Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

Resumen

Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), una centrifugación de gradiente de glicerol en presencia de un ticulador, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas.

Resumen

El empalme pre-ARNm es un proceso muy dinámico que implica muchos reordenamientos moleculares de los subcomplejos del espliceosoma durante el ensamblaje, el procesamiento del ARN y la liberación de los componentes complejos. La centrifugación por gradiente de glicerol se ha utilizado para la separación de complejos de proteínas o RNP (RiboNucleoProtein) para estudios funcionales y estructurales. Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), que se desarrolló por primera vez para purificar y estabilizar complejos macromoleculares para microscopía crio-electrónica de partículas individuales, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas. Este método se basa en la centrifugación de muestras en una concentración creciente de un reactivo de fijación para estabilizar complejos. Después de la centrifugación de los extractos totales de levadura cargados en gradientes de glicerol, las fracciones recuperadas se analizan por punto blot para la identificación de los sub-complejos de espliceosomas y la determinación de la presencia de factores de empalme individuales.

Introducción

El empalme es un proceso altamente dinámico que requiere la unión y liberación de una multitud de factores de manera coordinada. Estos factores de empalme incluyen proteínas de unión a ARN, ATPasas, helicasas, proteínas quinasas y fosfatasas, ligasas de ubiquitina, entre otras^1,2,3; y para permitir que se produzcan los reordenamientos moleculares, algunos de estos factores se unen muy transitoriamente a los subcomplejos del espliceosoma, lo que hace que el aislamiento y la identificación de estos complejos intermedios de RNP sean muy difíciles.

Aquí, utilizamos el método grafix^4,5 para estabilizar la interacción del factor de empalme de levadura Cwc24 con el complejo de^acto B⁶ para permitir la identificación de otros factores unidos concomitantemente a ese subcomplejo y determinar si la ubiquitina ligasa Prp19 juega algún papel en la unión o liberación de Cwc24 al complejo Nineteen (NTC) y al extremo 5' del intrón antes de la activación y la primera reacción de transesterificación toma lugar. La ventaja de exponer las macromoléculas a una concentración creciente del reticulador a lo largo del gradiente de glicerol es que evita los enlaces cruzados inter-complejos^4,5y, por lo tanto, la formación de agregados.

Este método se utilizó como complemento a los ensayos de coinmunoprecipitación de proteínas y pull-down, que, a pesar de permitir el aislamiento de grandes complejos, pueden no ser confiables para mantener interacciones transitorias dentro de grandes complejos dinámicos^7,8. El uso de reactivos de fijación en el gradiente de glicerol estabiliza la unión de dichos factores, permitiendo la confirmación de interacciones de proteínas específicas con subcomplejos de empalme. Debido a que el reticulador elegido era químicamente irreversible, las proteínas presentes en las fracciones recuperadas se analizaron mediante puntos secantes después de la centrifugación por gradiente.

Protocolo

1. Preparación de extracto total de levadura

1. Cultivar las células de levadura expresando uno de los factores de empalme fusionados a la etiqueta TAP⁹ en medios 1 L YNB-glu (Base de Nitrógeno de Levadura suplementada con 2% m/v de glucosa) con los aminoácidos o bases nucleicas apropiadas, en este caso, adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptófano (30 μg/mL), hasta OD₆₀₀ = 1.0.
2. Recoger las células del cultivo de 1 L centrifugando en tres botellas centrífugas de 500 ml a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C y lavar dos veces con 10 ml de agua fría estéril.
3. Resuspend las células de levadura recolectadas en 1/10 del volumen celular del tampón frío A (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L^-1 MgCl₂, 50 mmol L^-1 KCl, 5% v / v glicerol, 0.5 mmol L^-1 TDT, Cóctel inhibidor de proteasa libre de EDTA).
4. Congelar pequeñas gotas de suspensión celular en nitrógeno líquido. Las pequeñas gotas se pueden obtener pipeteando la solución celular resuspendida y dejando caer 50 μL directamente en nitrógeno líquido.
   PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar lesiones en contacto con la piel o los ojos. Manipule utilizando el equipo de seguridad apropiado.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las gotas congeladas de suspensión celular se pueden almacenar a -80 °C.
5. Prepare los lisados de las células de levadura moliendo en un dispositivo de molino de bolas a través de seis ciclos a 20 Hz / s durante 3 minutos.
   NOTA: Después de cada ciclo, sumerja el recipiente que alberga las células congeladas en nitrógeno líquido para evitar que se derritan. El protocolo se puede pausar aquí. Los extractos congelados se pueden almacenar a -80 °C. Los extractos de empalme de levadura también se pueden preparar utilizando homogeneizadores para lisar esferoplastos^10,o utilizando mortero y mortero^11,12.
6. Derrita el extracto colocando los tubos que los contienen en agua a temperatura ambiente, agitando ocasionalmente.
7. Extractos de centrífuga a 45.000 x g durante 1 h a 4 °C.
8. Cuantificar el contenido proteico del sobrenadante despejado mediante el método BCA¹³.
9. Preparar alícuotas de los extractos, congelarlos rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Preparación del gradiente de glicerol

