Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Özet

Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.

Özet

Pre-mRNA birleştirme, karmaşık bileşenlerin montajı, RNA işlemesi ve serbest bırakılması sırasında spliceosome alt komkomplexlerinin birçok moleküler yeniden düzenlenmesini içeren çok dinamik bir süreçtir. Gliserol gradyan santrifüjleme fonksiyonel ve yapısal çalışmalar için protein veya RNP (RiboNucleoProtein) komplekslerinin ayrılması için kullanılmıştır. Burada, ilk olarak tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi için makromoleküler kompleksleri arındırmak ve stabilize etmek, spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için geliştirilen Grafix'in (Gradyan Fiksasyonu) kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntem, kompleksleri stabilize etmek için numunelerin artan bir sabitleme reaktif konsantrasyonuna santrifüjlenmesine dayanmaktadır. Gliserol gradyanlarına yüklenen maya toplam özlerinin santrifüjlenmesinden sonra, geri kazanılan fraksiyonlar spliceosome alt komplekslerinin tanımlanması ve bireysel birleştirme faktörlerinin varlığının belirlenmesi için nokta lekesi ile analiz edilir.

Giriş

Birleştirme, çok sayıda faktörün koordineli bir şekilde bağlanmasını ve serbest bırakılmasını gerektiren son derece dinamik bir işlemdir. Bu birleştirme faktörleri arasında RNA bağlayıcı proteinler, ATPases, helicases, protein kinazları ve fosfatazlar, ubiquitin ligases, diğerleri arasında^1,2,3; ve moleküler yeniden düzenlemelerin gerçekleşmesine izin vermek için, bu faktörlerin bazıları çok geçici olarak spliceosome alt komitelerine bağlanır ve bu RNP ara komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanmasını çok zorlaştırır.

İşte, Grafix yöntemi^4,5'i, maya birleştirme faktörü Cwc24'ün B^act complex⁶ ile etkileşimini stabilize etmek için kullandık, bu alt sıkıştırıcıya birlikte bağlı diğer faktörlerin tanımlanmasına izin vermek ve ubiquitin ligase Prp19, Cwc24'ün on dokuz (NTC) kompleksine bağlanmasında veya serbest bırakılmasında ve aktivasyondan önce intronun 5' ucuna kadar herhangi bir rol oynar ve ilk transesterifikasyon reaksiyonu alır yer. Makromolekülleri gliserol gradyanı boyunca artan bir çapraz bağlantı konsantrasyonuna maruz kalmanın avantajı, kompleksler arası çapraz^{bağlantılardan 4,5}ve dolayısıyla agregaların oluşumunu önlemesidir.

Bu yöntem, büyük komplekslerin izolasyonuna izin vermesine rağmen, büyük dinamik kompleksler içinde geçici etkileşimleri sürdürmek için güvenilir olmayabileceği protein koimmunoprecipitation ve çekme tahlillerinin tamamlayıcısı olarak kullanılmıştır^7,8. Gliserol gradyanındaki fiksasyon reaktiflerinin kullanımı, bu faktörlerin bağlanmasını stabilize ederek, belirli proteinlerin birleştirme altcomplexes ile etkileşimlerinin onaylanmasını sağlar. Seçilen çapraz bağlantı kimyasal olarak geri döndürülemez olduğundan, geri kazanılan fraksiyonlarda bulunan proteinler gradyan santrifüjlemeden sonra nokta lekesi ile analiz edildi.

Protokol

1. Maya toplam özü hazırlığı

1. 1 L YNB-glu ortam (%2 m/v glikoz ile desteklenmiş Maya Nitrojen Temeli)^9'da TAP etiketine kaynaşmış birleştirme faktörlerinden birini uygun amino asitler veya çekirdek bazlarla ifade eden maya hücrelerini büyütün, Bu durumda, adenin (20 μg/mL), lösin (30 μg/mL), triptofan (30 μg/mL), OD₆₀₀ = 1.0'a kadar.
2. 1 L kültüründen hücreleri 17.000 x g'da üç adet 500 mL santrifüj şişesinde 4 °C'de 10 dakika santrifüjle toplayın ve 10 mL soğuk steril su ile iki kez yıkayın.
3. Toplanan maya hücrelerini soğuk tampon A hücre hacminin 1/10'unda yeniden depolar (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L^-1 MgCl_2,50 mmol L^-1 KCl, %5 v/v gliserol, 0.5 mmol L^-1 DTT, EDTA içermeyen Proteaz inhibitör Kokteyli).
4. Sıvı nitrojende küçük hücre süspansiyon damlalarını dondurun. Küçük damlalar, yeniden sulandırılmış hücre çözeltisinin pipetleilmesi ve 50 μL'nin doğrudan sıvı nitrojene düşmesiyle elde edilebilir.
   DİkKAT: Sıvı nitrojen cilt veya gözlerle temas halinde yaralanmalara neden olabilir. Uygun güvenlik ekipmanlarını kullanarak sapla.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Donmuş hücre süspansiyon damlaları -80 °C'de saklanabilir.
5. 3 dakika boyunca 20 Hz/s'de altı döngü boyunca bir Ball Mill cihazında öğüterek maya hücreleri lysates hazırlayın.
   NOT: Her döngüden sonra, erimeyi önlemek için donmuş hücreleri barındıran kabı sıvı nitrojene batırın. Protokol burada duraklatılabilir. Dondurulmuş özler -80 °C'de saklanabilir. Maya birleştirme özleri, sferoplastları¹⁰'u yutacak homojenizatörler kullanılarak veya harç ve pestle^11,12kullanılarak da hazırlanabilir.
6. İçerdiği tüpleri oda sıcaklığında suya yerleştirerek, ara sıra sallayarak özü eritin.
7. Santrifüj, 4 °C'de 1 saat boyunca 45.000 x g'da santrifüj çıkarır.
8. Temizlenen süpernatantın protein içeriğini BCA yöntemi ile ölçün¹³.
9. Özlerin aliquotlarını hazırlayın, sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

