Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

Riepilogo

Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.

Abstract

I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirazione aerobica. Contengono un genoma circolare e un apparato di espressione genica. Un genoma mitocondriale del lievito del fornaio codifica per otto proteine: tre subunità della citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di etichettare specificamente queste proteine con metinina ³⁵S, separarle per elettroforesi e visualizzare i segnali come bande discrete sullo schermo. La procedura prevede diversi passaggi. In primo luogo, le cellule di lievito vengono coltivate in un mezzo contenente galattosio fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica tardiva. Successivamente, il trattamento cicloeximide blocca la traduzione citoplasmatica e consente ^{l'incorporazione}di metoionina 35 S solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Quindi, tutte le proteine vengono estratte dalle cellule di lievito e separate dall'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Infine, il gel viene asciugato e incubato con lo schermo di fosforo di stoccaggio. Lo schermo viene scansionato su un fosforimager che rivela le bande. Il metodo può essere applicato per confrontare il tasso di biosintesi di un singolo polipeptide nei mitocondri di un ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico, che è utile per studiare i difetti dell'espressione genica mitocondriale. Questo protocollo fornisce preziose informazioni sul tasso di traduzione di tutti gli mRNA mitocondriali del lievito. Tuttavia, richiede diversi controlli ed esperimenti aggiuntivi per trarre conclusioni adeguate.

Introduzione

I mitocondri sono gli organelli profondamente coinvolti nel metabolismo di una cellula eucariotica. La loro catena di trasferimento di elettroni fornisce alla cellula ATP, la principale valuta energetica utilizzata in più vie biochimiche. Inoltre, sono coinvolti in apoptosi, sintesi di acidi grassi ed eme e altri processi. La disfunzione dei mitocondri è una fonte ben nota di malattia umana¹. Può derivare da mutazioni nei geni nucleari o mitocondriali che codificano componenti strutturali o regolatori degli organelli². Il lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae è un eccellente organismo modello per lo studio dell'espressione genica mitocondriale per diversi motivi. In primo luogo, il loro genoma^{è completamente sequenziato 3}, ben annotato, e una grande somma di dati è già disponibile in letteratura grazie alla lunga storia di indagini condotte con questo organismo. In secondo luogo, le manipolazioni con il loro genoma nucleare sono relativamente veloci e facili a causa del loro rapido tasso di crescita e del sistema di ricombinazione omologo altamente efficiente. In terzo luogo, il lievito di fornaio S. cerevisiae è uno dei pochi organismi per i quali vengono sviluppate le manipolazioni con genomi mitocondriali. Infine, il lievito di fornaio è un organismo facultativo aerobe-anaerobe, che consente l'isolamento e lo studio di mutanti respiratori difettosi, poiché possono crescere in mezzi contenenti fonti di carbonio fermentabili.

Descriviamo il metodo per studiare l'espressione genica mitocondriale del lievito di fornaio S. cerevisiae al livello trascizionale⁴. Il suo principio principale deriva da diverse osservazioni. In primo luogo, il genoma mitocondriale del lievito codifica solo otto proteine: tre subunità del citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p⁵. Questo numero è piccolo e tutti possono essere separati per elettroforesi su un singolo gel nelle condizioni appropriate. In secondo luogo, i ribosomi mitocondriali appartengono alla classe procariotica piuttosto che eucariotica 6 e,^quindi,la sensibilità agli antibiotici è diversa per i ribosomi citoplasmatici e mitocondriali del lievito. Permette l'inibizione della traduzione citoplasmatica con cicloeximide, fornendo le condizioni quando l'amminoacido etichettato⁽³⁵S-metonina) è incorporato solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Di conseguenza, l'esperimento fornisce informazioni sul tasso di incorporazione di amminoacidi nelle proteine mitocondriali sintetizzata de novo, riflettendo l'efficienza complessiva della traduzione mitocondriale per ciascuno degli otto prodotti

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Protocollo

1. Preparazione della coltura del lievito

1. Striature di lievito dalle colture di stock congelate su piatti freschi con il mezzo appropriato. Mettere le piastre in un incubatore di coltura a 30 °C per 24-48 ore.
   NOTA: Lascia che i mutanti sensibili alla temperatura crescano alla temperatura permissiva.
2. Inoculare le colture di lievito in 2 ml di mezzo YPGal (2% peptone, 1% estratto di lievito, 2% di galattosio) dalla striscia fresca in tubi da 15 ml e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 °C.
3. Misurare la densità ottica della coltura ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD₆₀₀).
4. Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbanza in tubi sterili, celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante.
5. Lavare le cellule con 0,5 mL di acqua sterile con vortice per 5 s. Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Diluire le cellule in 2 mL di mezzo YPGal fresco.
6. Incubare l'agitazione a 200 giri/min e 30 °C fino a quando L'OD₆₀₀ raggiunge i valori di 1,5-1,9.
   NOTA: I tassi di crescita del lievito variano, quindi preparati ad aspettare. È ragionevole fare i passi 1.3-1.6 la mattina presto. Di solito ci vogliono 4-5 ore, ma può richiedere più tempo.

