системы EconoSystem или путем тщательного пипетирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптированная система EconoSystem состоит из перистальтического насоса, УФ-детектора и дробного коллектора, подключенного к трубчато-перфораторному устройству. Профиль осаждения можно контролировать путем измерения поглощения при 280 нм.
5. Используйте 40% v/v раствор глицерина через перистальтический насос, чтобы протолкнуть 10-30% градиент глицерина из трубки в коллектор фракции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить фракции при -80 °C до использования.
6. Загрузите 50 мкл каждой фракции непосредственно на нитроцеллюлозные мембраны на устройстве точечного пятна или щелевого пятна. Обнаруживать белок иммуноблотом с использованием антител против CBP (1: 6000, для обнаружения cbP-части метки TAP) и анти-кроликов IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1: 15 000) в качестве вторичного антитела.

Результаты

Чтобы проанализировать профиль седиментации Cwc24-TAP и определить, был ли метод Grafix эффективен для стабилизации его связывания со сплайсинг-подкомплексами, мы разделили общие дрожжевые экстракты клеток, экспрессирующих Cwc24-TAP, путем центрифугирования на градиентах глицерина, в присутств...

Обсуждение

Взаимодействие белка с белком и рибонуклеиновой кислотой и белком может быть стабилизировано с помощью сшивающих агентов. Важно, чтобы полученный комплекс был стабилен, чтобы выдерживать ультрацентрифугирование на градиенте глицерина. Кроме того, условия буфера должны допускать вза?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059