Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), einer Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomkomplex binden.

Zusammenfassung

Pre-mRNA-Spleißen ist ein sehr dynamischer Prozess, der viele molekulare Umlagerungen der Spleißosom-Subkomplexe während der Montage, RNA-Verarbeitung und Freisetzung der komplexen Komponenten beinhaltet. Die Glyceringradientenzentrifugation wurde zur Trennung von Protein- oder RNP-Komplexen (RiboNucleoProtein) für funktionelle und strukturelle Studien verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), das zuerst entwickelt wurde, um makromolekulare Komplexe für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie zu reinigen und zu stabilisieren, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomenkomplex binden. Diese Methode basiert auf der Zentrifugation von Proben in eine zunehmende Konzentration eines Fixierungsreagenz zur Stabilisierung von Komplexen. Nach der Zentrifugation von Hefe-Gesamtextrakten, die auf Glyceringradienten geladen sind, werden die wiedergewonnenen Fraktionen durch Dot-Blot analysiert, um die Spleißosom-Subkomplexe zu identifizieren und das Vorhandensein einzelner Spleißfaktoren zu bestimmungen.

Einleitung

Spleißen ist ein hochdynamischer Prozess, der eine Vielzahl von Faktoren koordiniert binden und freisetzen muss. Zu diesen Spleißfaktoren gehören RNA-bindende Proteine, ATPasen, Helikasen, Proteinkinasen und Phosphatasen, Ubiquitinligasen, unter anderem^1,2,3; und um die molekularen Umlagerungen zu ermöglichen, binden einige dieser Faktoren sehr vorübergehend an die Spleißosom-Subkomplexe, was die Isolierung und Identifizierung dieser RNP-Zwischenkomplexe sehr schwierig macht.

Hier haben wir die Grafix-Methode^4,5 verwendet, um die Wechselwirkung des Hefe-Spleißfaktors Cwc24 mit dem^{B-Act-Komplex 6} zu stabilisieren, um die Identifizierung anderer Faktoren zu ermöglichen, die gleichzeitig an diesen Subkomplex gebunden sind, und um festzustellen, ob die Ubiquitinligase Prp19 eine Rolle bei der Bindung oder Freisetzung von Cwc24 an den Nineteen (NTC) -Komplex und an das 5'-Ende des Introns vor der Aktivierung spielt und die erste Transesterreaktion dauert Ort. Der Vorteil der Exposition der Makromoleküle gegenüber einer zunehmenden Konzentration des Vernetzers entlang des Glyceringradienten besteht darin, dass es Interkomplexvernetzungen^4,5und damit die Bildung von Aggregaten vermeidet.

Diese Methode wurde als Ergänzung zu Protein-Coimmunopräzipitations- und Pull-Down-Assays verwendet, die, obwohl sie die Isolierung großer Komplexe ermöglichen, möglicherweise nicht zuverlässig sind, um transiente Wechselwirkungen innerhalb großer dynamischer Komplexe^{aufrechtzuerhalten 7,8}. Die Verwendung von Fixierungsreagenzien im Glyceringradienten stabilisiert die Bindung solcher Faktoren und ermöglicht die Bestätigung der Wechselwirkungen spezifischer Proteine mit Spleißsubkomplexen. Da der gewählte Vernetzer chemisch irreversibel war, wurden die in den wiederhergestellten Fraktionen vorhandenen Proteine nach der Gradientenzentrifugation per Punktblot analysiert.

Protokoll

1. Zubereitung von Hefe-Gesamtextrakt

1. Wachsen sie die Hefezellen, die einen der mit dem TAP-Tag⁹ verschmolzenen Spleißfaktoren in 1 L YNB-Glu-Medien (Hefestickstoffbasis ergänzt mit 2% m/v Glucose) mit den entsprechenden Aminosäuren oder Nukleinbasen, in diesem Fall Adenin (20 μg/ml), Leucin (30 μg/ml), Tryptophan (30 μg/ml), bis zu OD₆₀₀ = 1,0, exprimieren.
2. Die Zellen aus der 1 L-Kultur durch Zentrifugieren in drei 500-ml-Zentrifugenflaschen bei 17.000 x g für 10 min bei 4 °C sammeln und zweimal mit 10 ml kaltem sterilem Wasser waschen.
3. Resuspendieren Sie die gesammelten Hefezellen in 1/10 des Zellvolumens des Kaltpuffers A (10 mmol^L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol^L-1 MgCl2, 50 mmol^L-1 KCl, 5% v/v Glycerin, 0,5 mmol^L-1 DTT, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail).
4. Kleine Tropfen Zellsuspension in flüssigem Stickstoff einfrieren. Die kleinen Tropfen können erhalten werden, indem die resuspendierte Zelllösung pipetiert und 50 μL direkt in flüssigen Stickstoff fallen gelassen werden.
   ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann bei Kontakt mit Haut oder Augen zu Verletzungen führen. Handhabung mit geeigneter Sicherheitsausrüstung.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die gefrorenen Tropfen der Zellsuspension können bei -80 °C gelagert werden.
5. Bereiten Sie Hefezellen Lysate vor, indem Sie in einem Kugelmühlengerät durch sechs Zyklen bei 20 Hz / s für 3 min mahlen.
   HINWEIS: Tauchen Sie nach jedem Zyklus den Behälter, in dem sich die gefrorenen Zellen befinden, in flüssigen Stickstoff, um ein Schmelzen zu vermeiden. Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die gefrorenen Extrakte können bei -80 °C gelagert werden. Hefe-Spleißextrakte können auch mit Homogenisatoren hergestellt werden, um Spheroplasten¹⁰zu lysatieren, oder mit Mörser und Stößel^11,12.
6. Schmelzen Sie den Extrakt, indem Sie die Röhrchen, die sie enthalten, bei Raumtemperatur in Wasser legen und gelegentlich schütteln.
7. Zentrifugenextrakte bei 45.000 x g für 1 h bei 4 °C.
8. Quantifizierung des Proteingehalts des geklärten Überstandes mit der BCA-Methode¹³.
9. Aliquoten der Extrakte vorbereiten, schnell in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

