Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi

Riepilogo

Qui, descriviamo l'utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), una centrifugazione a gradiente di glicerolo in presenza di un reticolante, per identificare le interazioni tra fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma.

Abstract

Lo splicing pre-mRNA è un processo molto dinamico che coinvolge molti riarrangiamenti molecolari dei sottocomplessi dello spliceosoma durante l'assemblaggio, l'elaborazione dell'RNA e il rilascio dei componenti complessi. La centrifugazione a gradiente di glicerolo è stata utilizzata per la separazione di complessi proteici o RNP (RiboNucleoProtein) per studi funzionali e strutturali. Qui, descriviamo l'utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), che è stato sviluppato per la prima volta per purificare e stabilizzare i complessi macromolecolari per la microscopia crioeletnica a singola particella, per identificare le interazioni tra i fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma. Questo metodo si basa sulla centrifugazione di campioni in una concentrazione crescente di un reagente di fissazione per stabilizzare i complessi. Dopo la centrifugazione degli estratti totali di lievito caricati su gradienti di glicerolo, le frazioni recuperate vengono analizzate mediante dot blot per l'identificazione dei sotto-complessi spliceosomiali e la determinazione della presenza di singoli fattori di splicing.

Introduzione

Lo splicing è un processo altamente dinamico che richiede il legame e il rilascio di una moltitudine di fattori in modo coordinato. Questi fattori di splicing includono proteine leganti l'RNA, ATPasi, elicasi, protein chinasi e fosfatasi, ubiquitina ligases, tra gli altri^1,2,3; e per consentire i riarrangiamenti molecolari, alcuni di questi fattori si legano molto transitoriamente ai sottocomplessi dello spliceosoma, rendendo molto impegnativo l'isolamento e l'identificazione di questi complessi intermedi RNP.

Qui, abbiamo usato il metodo Grafix^4,5 per stabilizzare l'interazione del fattore di splicing del lievito Cwc24 con il complesso di^atto B⁶ per consentire l'identificazione di altri fattori legati contemporaneamente a quel sottocomplesso e determinare se l'ubiquitina ligasi Prp19 svolge un ruolo nel legame o nel rilascio di Cwc24 al complesso Nineteen (NTC) e all'estremità 5' dell'intron prima dell'attivazione e della prima reazione di transesterificazione prende luogo. Il vantaggio di esporre le macromolecole ad una concentrazione crescente del reticolante lungo il gradiente glicerolo è che evita i collegamenti incrociati inter-complessi^4,5e quindi, la formazione di aggregati.

Questo metodo è stato utilizzato come complemento ai saggi di coimmunoprecipitazione e pull-down proteici, che, pur consentendo l'isolamento di grandi complessi, potrebbero non essere affidabili per mantenere interazioni transitorie all'interno di grandi complessi^{dinamici 7,8}. L'uso di reagenti di fissazione nel gradiente del glicerolo stabilizza il legame di tali fattori, consentendo la conferma delle interazioni di proteine specifiche con sottocomplessi di splicing. Poiché il reticolante scelto era chimicamente irreversibile, le proteine presenti nelle frazioni recuperate sono state analizzate mediante dot blot dopo la centrifugazione a gradiente.

Protocollo

1. Preparazione dell'estratto totale di lievito

1. Crescono le cellule di lievito esprimendo uno dei fattori di splicing fusi al TAP tag⁹ in 1 L YNB-glu media (Yeast Nitrogen Basis integrato con glucosio 2% m/v) con gli aminoacidi o le basi nucleiche appropriate, in questo caso adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptofano (30 μg/mL), fino a OD₆₀₀ = 1,0.
2. Raccogliere le cellule dalla coltura da 1 L centrifugando in tre flaconi di centrifuga da 500 mL a 17.000 x g per 10 minuti a 4 °C e lavare due volte con 10 ml di acqua sterile fredda.
3. Risospesso le cellule di lievito raccolte in 1/10 del volume cellulare del tampone freddo A (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol L^-1 MgCl₂, 50 mmol L^-1 KCl, 5% v / v glicerolo, 0,5 mmol L^-1 DTT, edTA-free Protease Inhibitor Cocktail).
4. Congelare piccole gocce di sospensione cellulare in azoto liquido. Le piccole gocce possono essere ottenute pipettando la soluzione cellulare rinsosciata e facendo cadere 50 μL direttamente nell'azoto liquido.
   ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare lesioni a contatto con la pelle o gli occhi. Maneggiare utilizzando attrezzature di sicurezza appropriate.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Le gocce congelate di sospensione cellulare possono essere conservate a -80 °C.
5. Preparare i lasati di cellule di lievito macinando in un dispositivo Ball Mill attraverso sei cicli a 20 Hz / s per 3 minuti.
   NOTA: Dopo ogni ciclo, immergere il contenitore che ospita le celle congelate in azoto liquido per evitare la fusione. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Gli estratti congelati possono essere conservati a -80 °C. Gli estratti di splicing del lievito possono anche essere preparati utilizzando omogeneizzatori per lisato sferoplasti^10,o utilizzando mortaio e pestello^11,12.
6. Sciogliere l'estratto mettendo i tubi che li contengono in acqua a temperatura ambiente, agitando di tanto in tanto.
7. Centrifugare estratti a 45.000 x g per 1 ora a 4 °C.
8. Quantificare il contenuto proteico del surnatante eliminato con il metodo BCA¹³.
9. Preparare aliquote degli estratti, congelarli rapidamente in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Preparazione del gradiente di glicerolo

