وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Summary

جينوم الخباز للخميرة الميتوكوندريا يرمز ثمانية من البوليبتيدات. الهدف من البروتوكول الحالي هو تسمية كل منهم وتصورها بعد ذلك كشرائط منفصلة.

Abstract

الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية من الخلايا eukaryotic قادرة على التنفس الهوائية. أنها تحتوي على الجينوم الدائري وأجهزة التعبير الجيني. جينوم الميتوكوندريا من خميرة الخباز يرمز ثمانية بروتينات: ثلاث وحدات فرعية من السيتوكروم سي أوكسيداز (Cox1p، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج إنزيم oxidoreductase، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوزوم الميتوكوندريا Var1p. الغرض من الطريقة المذكورة هنا هو تسمية هذه البروتينات على وجه التحديد مع ³⁵S methionine، وفصلها عن طريق الكهرباء وتصور الإشارات كشرائط منفصلة على الشاشة. يتضمن الإجراء عدة خطوات. أولاً، يتم استزراع خلايا الخميرة في وسط يحتوي على الغالاكتوز حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخرة. بعد ذلك ، يمنع علاج cycloheximide الترجمة السيتوبلاسميك ويسمح بإدراج ³⁵S methionine فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ثم يتم استخراج جميع البروتينات من خلايا الخميرة وفصلها بواسطة مادة الجل البولي أكرريلاميد الكهربائي. وأخيرا، يتم تجفيف هلام ومحتضنة مع شاشة الفوسفور التخزين. يتم مسح الشاشة على صورة فوسفورية تكشف عن العصابات. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لمقارنة معدل التركيب الحيوي لبوليبتيد واحد في الميتوكوندريا من سلالة الخميرة متحولة مقابل نوع البرية، وهو أمر مفيد لدراسة عيوب التعبير الجيني الميتوكوندريا. هذا البروتوكول يعطي معلومات قيمة حول معدل الترجمة لجميع mRNAs mRNS mitochondrial الخميرة. ومع ذلك، فإنه يتطلب العديد من الضوابط والتجارب الإضافية لجعل الاستنتاجات السليمة.

Introduction

الميتوكوندريا هي العضيات المشاركة بعمق في عملية التمثيل الغذائي لخلايا النوى. وتزود سلسلة نقل الإلكترونات الخلية باستخدام ATP، وهي العملة النشطة الرئيسية المستخدمة في مسارات كيميائية حيوية متعددة. الى جانب ذلك ، فهي تشارك في موت الخلايا المبرمج ، والأحماض الدهنية والتوليف الهيم ، وغيرها من العمليات. الخلل في الميتوكوندريا هو مصدر معروف للمرض البشري¹. يمكن أن تنتج عن الطفرات في الجينات النووية أو الميتوكوندريا ترميز المكونات الهيكلية أو التنظيمية من العضيات². خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae هو كائن حي نموذجي ممتاز لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا لأسباب عدة. أولاً، يتم تسلسل الجينوم الخاص بهم بالكامل³، مشروح بشكل جيد ، وهناك مجموعة كبيرة من البيانات متوفرة بالفعل في الأدب بفضل التاريخ الطويل من التحقيقات التي أجريت مع هذا الكائن الحي. ثانياً، التلاعب بجينومهم النووي سريع نسبياً وسهل بسبب معدل نموها السريع ونظام إعادة التركيب المتماثل عالي الكفاءة. ثالثاً، خميرة بيكر S. cerevisiae هي واحدة من الكائنات الحية القليلة التي يتم تطوير التلاعب مع الجينوم الميتوكوندريا. وأخيرا ، خميرة بيكر هو كائن حي أيروب anaerobe الكليات ، والذي يسمح العزلة ودراسة المسوخ المعيبة في الجهاز التنفسي ، لأنها يمكن أن تنمو في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصادر الكربون القابلة للتخمير.