1. Prepare dos soluciones de glicerol en Buffer A, una que contenga 10% v/v y la otra que contenga 30% v/v glicerol.
2. Añadir el agente glutaraldehído reticulante al 0,1% v/v en la solución de glicerol al 30% v/v y mezclar para homogeneizar.
   PRECAUCIÓN: Manipule el glutaraldehído dentro de la campana de humos con el equipo de seguridad adecuado.
3. Añadir 6 ml de la solución fría de glicerol al 10% v/v en la parte inferior del tubo centrífugo de 12 ml (14 x 89 mm).
4. Agregue 6 ml de la solución fría de glicerol al 30% v/ v suplementada con glutaraldehído con una jeringa conectada a una aguja larga provista con el dispositivo Gradient Master en la parte inferior del tubo, justo debajo de la solución de glicerol al 10% v / v.
   NOTA: Alternativamente, la solución de glicerol al 10% v/v se puede pipetear cuidadosamente en la parte superior de la solución de glicerol/glutaraldehído al 30% v/v.
5. Utilice el dispositivo Maestro de degradado para generar un degradado de densidad continuo.
   NOTA: En el dispositivo Gradient Master, los tubos se colocan en un bastidor apropiado y se giran brevemente, siguiendo las recomendaciones del fabricante para determinar los parámetros (tiempo/ángulo/velocidad). En este trabajo utilizamos: 2:25 min/81.5°/11 rpm.
6. Agregue cuidadosamente 200 μL de un cojín de glicerol / tampón al 7% v / v en la parte superior justo antes de la adición de los extractos celulares.
   NOTA: La concentración de glicerol del cojín debe ser menor que la solución de glicerol menos concentrada utilizada para crear el gradiente lineal.

3. Extrae centrifugación

1. Cargue aproximadamente 2 mg de proteína total en la parte superior de cada gradiente lineal de glicerol de 12 ml 10% a 30% de glutaraldehído con cojín.
2. Coloque los tubos en un rotor de cucharón basculante preenfriado.
   NOTA: Manipule los tubos suavemente para evitar mezclarlos antes de la ultracentrifugación.
3. Centrifugadora a 194.000 x g durante 16 h a 4 °C.
4. Alícuota cada tubo de 12 ml en veinticuatro fracciones de 500 μL utilizando un EconoSystem adaptado o mediante pipeteo cuidadoso.
   NOTA: Un EconoSystem adaptado consiste en una bomba peristáltica, el detector UV y el colector de fracción conectado al dispositivo de perforación del tubo. El perfil de sedimentación puede ser monitoreado mediante la medición de la absorbancia a 280 nm.
5. Use una solución de glicerol al 40% v/v a través de la bomba peristáltica para empujar el gradiente de glicerol 10% -30% desde el tubo hasta el colector de fracción.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Conservar las fracciones a -80 °C hasta su uso.
6. Cargue 50 μL de cada fracción directamente sobre las membranas de nitrocelulosa en un dispositivo de blot de puntos o de ranura. Detectar proteína por inmunoblot usando anticuerpos contra CBP (1:6,000, para detectar la porción CBP de la etiqueta TAP) e IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (1:15,000) como anticuerpo secundario.

Resultados

Para analizar el perfil de sedimentación de Cwc24-TAP y determinar si el método Grafix fue efectivo para estabilizar su unión a subcomplejos de empalme, separamos extractos de levadura total de células que expresan Cwc24-TAP mediante centrifugación en gradientes de glicerol, en presencia o ausencia de glutaraldehído como agente de reticulación. Las muestras de veinticuatro fracciones de 500 μL se analizaron mediante ranura blot con anticuerpos contra la porción CBP de la etiqueta TAP. Los resultados muestran que...

Discusión

Las interacciones proteína-proteína y ácidos ribonucleicos-proteína se pueden estabilizar utilizando agentes ticuladores. Es importante que el complejo resultante sea estable para soportar la ultracentrifugación en el gradiente de glicerol. Además, las condiciones del búfer deben permitir la interacción, pero ser lo suficientemente estrictas como para evitar la unión no específica. En los experimentos aquí mostrados, utilizamos una solución tampón ya establecida para reacciones de empalme in vitro

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059