1. Preparare due soluzioni di glicerolo nel tampone A, una contenente il 10% v/v e l'altra contenente il 30% di glicerolo v/v.
2. Aggiungere l'agente reticolante glutaraldeide allo 0,1% v/v nella soluzione di glicerolo al 30% v/v e mescolare per omogeneizzare.
   ATTENZIONE: Maneggiare la glutaraldeide all'interno della cappa aspirante utilizzando appositi dispositivi di sicurezza.
3. Aggiungere 6 mL della soluzione fredda di glicerolo al 10% v/v sul fondo del tubo della centrifuga da 12 mL (14 x 89 mm).
4. Aggiungere 6 mL della soluzione fredda di glicerolo al 30% v/v integrata con glutaraldeide con una siringa attaccata a un ago lungo fornito con il dispositivo Gradient Master nella parte inferiore del tubo, appena sotto la soluzione di glicerolo al 10% v/v.
   NOTA: In alternativa, la soluzione di glicerolo al 10% v/v può essere accuratamente pipettata sulla parte superiore della soluzione di glicerolo/glutaraldeide al 30% v/v.
5. Utilizzare il dispositivo Master sfumatura per generare una sfumatura di densità continua.
   NOTA: nel dispositivo Gradient Master, i tubi vengono inseriti in un rack appropriato e ruotati brevemente, seguendo le raccomandazioni del produttore per determinare i parametri (tempo/angolo/velocità). In questo lavoro abbiamo usato: 2:25 min/81.5°/11 rpm.
6. Aggiungere con attenzione 200 μL di un cuscino di glicerolo/tampone al 7% v/v sulla parte superiore poco prima dell'aggiunta degli estratti cellulari.
   NOTA: La concentrazione di glicerolo del cuscino deve essere inferiore alla soluzione di glicerolo meno concentrata utilizzata per creare il gradiente lineare.

3. Centrifugazione degli estratti

1. Caricare circa 2 mg di proteine totali sulla parte superiore di ogni 12 mL gradiente lineare di glicerolo 10%-30% glutaraldeide con cuscino.
2. Posizionare i tubi in un rotore a benna oscillante pre-raffreddato.
   NOTA: Maneggiare delicatamente i tubi per evitare la miscelazione prima dell'ultracentrifugazione.
3. Centrifuga a 194.000 x g per 16 ore a 4 °C.
4. Aliquotare ogni tubo da 12 mL in ventiquattro frazioni da 500 μL utilizzando un EconoSystem adattato o mediante pipettaggio attento.
   NOTA: un EconoSystem adattato è costituito da una pompa peristaltica, dal rilevatore UV e dal collettore di frazioni collegato al dispositivo di perforazione del tubo. Il profilo di sedimentazione può essere monitorato mediante la misurazione dell'assorbanza a 280 nm.
5. Utilizzare una soluzione di glicerolo al 40% v/v attraverso la pompa peristaltica per spingere il gradiente del glicerolo del 10%-30% dal tubo al collettore di frazione.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare le frazioni a -80 °C fino all'uso.
6. Caricare 50 μL di ogni frazione direttamente sulle membrane di nitrocellulosa su un dispositivo dot blot o slot blot. Rileva la proteina mediante immunoblot utilizzando anticorpi contro CBP (1:6.000, per rilevare la porzione CBP del tag TAP) e IgG anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (1:15.000) come anticorpo secondario.

Risultati

Per analizzare il profilo di sedimentazione di Cwc24-TAP e determinare se il metodo Grafix fosse efficace per stabilizzare il suo legame ai sottocomplessi di splicing, abbiamo separato estratti di lievito totali di cellule che esprimono Cwc24-TAP attraverso centrifugazione su gradienti di glicerolo, in presenza o assenza di glutaraldeide come agente reticolante. Campioni di ventiquattro frazioni da 500 μL sono stati poi analizzati mediante slot blot con anticorpo contro la porzione CBP del tag TAP. I risultati mostrano ...

Discussione

Le interazioni proteina-proteina e acidi ribonucleici-proteina possono essere stabilizzate utilizzando agenti reticolanti. È importante che il complesso risultante sia stabile per resistere all'ultracentrifugazione sul gradiente di glicerolo. Inoltre, le condizioni del buffer dovrebbero consentire l'interazione, ma essere abbastanza rigorose da evitare binding non specifici. Negli esperimenti qui mostrati, abbiamo utilizzato una soluzione tampone già stabilita per le reazioni di splicing in vitro¹⁵

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059