Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Özet

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Özet

Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. Dairesel genom ve gen ifade aparatı içerirler. Fırıncı mayasının mitokondriyal genomları sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enzimi, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p'nin bir alt bölümüdür. Burada açıklanan yöntemin amacı, bu proteinleri özellikle ³⁵S metiyonin ile etiketlemek, elektroforez ile ayırmak ve sinyalleri ekranda ayrık bantlar olarak görselleştirmektir. Yordam birkaç adım içerir. İlk olarak, maya hücreleri geç logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar galaktoz içeren bir ortamda kültürlenir. Daha sonra, sikloeximide tedavisi sitoplazmik çeviriyi engeller ve sadece mitokondriyal çeviri ürünlerinde ³⁵S metiyonin birleştirilmesine izin verir. Daha sonra, tüm proteinler maya hücrelerinden çıkarılır ve poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır. Son olarak, jel kurutulur ve depolama fosfor ekranı ile inkübe edilir. Ekran, bantları ortaya çıkaran bir fosforimager üzerinde taranır. Yöntem, bir mutant maya suşunun mitokondrilerindeki tek bir polipeptitin biyosentez oranını, mitokondriyal gen ekspresyon kusurlarını incelemek için yararlı olan vahşi tiple karşılaştırmak için uygulanabilir. Bu protokol, tüm maya mitokondriyal mRNA'ların çeviri oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, uygun sonuçlara varmak için çeşitli kontroller ve ek deneyler gerektirir.

Giriş

Mitokondriler, ökaryotik bir hücrenin metabolizmasında derinden yer alan organellerdir. Elektron transfer zincirleri hücreye birden fazla biyokimyasal yolda kullanılan ana enerjik para birimi olan ATP'yi sağlar. Ayrıca, apoptoz, yağ asidi ve heme sentezi ve diğer süreçlerde yer almaktadırlar. Mitokondri disfonksiyonu iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır¹. Organellerin yapısal veya düzenleyici bileşenlerini kodlayan nükleer veya mitokondriyal genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir². Fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae, çeşitli nedenlerden dolayı mitokondriyal gen ekspresyonunu incelemek için mükemmel bir model organizmadır. İlk olarak, genomları tamamen^{sıralanmıştır 3}, iyi açıklamalı ve bu organizma ile yürütülen uzun araştırma geçmişi sayesinde literatürde büyük miktarda veri zaten mevcuttur. İkincisi, nükleer genomları ile yapılan manipülasyonlar, hızlı büyüme hızları ve yüksek verimli homolog rekombinasyon sistemleri nedeniyle nispeten hızlı ve kolaydır. Üçüncüsü, fırıncı mayası S. cerevisiae, mitokondriyal genomlarla manipülasyonların geliştirildiği birkaç organizmadan biridir. Son olarak, fırıncı mayası, fermente edilebilir karbon kaynakları içeren medyada büyüyebilecekleri için solunum kusurlu mutantların izolasyonu ve incelenmesine izin veren aerobe-anaerobe öğretim üyesi bir organizmadır.

Çeviri^düzeyindebaker mayası S. cerevisiae'nin mitokondriyal gen ekspresyonunu inceleme yöntemini açıklıyoruz. Ana prensibi çeşitli gözlemlerden gelir. İlk olarak, maya mitokondriyal genom sadece sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enziminin bir alt bölümü, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p⁵. Bu sayı küçüktür ve hepsi uygun koşullarda tek bir jel üzerinde elektroforezi ile ayrılabilir. İkincisi, mitokondriyal ribozomlar ökaryotik⁶yerine prokaryotik sınıfa aittir ve bu nedenle maya sitoplazmik ve mitokondriyal ribozomlar için antibiyotiklere duyarlılık farklıdır. Etiketli amino asidin⁽³⁵S-metiyonin) sadece mitokondriyal çeviri ürünlerine dahil edildiği koşulları sağlayarak sikloseksüel ile sitoplazmik çevirinin inhibisyonunu sağlar. Sonuç olarak, deney, sekiz ürünün her biri için mitokondriyal çevirinin genel verimliliğini yansıtan, sentezlenen de novo sentezlenen mitokondriyal proteinlerde amino asit indüklenme oranı hakkında bilgi verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Maya kültürü hazırlığı