2. Incorporazione di isotopi radioattivi

1. Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di microcentrifugo. Ruotare i tubi a 3.000 x g per 1 minuto e scartare il supernatante. Lavare con 0,5 mL di acqua sterile con vortice per 5 s.
   1. Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Resuspend cellule di lievito in 0,5 mL di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 ml.
      NOTA: Il tampone di traduzione è una soluzione contenente il 2% di galattosio (w/v) e 50 mM di fosfato di potassio con pH 6,0.
2. Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino ad una concentrazione finale di 0,2 mg/mL. Incubare per 5 min agitando a 200 giri/min e 30 °C per inibire la traduzione citosolica.
   NOTA: La soluzione di cicloeximide (20 mg/mL, in etanolo) deve essere preparata fresca prima dell'esperimento. Il cloramfenicolo può essere sostituito con successo con l'anisomicina nella stessa concentrazione⁷.
3. Aggiungere 25-30 μCi ^{di 35}S-metinina alla sospensione cellulare e incubare per 30 min agitando a 200 giri/min e 30 °C.
   NOTA: Può essere utilizzata anche la miscela di ³⁵S-metinina e ³⁵S-cisteina. Pure ³⁵S-methionine si traduce nel segnale più forte e nel miglior rapporto segnale-rumore. Generalmente, la metonina è più efficace della cisteina perché il contenuto di questo amminoacido nelle proteine mitocondriali è più alto. Tuttavia, la miscela EasyTag di ³⁵S-metinina e cisteina è meno costosa e dà risultati comparabili⁷.
   ATTENZIONE: ³⁵S-metinina è radioattiva. Seguire le consuete pratiche di sicurezza per la manipolazione di materiali radioattivi.
   NOTA: È noto che l'incorporazione della radioattività raggiunge un limite a causa del quale i segnali totali si livellano nel tempo. Una volta raggiunto questo limite, è quasi impossibile determinare le tariffe con cui vengono sintetizzati i diversi prodotti di traduzione. Per analizzare il tasso di traslazione mitocondriale, è imperativo essere in una condizione in cui l'intensità del segnale aumenta con il tempo di incubazione ^{con 35}S-metionina in modo lineare. Per i comuni ceppi di laboratorio di tipo selvatico, il segnale è già saturo per tempi di incubazione molto più brevi dei 30 minuti. I mutanti traslizionali possono comportarsi in modo molto diverso. Si dovrebbe eseguire un corso di tempo per stabilire la cinetica dell'incorporazione di radioattività e quindi il ritmo di traduzione, almeno quando si lavora con un nuovo ceppo. Per questo, si consiglia di prelevare campioni con un intervallo di diversi minuti (ad esempio, 2,5, 5,0, 7,5, 10 e 20 minuti).
4. Aggiungere metinina "fredda" senza etichetta (la concentrazione finale deve essere di 20 mM) e puromicina (la concentrazione finale deve essere di 1-10 μg/mL) per interrompere l'etichettatura. Incubare per 10 min agitando a 200 giri/min e 30 °C.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per dare ai ribosomi il tempo di finire di tradurre i peptidi. In caso contrario, tutti i polipeptidi più corti della lunghezza intera verranno rilevati con dimensioni diverse. Un esperimento a tempo (pulse-chase) può essere fatto in questo passaggio per determinare la stabilità dei prodotti di traduzione mitocondriale. Per questo, continuare l'incubazione prelevare campioni con un intervallo di 30 min (ad esempio, 30, 60, 90 e 120 min).

3.Lisi cellulare del lievito ed estrazione di proteine

1. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 x g per 30 s. Lavare le cellule con 0,5 mL di acqua sterile vortice per 5 s. Cellule di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente. Scartare il supernatante.
   nota. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni a -20 °C.
2. Aggiungere 75 μL di tampone dilisi al pellet e al vortice per 5-10 s.
   NOTA: Il tampone di lysis è una soluzione di 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanolo e 1 mM PMSF in acqua. Evitare un'eccessiva incubazione con tampone di lisi che porta all'idrolisi alcalina delle proteine. Procedere immediatamente al passaggio 3.3.
3. Aggiungere 500 μL di tampone Tris-HCl da 0,5 M con pH 6,8. Vortice brevemente.