ونحن وصف طريقة لدراسة التعبير الجيني الميتوكوندريا من خميرة بيكر S. cerevisiae في المستوى الترجمي⁴. ويأتي مبدأها الرئيسي من عدة ملاحظات. أولا ، فإن الجينوم الميتوكوندريا الخميرة ترميز ثمانية فقط من البروتينات : ثلاث وحدات فرعية من cytochrome c oxidase (Cox1p ، Cox2p، و Cox3p)، ثلاث وحدات فرعية من سينثاز ATP (Atp6p، Atp8p، و Atp9p)، وهي وحدة فرعية من ubiquinol-cytochrome ج oxidoreductase انزيم، السيتوكروم ب (سيتوب)، والبروتين الريبوسومي الميتوكوندريا Var1p⁵. هذا العدد صغير، ويمكن فصل كل منهم بواسطة الكهرباء على هلام واحد في الظروف المناسبة. ثانيا، ينتمي الريبوسومات الميتوكوندريا إلى الطبقة prokaryotic بدلا من⁶eukaryotic ، وبالتالي ، فإن حساسية للمضادات الحيوية تختلف عن الريبوسومات السيتوبلازمية والخميرة الميتوكوندريا. فهو يسمح بتثبيط الترجمة السيتوبلاسميكية مع السيكلوهيكسيميIDE، وتوفير الظروف عندما يتم دمج الأحماض الأمينية المسماة⁽³⁵S-methionine) فقط في منتجات الترجمة الميتوكوندريا. ونتيجة لذلك، تعطي التجربة معلومات حول معدل دمج الأحماض الأمينية في بروتينات الميتوكوندريا التي تم تصنيعها في دي نوفو، مما يعكس الكفاءة الكلية لترجمة الميتوكوندريا لكل منتج من المنتجات الثمانية

Protocol

1. الخميرة إعداد الثقافة

1. خميرة متتالية من الثقافات المجمدة على لوحات جديدة مع المتوسطة المناسبة. وضع لوحات في حاضنة الثقافة في 30 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة.
   ملاحظة: دع المسوخ الحساسة لدرجة الحرارة تنمو في درجة الحرارة المتساهلة.
2. تلقيح الثقافات الخميرة في 2 مل من YPGal المتوسطة (2٪ peptone، 1٪ استخراج الخميرة، 2٪ galactose) من سلسلة جديدة في أنابيب 15 مل واحتضان لهم بين عشية وضحاها التحريض عند 200 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية.
3. قياس الكثافة البصرية للثقافة في طول موجة من 600 نانومتر (OD₆₀₀).
4. تأخذ حجم المقابلة لوحدات امتصاص 0.2 في أنابيب معقمة، بيليه خلايا الخميرة في 9،000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من عظمى.
5. غسل الخلايا مع 0.5 مل من الماء المعقم من خلال دوامة لمدة 5 s. بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة والتخلص من افرا. تضعف الخلايا في 2 مل من YPGal المتوسطة الطازجة.
6. احتضان التحريض عند 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية حتى يصل OD₆₀₀ إلى 1.5-1.9 قيم.
   ملاحظة: تختلف معدلات نمو الخميرة، لذلك تكون على استعداد للانتظار. من المعقول أن تتخذ الخطوات 1.3-1.6 في الصباح الباكر. وعادة ما يستغرق 4-5 ح، ولكن يمكن أن يستغرق وقتا أطول.