2. Gliserol gradyan hazırlığı

1. Tampon A'da biri %10 v/v, diğeri %30 v/v gliserol içeren iki gliserol çözeltisi hazırlayın.
2. Çapraz bağlama maddesi glutaraldehitini %30 v/v gliserol çözeltisine %0,1 v/v'ye ekleyin ve homojenize etmek için karıştırın.
   DİkKAT: Uygun güvenlik ekipmanlarını kullanarak duman kaputunun içindeki glutaraldehiti kullanın.
3. 12 mL santrifüj tüpünün (14 x 89 mm) altına 6 mL soğuk %10 v/v gliserol çözeltisi ekleyin.
4. Tüpün altındaki Degrade Master cihazı ile sağlanan uzun bir iğneye bağlı bir şırınga ile glutaraldehit ile desteklenmiş soğuk 30% v / v gliserol çözeltisinin 6 mL'sini ekleyin, % 10 v / v gliserol çözeltisinin hemen altında.
   NOT: Alternatif olarak, %10 v/v gliserol çözeltisi% 30 v/v gliserol/glutaraldehit çözeltisinin üstüne dikkatlice pipetlenebilir.
5. Sürekli yoğunluk degradesi oluşturmak için Degrade Ana aygıtını kullanın.
   NOT: Degrade Master cihazında, tüpler uygun bir rafa yerleştirilir ve parametrelerin belirlenmesi için üreticinin önerilerine (zaman/açı/hız) uyularak kısa bir süre döndürülür. Bu çalışmada kullandık: 2:25 dk/81.5°/11 rpm.
6. Hücre özlerinin eklenmesinden hemen önce tepeye 200 μL% 7 v / v gliserol / tampon A yastığı ekleyin.
   NOT: Minderin gliserol konsantrasyonu, doğrusal gradyanı oluşturmak için kullanılan daha az konsantre gliserol çözeltisinden daha düşük olmalıdır.

3. Santrifüjü çıkarır

1. Yastık ile her 12 mL lineer gliserol gradyanı 10% –30% glutaraldehitin üzerine yaklaşık 2 mg toplam protein yükleyin.
2. Tüpleri önceden soğutulmuş bir salıncak kovası rotorasına yerleştirin.
   NOT: Ultrasantrifüjlemeden önce karıştırmayı önlemek için tüpleri hafifçe takın.
3. 4 °C'de 16 saat için 194.000 x g'da santrifüj.
4. Aliquot her 12 mL tüp yirmi dört 500 μL fraksiyonlarda uyarlanmış bir EconoSystem kullanarak veya dikkatlice pipetleme ile.
   NOT: Uyarlanmış bir EconoSystem, peristaltik bir pompa, UV dedektörü ve tüp delinme cihazına bağlı fraksiyon toplayıcıdan oluşur. Çökeltme profili, emiciliğin 280 nm'de ölçülebilmesiyle izlenebilir.
5. Glistaltik pompadan %40 v/v gliserol çözeltisi kullanarak gliserol%10-%30 gradyanı tüpten fraksiyon toplayıcıya itin.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Fraksiyonları kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
6. Her kesirden 50 μL'yi doğrudan bir nokta lekesi veya yuva lekesi cihazına nitroselüloz zarlarına yükleyin. CBP'ye karşı antikor kullanarak immünoblot ile proteini tespit edin (TAP etiketinin CBP kısmını tespit etmek için 1:6.000) ve ikincil antikor olarak Horseradish Peroxidase (1:15.000) ile konjuge edilen tavşan karşıtı IgG.

Sonuçlar

Cwc24-TAP'ın sedimantasyon profilini analiz etmek ve Grafix yönteminin birleştirme altkompanlarına bağlanmasını stabilize etmek için etkili olup olmadığını belirlemek için, Cwc24-TAP'ı ifade eden hücrelerin toplam maya özlerini gliserol gradyanları üzerinde santrifüjleme yoluyla, çapraz bağlama ajanı olarak glutaraldehitin varlığında veya yokluğunda ayırdık. Yirmi dört 500 μL fraksiyon örnekleri daha sonra TAP etiketinin CBP kısmına karşı antikor içeren yuva lekesi ile analiz edildi. S...

Tartışmalar

Protein-protein ve ribonik asitler-protein etkileşimleri çapraz bağlama ajanları kullanılarak stabilize edilebilir. Elde eden kompleksin gliserol gradyanı üzerinde ultrasantrifüjasyona dayanacak şekilde kararlı olması önemlidir. Ayrıca, arabellek koşulları etkileşime izin vermeli, ancak belirli olmayan bağlamayı önlemek için yeterince katı olmalıdır. Burada gösterilen deneylerde, in vitro birleştirme reaksiyonları için önceden kurulmuş bir tampon çözeltisi kullandık¹⁵

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059