Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Resumo

Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.

Resumo

O emendamento pré-mRNA é um processo muito dinâmico que envolve muitos rearranjos moleculares dos subcoplexos de emenda durante a montagem, processamento de RNA e liberação dos componentes complexos. A centrifugação de gradiente de glicerol tem sido usada para a separação de complexos de proteínas ou RNP (RiboNucleoProtein) para estudos funcionais e estruturais. Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), que foi desenvolvido pela primeira vez para purificar e estabilizar complexos macromoleculares para microscopia crio-elétron de partículas únicas, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas. Este método baseia-se na centrifugação das amostras em uma concentração crescente de um reagente de fixação para estabilizar complexos. Após a centrifugação de extratos totais de levedura carregados em gradientes de glicerol, as frações recuperadas são analisadas por mancha de ponto para a identificação dos sub complexidades e determinação da presença de fatores de emenda individuais.

Introdução

O splicing é um processo altamente dinâmico que requer a vinculação e liberação de uma infinidade de fatores de forma coordenada. Esses fatores de emenda incluem proteínas de ligação de RNA, ATPases, helicases, quinases de proteínas e fosfattases, ligaduras de ubiquitina, entre outros^1,2,3; e para permitir que os rearranjos moleculares ocorram, alguns desses fatores se ligam muito transitoriamente aos subcoplexos de emenda, tornando muito desafiador o isolamento e identificação desses complexos intermediários RNP.

Aqui, utilizamos o método Grafix^4,5 para estabilizar a interação do fator de emenda da levedura Cwc24 com o complexo de^ato B⁶ para permitir a identificação de outros fatores ligados concomitantemente a esse subcoplexo e determinar se a ligase ubiquitina Prp19 desempenha algum papel na vinculação ou liberação do complexo Cwc24 para o Complexo de Dezenove (NTC) e até o final de 5' do intron antes da ativação e a primeira reação de transesterificação leva lugar. A vantagem de expor as macromoléculas a uma concentração crescente do crosslinker ao longo do gradiente de glicerol é que ele evita inter-complexos crosslinks^4,5, e, portanto, a formação de agregados.

Este método foi utilizado como complementação para a co-doença da proteína e ensaios puxados para baixo, que, apesar de permitir o isolamento de grandes complexos, pode não ser confiável para manter interações transitórias dentro de grandes complexos dinâmicos^7,8. O uso de reagentes de fixação no gradiente de glicerol estabiliza a vinculação de tais fatores, permitindo a confirmação de interações de proteínas específicas com subcomplexos de emenda. Como o crosslinker escolhido era quimicamente irreversível, as proteínas presentes nas frações recuperadas foram analisadas por mancha de ponto após a centrifugação gradiente.

Protocolo

1. Preparação total do extrato de levedura

1. Cresça as células de levedura expressando um dos fatores de emenda fundidos à tag TAP⁹ em 1 L YNB-glu (Base de Nitrogênio levedura suplementada com 2% m/v de glicose) com os aminoácidos apropriados ou bases nucleicas, neste caso, adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptofano (30 μg/mL), até OD₆₀₀ = 1,0.
2. Colete as células da cultura 1 L por centrifugação em três garrafas centrífugas de centrífugas de 500 mL a 17.000 x g por 10 min a 4 °C e lave duas vezes com água estéril fria de 10 mL.
3. Resuspenha as células de levedura coletadas em 1/10 do volume celular do tampão frio A (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L^-1 MgCl₂, 50 mmol L^-1 KCl, 5% v/v glicerol, 0,5 mmol L^-1 DTT, Coquetel Inibidor de Protease sem EDTA).
4. Congele pequenas gotas de suspensão celular em nitrogênio líquido. As pequenas gotas podem ser obtidas com a pipetação da solução celular resuspended e a queda de 50 μL diretamente em nitrogênio líquido.
   ATENÇÃO: O nitrogênio líquido pode causar lesões em contato com a pele ou os olhos. Manuseie usando equipamentos de segurança apropriados.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As gotas congeladas de suspensão celular podem ser armazenadas a -80 °C.
5. Prepare as células de levedura lysates moendo em um dispositivo Ball Mill através de seis ciclos a 20 Hz/s por 3 min.
   NOTA: Após cada ciclo, mergulhe o recipiente que abriga as células congeladas em nitrogênio líquido para evitar o derretimento. O protocolo pode ser pausado aqui. Os extratos congelados podem ser armazenados a -80 °C. Extratos de emenda à levedura também podem ser preparados usando homogeneizadores para liseste de esferoplastos¹⁰, ou usando argamassa e pilão^11,12.
6. Derreta o extrato colocando os tubos que os contêm na água à temperatura ambiente, tremendo ocasionalmente.
7. Extratos de centrífuga a 45.000 x g por 1h a 4 °C.
8. Quantifique o teor proteico do supernanato limpo pelo método BCA¹³.
9. Prepare alíquotas dos extratos, congele-os rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Preparação do gradiente de glicerol