2 - إدماج النظائر المشعة

1. نقل حجم الثقافة المكافئ لوحدة بصرية واحدة في أنبوب microcentrifuge. تدور الأنابيب في 3000 س ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل افرا. غسل مع 0.5 مل من الماء المعقم من خلال دوامة لمدة 5 s.
   1. بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة والتخلص من افرا. Resuspend خلايا الخميرة في 0.5 مل من العازلة الترجمة العقيمة. ضع التعليق في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: العازلة الترجمة هو حل يحتوي على 2٪ جالاكتوز (ث / الخامس) و 50 mM فوسفات البوتاسيوم مع 6.0 pH.
2. إضافة cycloheximide إلى تعليق الخلية تصل إلى تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل. احتضان لمدة 5 دقائق التحريض في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمنع الترجمة السيتوسوليك.
   ملاحظة: يجب إعداد محلول Cycloheximide (20 ملغ/مل، في الإيثانول) طازجة قبل التجربة. يمكن استبدال الكلورامفينيكول بنجاح مع أنيسومايسين في نفس التركيز⁷.
3. إضافة 25-30 μCi من ³⁵S-methionine إلى تعليق الخلية واحتضان لمدة 30 دقيقة تهيج في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام خليط ^{من 35}S-methionine و ³⁵S-السيستين. ³⁵النقي S-methionine النتائج في أقوى إشارة وأفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء. عموما, الميثيونين هو أكثر فعالية من السيستين لأن محتوى هذه الأحماض الأمينية في البروتينات الميتوكوندريا هو أعلى. ومع ذلك ، فإن مزيج EasyTag من ³⁵S-methionine والسيستيين أقل تكلفة ويعطي نتائج قابلة للمقارنة⁷.
   تنبيه: ³⁵S-الميثيونين مشع. اتباع ممارسات السلامة المعتادة للتعامل مع المواد المشعة.
   ملاحظة: من المعروف أن دمج النشاط الإشعاعي يصل إلى حد يرجع إلى أن إجمالي الإشارات يكون على مستوى الزمن. وبمجرد بلوغ هذا الحد، يكاد يكون من المستحيل تحديد المعدلات التي يتم بها تصنيع منتجات الترجمة المختلفة. لتحليل معدل الترجمة الميتوكوندريا، من الضروري أن تكون في حالة تزيد فيها كثافة الإشارة مع وقت الحضانة مع ³⁵S-methionine بطريقة خطية. بالنسبة للسلالات البرية الشائعة من النوع المختبري ، فإن الإشارة مشبعة بالفعل في أوقات الحضانة أقصر بكثير من 30 دقيقة. يمكن أن تتصرف المتحولين الترجمية بشكل مختلف جدا. وينبغي أن يتم تنفيذ دورة زمنية لتحديد حركية دمج النشاط الإشعاعي وبالتالي معدل الترجمة ، على الأقل عند العمل مع سلالة جديدة. لهذا، نقترح أخذ عينات مع فاصل زمني من عدة دقائق (على سبيل المثال، 2.5، 5.0، 7،5، 10، و 20 دقيقة).
4. إضافة unlabeled "الباردة" الميثيونين (يجب أن يكون التركيز النهائي 20 mM) وpuromycine (يجب أن يكون التركيز النهائي 1-10 ميكروغرام / مل) لوقف وضع العلامات. احتضان لمدة 10 دقيقة تهيج في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لإعطاء الريبوسومات الوقت لإنهاء ترجمة الببتيدات. وإلا، سيتم الكشف عن جميع بوليبيبتيدات أقصر من كامل طول حجم مختلف. يمكن إجراء تجربة في الوقت (نبض مطاردة) في هذه الخطوة لتحديد استقرار منتجات الترجمة الميتوكوندريا. لهذا، مواصلة الحضانة أخذ عينات مع فاصل زمني من 30 دقيقة (على سبيل المثال، 30، 60، 90، و 120 دقيقة).

3. الخميرة خلية تحلل واستخراج البروتينات

1. جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 9000 س ز لمدة 30 s. اغسل الخلايا بـ 0.5 مل من الماء المعقم عن طريق الدوامة لمدة 5 ق. بيليه خلايا الخميرة في 9000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المُندفع.
   ملاحظه. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
2. إضافة 75 ميكرولتر من عازلة التحلل إلى بيليه ودوامة لمدة 5-10 s.
   ملاحظة: Lysis العازلة هو حل من 1.8 M NaOH، 1 M β-mercaptoethanol، و 1 mM PMSF في الماء. تجنب الحضانة المفرطة مع عازلة التحلل مما يؤدي إلى التحليل المائي القلوية من البروتينات. مباشرة إلى الخطوة 3.3.
3. أضف 500 ميكرولتر من 0.5 M تريس-HCl العازلة مع 6.8 pH. دوامة لفترة وجيزة.

4- هطول البروتينات

تنبيه: الميثانول والكلوروفورم مذيبات عضوية. اتبع ممارسات السلامة المعتادة للتعامل مع المواد العضوية.

1. إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. دوامة لمدة 5 s.
2. إضافة 150 μL من الكلوروفورم إلى العينة. دوامة لمدة 5 s.
3. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 2 دقيقة في 12،000 س ز. تجاهل بعناية المرحلة العليا مع العينات.
4. إضافة 600 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة. تخلط بعناية عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.
5. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 2 دقيقة في 12،000 س ز. تجاهل المُندفع.
6. الهواء الجافة بيليه لمدة 2 دقيقة في 80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يجب أن يتبخر كل السائل. هناك خطر أن يكون فصل شاذ من البروتينات في الجل إذا كان بيليه جفت بشكل غير كاف. ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن الإفراط في تجفيف بيليه، لذلك يمكن تخزينها حتى بين عشية وضحاها في 4 °C.
7. تذوب البروتينات المترسبة في 60 ميكرولتر من 1x Laemmli عينة العازلة.
8. سخني لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية.
   ملاحظة: تجنب غلي العينات عند 95 درجة مئوية، لأن هذا يسبب التجميع. إذا كانت المجاميع لا تزال تشكل، تدور العينات في 12،000 س ز لمدة 2 دقيقة وجمع افرا. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا.

5. SDS-PAGE

1. يلقي 17.5٪ Laemmli SDS-polyacrylamide هلام.
   ملاحظة: 6 م اليوريا يمكن أن تضاف إلى هلام لحل أفضل atp8 و atp9. يمكن للتدرج 15٪ – 20٪ من المواد الهلامية أيضًا إعطاء دقة أفضل.
2. قم بتحميل 15 ميكرولتر (40-50 ميكروغرام) من كل عينة في الجيوب.
   ملاحظة: ليس من الضروري قياس تركيز البروتين إذا كانت قيم OD₆₀₀ قريبة في الخطوة 1.6. إذا لم يكن كذلك، قم بقياس تركيزات البروتين باستخدام المقايسة مع الكواشف المتوافقة مع المنظفات.
3. تشغيل الجل في غرفة باردة حتى تصل الصبغة الزرقاء إلى ما يقرب من 65٪ من طول الجل.
   ملاحظة: بالنسبة للنظام المستخدم (على سبيل المثال، خلية Protean II xi)، نستخدم أي من الوضعين: 16-17 ساعة عند 5 V/cm أو 5 ساعات عند 15 V/cm. لا توجد بروتينات تعمل بشكل أسرع من الصبغة الزرقاء البروموفينول، ولكن يمكن أن يؤدي الأشواط الطويلة إلى عدم وضوح إشارات atp8 و atp9.
4. وصمة عار هلام مع Coomassie الأزرق الرائعة وجعل المسح الضوئي أو الصورة، وهو أمر مطلوب كتحكم التحميل.
   ملاحظة: هناك طريقة بديلة لإجراء التحكم في التحميل هي مناعة الجسم المضاد إلى جين "حفظ المنزل" الميتوكوندريا، على سبيل المثال، البورين 1.

6. التصوير الآلي

1. جفف الجل في مجفف هلام. احتفظ به في الكاسيت مع شاشة فوسفور تخزين لمدة 3-5 أيام.
   ملاحظة: بديل لفحص الجل المجفف هو نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز عن طريق النشاف الكهربائي وفحصه بعد ذلك. وهو يؤدي إلى إشارات أقوى ونطاقات أكثر حدة.
2. مسح الشاشة على الفوسفور إيمامر.
   ملاحظة: كبديل للتصوير الفوسفوري، يمكن أيضاً استخدام فيلم الأشعة السينية للكشف عن الإشارات.

النتائج

بعد البروتوكول المذكور أعلاه، قمنا بتعيين منتجات الترجمة الميتوكوندريا من اثنين من سلالات S. cerevisiae: النوع البرية (WT) وحذف تحمل متحولة من الجين AIM23 (AIM23Δ، ترميز عامل بدء الترجمة الميتوكوندريال 3 (الجدول 1)⁸. وقد تم تصنيف منتجات الترجمة الميتوكوندريا إش...

Discussion

تحتل تحقيقات التعبير الجيني جزءاً مركزياً في علوم الحياة الحديثة. وقد تم تطوير العديد من الأساليب التي توفر رؤى في هذه العملية المعقدة. هنا، وصفنا الطريقة التي تسمح للوصول إلى البروتين في التركيب الحيوي خميرة بيكر S. cerevisiae الميتوكوندريا. وعادة ما يتم تطبيقه لمقارنة كفاءة الترجمة من mRN...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625