1. Donmuş stok kültürlerinden uygun ortama sahip taze tabaklarda maya serin. Plakaları 24-48 saat boyunca 30 °C'de bir kültür inkübatöre koyun.
   NOT: Sıcaklığa duyarlı mutantların izin verilen sıcaklıkta büyümesine izin verin.
2. Maya kültürlerini 15 mL tüplerdeki taze çizgiden 2 mL YPGal ortamında (%2 pepton, %1 maya özü, %2 galaktoz) aşılayın ve 30 °C'de 200 rpm'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya bırakın.
3. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nm (OD₆₀₀₎dalga boyunda ölçün.
4. Steril tüplerde 0,2 absorbans ünitesine karşılık gelen hacmi, oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücrelerini alın ve üstnatant atın.
5. Hücreleri 5 sn boyunca girdaplayarak 0,5 mL steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Hücreleri 2 mL taze YPGal ortamında seyreltin.
6. OD 600 1,5–1,9 değerlerine ulaşana kadar₂₀₀ rpm ve 30 °C'de ajitasyon yapan kuluçkalayın.
   NOT: Maya büyüme oranları değişir, bu yüzden beklemeye hazır olun. Sabahın erken saatlerinde 1.3–1.6 adımlarını atmak mantıklıdır. Genellikle 4-5 saat sürer, ancak daha uzun sürebilir.

2. Radyoaktif izotop şirketleşme

1. Bir mikrosantrifüj tüpünde bir optik üniteye eşdeğer kültür hacmini aktarın. Tüpleri 1 dakika boyunca 3.000 x g'da döndürün ve süpernatant atın. 5 sn boyunca girdap yaparak 0,5 mL steril su ile yıkayın.
   1. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Maya hücrelerini 0,5 mL steril çeviri tamponunda yeniden biriktirin. Süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
      NOT: Çeviri tamponu, pH 6.0 ile %2 galaktoz (w/v) ve 50 mM potasyum fosfat içeren bir çözeltidir.
2. Hücre süspansiyonuna 0,2 mg/mL'lik son konsantrasyona kadar sikloeximid ekleyin. Sitosolik çeviriyi inhibe etmek için 200 rpm ve 30 °C'de 5 dakika ajitasyon için kuluçkaya yatırın.
   NOT: Cycloheximide çözeltisi (etanolde 20 mg/mL) deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. Kloramfenikol aynı konsantrasyonda anisomycin ile başarıyla^{değiştirilebilir 7}.
3. Hücre süspansiyonu için 25-30 ^{μCi 35}S-metiyonin ekleyin ve 200 rpm ve 30 °C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
   NOT: ³⁵S-metiyonin ve ³⁵S-sistein karışımı da kullanılabilir. Saf ³⁵S-methionine en güçlü sinyal ve en iyi sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır. Genellikle, metiyonin sisteinden daha etkilidir, çünkü bu amino asidin mitokondriyal proteinlerdeki içeriği daha yüksektir. Bununla birlikte, ^{EasyTag 35}S-metiyonin ve sistein karışımı daha ucuzdur ve karşılaştırılabilir sonuçlar verir⁷.
   DİkKAT: ³⁵S-metiyonin radyoaktiftir. Radyoaktif maddelerin kullanımı için olağan güvenlik uygulamalarını takip edin.
   NOT: Radyoaktivitenin birleştirilmesinin, toplam sinyallerin zaman içinde seviye atladığı bir sınıra ulaştığı iyi bilinmektedir. Bu sınıra ulaşıldıktan sonra, farklı çeviri ürünlerinin sentezlenme oranlarını belirlemek neredeyse imkansızdır. Mitokondriyal çeviri oranını analiz etmek için, doğrusal bir şekilde ³⁵S-metiyonin ile inkübasyon süresi ile sinyal yoğunluğunun arttığı bir durumda olmak zorunludur. Yaygın laboratuvar vahşi tipi suşlar için sinyal, 30 dakikadan çok daha kısa kuluçka süreleri için zaten doymuş durumdadır. Çevirisel mutantlar çok farklı davranabilir. En azından yeni bir suşla çalışırken radyoaktivite birliğinin kinetiğini ve dolayısıyla çeviri oranını belirlemek için bir zaman kursu yapılmalıdır. Bunun için birkaç dakika (örneğin, 2,5, 5,0, 7,5, 10 ve 20 dk) aralıklarla numune almanızı öneririz.
4. Etiketlemeyi durdurmak için etiketsiz "soğuk" metiyonin (son konsantrasyon 20 mM olmalıdır) ve puromisin (son konsantrasyon 1–10 μg / mL olmalıdır) ekleyin. 200 rpm ve 30 °C'de 10 dakika ajitasyon için kuluçkaya yaslanın.
   NOT: Bu adım ribozomlara peptitleri çevirmeyi bitirmeleri için zaman vermek için kritik öneme sahiptir. Aksi takdirde, tam boydan daha kısa tüm polipeptitler farklı bir boyutta tespit edilecektir. Mitokondriyal çeviri ürünlerinin stabilitesini belirlemek için bu adımda bir zaman kursu deneyi (nabız takibi) yapılabilir. Bunun için 30 dakika (örneğin, 30, 60, 90 ve 120 dk) aralıklarla numune almaya devam edin.