1. Prepare duas soluções de glicerol no Buffer A, uma contendo 10% v/v e outra contendo 30% v/v de glicerol.
2. Adicione o glutaraldeído do agente de crosslinking a 0,1% v/v na solução de glicerol v/v de 30% v/v e misture para homogeneizar.
   ATENÇÃO: Manuseie o glutaraldeído dentro do capô da fumaça usando equipamentos de segurança adequados.
3. Adicione 6 mL da solução de glicerol de 10% v/v no fundo do tubo centrífuga de 12 mL (14 x 89 mm).
4. Adicione 6 mL da solução de glicerol de 30% v/v a frio complementada com glutaraldeído com uma seringa presa a uma agulha longa fornecida com o dispositivo Gradiente Mestre na parte inferior do tubo, logo abaixo da solução de glicerol v/v de 10%.
   NOTA: Alternativamente, a solução de glicerol de 10% v/v pode ser cuidadosamente encarsa na parte superior da solução de glicerol/glutaraldeído de 30% v/v.
5. Use o dispositivo Gradiente Mestre para gerar um gradiente de densidade contínua.
   NOTA: No dispositivo Gradiente Mestre, os tubos são colocados em um rack apropriado e girados brevemente, seguindo as recomendações do fabricante para determinar os parâmetros (tempo/ângulo/velocidade). Neste trabalho foram utilizados: 2:25 min/81.5°/11 rpm.
6. Adicione cuidadosamente 200 μL de uma almofada de 7% v/v glicerol/tampão A na parte superior pouco antes da adição dos extratos celulares.
   NOTA: A concentração de glicerol da almofada deve ser inferior à solução menos concentrada de glicerol usada para criar o gradiente linear.

3. Extrai centrifugação

1. Carregue aproximadamente 2 mg de proteína total no topo de cada 12 mL de gradiente linear de glicerol 10%-30% glutaraldeído com almofada.
2. Coloque os tubos em um rotor pré-resfriado.
   NOTA: Manuseie os tubos suavemente para evitar a mistura antes da ultracentrifugação.
3. Centrifugar a 194.000 x g para 16 h a 4 °C.
4. Alíquota de 12 mL em 24 frações de 500 μL usando um EconoSystem adaptado ou por pipetação cuidadosa.
   NOTA: Um EconoSystem adaptado consiste em uma bomba peristáltica, o detector UV e o coletor de frações conectado ao dispositivo perfurante do tubo. O perfil de sedimentação pode ser monitorado pela medição da absorvância a 280 nm.
5. Use uma solução de glicerol de 40% v/v através da bomba peristáltica para empurrar o glicerol de 10%-30% de gradiente do tubo para o coletor de frações.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as frações a -80 °C até o uso.
6. Carregue 50 μL de cada fração diretamente em membranas de nitrocelulose em um dispositivo de mancha de ponto ou entalhe. Detecte proteína por imunoblot usando anticorpo contra CBP (1:6.000, para detectar a porção CBP da tag TAP) e anti-coelho IgG conjugado com Peroxidase de Rabanete (1:15.000) como o anticorpo secundário.

Resultados

Para analisar o perfil de sedimentação do Cwc24-TAP e determinar se o método Grafix foi eficaz para estabilizar sua vinculação a subcomplexos de emenda, separamos extratos totais de leveduras de células expressando Cwc24-TAP através da centrifugação em gradientes de glicerol, na presença ou ausência de glutaraldeído como agente de ligação cruzada. Amostras de 24 frações de 500 μL foram então analisadas por mancha de slot com anticorpo contra a porção CBP da tag TAP. Os resultados mostram que, na ausê...

Discussão

Interações proteína-proteína e ácidos ribonucleicos-proteínas podem ser estabilizadas usando agentes de crosslinking. É importante que o complexo resultante seja estável para suportar a ultracentrifugação no gradiente de glicerol. Além disso, as condições do buffer devem permitir a interação, mas ser rigorosas o suficiente para evitar ligações não específicas. Nos experimentos aqui mostrados, utilizamos uma solução tampão já estabelecida para reações in vitro de emenda¹⁵.<...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059