4. Precipitazione delle proteine

ATTENZIONE: Metanolo e cloroformio sono solventi organici. Seguire le consuete pratiche di sicurezza per la manipolazione di sostanze organiche.

1. Aggiungere 600 μL di metanolo al campione. Vortice per 5 s.
2. Aggiungere 150 μL di cloroformio al campione. Vortice per 5 s.
3. Centrifugare i campioni per 2 min a 12.000 x g. Scartare con cura la fase superiore con un campionatore.
4. Aggiungere 600 μL di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte.
5. Centrifugare i campioni per 2 min a 12.000 x g. Scartare il supernatante.
6. Asciugare all'aria il pellet per 2 min a 80 °C.
   NOTA: Tutto il liquido deve evaporare. C'è il rischio di avere una separazione aberrante delle proteine nel gel se il pellet è stato asciugato in modo insufficiente. Tuttavia, non è possibile asciugare troppo il pellet, quindi può anche essere conservato durante la notte a 4 °C.
7. Sciogliere le proteine precipitate in 60 μL di 1 tampone campione di Laemmli.
8. Riscaldare per 10 min a 40 °C.
   NOTA: Evitare di bollire i campioni a 95 °C, perché ciò causa aggregazione. Se gli aggregati si formano ancora, ruotare i campioni a 12.000 x g per 2 minuti e raccogliere il supernatante. I campioni possono essere conservati a -20 °C. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

5. PAGINA SDS

1. Lanciare il gel Laemmli SDS-poliacrilammide al 17,5%.
   NOTA: 6 M di urea possono essere aggiunti al gel per risolvere meglio atp8 e atp9. Gradiente 15%-20% gel può anche dare una migliore risoluzione.
2. Caricare 15 μL (40-50 μg) di ogni campione nelle tasche.
   NOTA: Non è necessario misurare la concentrazione proteica se i valori di OD₆₀₀ erano vicini al passaggio 1.6. In caso meno, misurare le concentrazioni proteiche utilizzando il saggio con reagenti compatibili con i detergenti.
3. Eseguire il gel in una cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della lunghezza del gel.
   NOTA: Per il sistema utilizzato (ad esempio, protean II xi cell), usiamo una delle due modalità: 16-17 h a 5 V / cm o 5 h a 15 V / cm. Nessuna proteine corre più veloce del colorante blu bromofenolo, ma le lunghe corse possono causare la sfocatura dei segnali Atp8 e Atp9.
4. Macchiare il gel con Coomassie blu brillante e fare una scansione o una foto, che è necessaria come controllo di carico.
   NOTA: Un modo alternativo per effettuare un controllo del carico è l'immunoblotting con un anticorpo contro il gene mitocondriale "house-keeping", ad esempio porina 1.

6. Autorarografia

1. Asciugare il gel in un gel-essiccatore. Tienilo nella cassetta con uno schermo di fosforo di archiviazione per 3-5 giorni.
   NOTA: Un'alternativa allo screening del gel essiccato è il trasferimento di proteine a una membrana di nitrocellulosa mediante elettroblotting e screening in seguito. Si traduce in segnali più forti e bande più nitide.
2. Scansiona lo schermo su un fosforimager.
   NOTA: In alternativa all'imaging al fosforo, la pellicola a raggi X può anche essere utilizzata per rivelare i segnali.

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Risultati

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di S. cerevisiae: il tipo selvatico (WT) e una cancellazione mutante del gene AIM23 (AIM23Δ), codificando il fattore di iniziazione alla traduzione mitocondriale 3 (Tabella 1)⁸. I prodotti di traduzione mitocondriale sono stati etichettati e separati radioattivamente in SDS-PAAG9. I campioni sono stati raccolti ogni 2,5 minuti prima della...

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Discussione

Le indagini sull'espressione genica occupano una parte centrale nelle moderne scienze della vita. Sono stati sviluppati numerosi metodi che forniscono informazioni su questo complesso processo. Qui, abbiamo descritto il metodo che consente di accedere alla biosintesi proteica nel lievito di fornaio S. cerevisiae mitochondria. Di solito viene applicato per confrontare le efficienze di traduzione degli mRNA nei mitocondri del ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico per accedere alle conseguenze della m...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625