2. Glyceringradientenvorbereitung

1. Bereiten Sie zwei Glycerinlösungen in Puffer A vor, eine mit 10% v / v und die andere mit 30% v / v Glycerin.
2. Das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd zu 0,1% v/v in die 30%ige v/v Glycerinlösung geben und homogenisieren.
   ACHTUNG: Behandeln Sie Glutaraldehyd im Abzug mit geeigneten Sicherheitsvorrichtungen.
3. 6 mL der kalten 10% v/v Glycerinlösung am Boden des 12 mL Zentrifugenröhrchens (14 x 89 mm) hinzufügen.
4. Fügen Sie 6 ml der kalten 30% v / v Glycerinlösung, ergänzt mit Glutaraldehyd, mit einer Spritze hinzu, die an einer langen Nadel befestigt ist, die mit dem Gradient Master-Gerät am Boden des Röhrchens geliefert wird, direkt unter der 10% v / v Glycerinlösung.
   HINWEIS: Alternativ kann die 10% v/v Glycerinlösung vorsichtig auf die Oberseite der 30%igen v/v Glycerin/Glutaraldehyd-Lösung pipettiert werden.
5. Verwenden Sie das Gradient Master-Gerät, um einen kontinuierlichen Dichtegradienten zu generieren.
   HINWEIS: Im Gradient Master-Gerät werden die Rohre in ein geeignetes Rack gelegt und kurz gedreht, wobei die Empfehlungen des Herstellers zur Bestimmung der Parameter (Zeit/Winkel/Geschwindigkeit) befolgt werden. In dieser Arbeit verwendeten wir: 2:25 min/81,5°/11 rpm.
6. Fügen Sie vorsichtig 200 μL eines 7% v / v Glycerin / Puffer-A-Kissens auf der Oberseite kurz vor der Zugabe der Zellextrakte hinzu.
   HINWEIS: Die Glycerinkonzentration des Kissens muss niedriger sein als die weniger konzentrierte Glycerinlösung, die zur Erstellung des linearen Gradienten verwendet wird.

3. Extrahiert zentrifugation

1. Laden Sie ca. 2 mg Gesamtprotein auf die Oberseite jedes 12 ml linearen Glyceringradienten 10% bis 30% Glutaraldehyd mit Kissen.
2. Legen Sie die Rohre in einen vorgekühlten Schaufelrotor.
   HINWEIS: Behandeln Sie die Röhrchen vorsichtig, um eine Vermischung vor der Ultrazentrifugation zu vermeiden.
3. Zentrifuge bei 194.000 x g für 16 h bei 4 °C.
4. Aliquot jedes 12 mL Röhrchen in vierundzwanzig 500 μL Fraktionen mit einem angepassten EconoSystem oder durch sorgfältiges Pipettieren.
   HINWEIS: Ein angepasstes EconoSystem besteht aus einer Peristaltikpumpe, dem UV-Detektor und dem Fraktionskollektor, der mit der Rohrperforationsvorrichtung verbunden ist. Das Sedimentationsprofil kann durch die Messung der Absorption bei 280 nm überwacht werden.
5. Verwenden Sie eine 40% v/ v Glycerinlösung durch die Peristaltikpumpe, um den Glyceringradienten von 10% bis 30% vom Rohr zum Fraktionskollektor zu drücken.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Lagern Sie die Fraktionen bei -80 °C bis zum Gebrauch.
6. Laden Sie 50 μL jeder Fraktion direkt auf Nitrocellulosemembranen auf einem Dot-Blot- oder Slot-Blot-Gerät. Nachweis von Protein durch Immunoblot mit Antikörpern gegen CBP (1:6.000, um den CBP-Teil des TAP-Tags nachzuweisen) und Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (1:15.000) als sekundärer Antikörper.

Ergebnisse

Um das Sedimentationsprofil von Cwc24-TAP zu analysieren und festzustellen, ob die Grafix-Methode wirksam war, um seine Bindung an Spleißsubkomplexe zu stabilisieren, trennten wir Gesamthefeextrakte von Zellen, die Cwc24-TAP durch Zentrifugation auf Glyceringradienten exprimieren, in Gegenwart oder Abwesenheit von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel. Proben von vierundzwanzig 500 μL-Fraktionen wurden dann durch Slot-Blot mit Antikörpern gegen den CBP-Teil des TAP-Tags analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Cwc24 in A...

Diskussion

Protein-Protein- und Ribonukleinsäure-Protein-Interaktionen können mit Vernetzern stabilisiert werden. Es ist wichtig, dass der resultierende Komplex stabil ist, um einer Ultrazentrifugation auf Glyceringradient standzuhalten. Darüber hinaus sollten die Pufferbedingungen die Interaktion ermöglichen, aber streng genug sein, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. In den hier gezeigten Experimenten haben wir eine bereits etablierte Pufferlösung für In-vitro-Spleißreaktionen^{verwendet 15}.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059