3. Maya hücre lizisi ve proteinlerin çıkarılması

1. Maya hücrelerini 30 s için 9.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri 5 sn boyunca girdaplayarak 0,5 mL steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri. Üstnatant atın.
   Not. Protokol burada duraklatılabilir. Numuneleri -20 °C'de saklayın.
2. 5-10 sn boyunca pelet ve girdap için 75 μL lizis tamponu ekleyin.
   NOT: Lizis tamponu suda 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol ve 1 mM PMSF çözeltisidir. Proteinlerin alkali hidrolizine yol açan lizis tamponu ile aşırı inkübasyondan kaçının. Hemen 3.3 adımına geçin.
3. pH 6.8 ile 500 μL 0.5 M Tris-HCl tampon ekleyin. Kısaca Girdap.

4. Proteinlerin çökelttiri

DİkKAT: Metanol ve kloroform organik çözücülerdir. Organik maddelerin kullanımı için olağan güvenlik uygulamalarını takip edin.

1. Numuneye 600 μL metanol ekleyin. 5 sn için girdap.
2. Numuneye 150 μL kloroform ekleyin. 5 sn için girdap.
3. Numuneleri 12.000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Üst fazı bir örnekleyici ile dikkatlice atın.
4. Numuneye 600 μL metanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın.
5. Numuneleri 12.000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Üstnatant atın.
6. Peletin hava ile 80 °C'de 2 dakika kurutun.
   NOT: Tüm sıvı buharlaşmalıdır. Pelet yetersiz kurutulmuşsa jeldeki proteinlerin sapkın bir şekilde ayrılması riski vardır. Bununla birlikte, peletin aşırı kurutılması mümkün değildir, bu nedenle bir gecede 4 ° C'de bile saklanabilir.
7. Çökülen proteinleri 60 μL 1x Laemmli numune tamponunda çözün.
8. 40 °C'de 10 dakika ısıtın.
   NOT: Numuneleri 95 °C'de kaynatmaktan kaçının, çünkü bu toplama neden olur. Agregalar hala oluşuyorsa, örnekleri 2 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve süpernatant toplayın. Numuneler -20 °C'de saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.

5. SDS SAYFASI

1. %17,5 Laemmli SDS-poliakrilamid jelini atın.
   NOT: Daha iyi atp8 ve atp9 çözmek için jel içine 6 M üre eklenebilir. Degrade %15-%20 jeller de daha iyi çözünürlük sağlayabilir.
2. Ceplerdeki her numunenin 15 μL'sini (40-50 μg) yükleyin.
   NOT: OD_{600 değerleri 1.6.} Değilse, deterjan uyumlu reaktiflerle tahlil kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün.
3. Mavi boya jel uzunluğunun yaklaşık% 65'ine ulaşana kadar jeli soğuk bir odada çalıştırın.
   NOT: Kullanılan sistem için (örneğin, Protean II xi hücresi), iki moddan birini kullanırız: 5 V/cm'de 16-17 saat veya 15 V/cm'de 5 saat. Hiçbir protein bromofenol mavi boyasından daha hızlı çalışmaz, ancak uzun çalışma atp8 ve atp9 sinyallerinin bulanıklığına neden olabilir.
4. Jeli Coomassie parlak mavi ile lekelendirin ve yükleme kontrolü olarak gerekli olan bir tarama veya fotoğraf yapın.
   NOT: Yükleme kontrolü yapmanın alternatif bir yolu, örneğin porin 1 gibi mitokondriyal "ev tutma" genine karşı bir antikor ile immünblottingdir.

6. Otoradyografi

1. Jeli bir jel kurutucuda kurutun. 3-5 gün boyunca bir depolama fosfor ekranı ile kasette saklayın.
   NOT: Kurutulmuş jelin taranmasının bir alternatifi, proteinlerin elektro-şişkinlik ve daha sonra taranarak nitroselüloz bir zara aktarılmasıdır. Daha güçlü sinyaller ve daha keskin bantlarla sonuçlanır.
2. Ekranı fosforimager üzerinde tarayın.
   NOT: Fosfor görüntülemeye alternatif olarak, sinyalleri ortaya çıkarmak için X-ışını filmi de kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki S. cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık: vahşi tip (WT) ve AIM23 geninin ( AIM23Δ ) silinmesini taşıyan bir mutant), kodlama mitokondriyal çeviri başlatma faktörü 3 (Tablo 1)⁸. Mitokondriyal çeviri ürünleri radyoaktif olarak etiketlendi ve SDS-PAAG9'da ayrıldı. Örnekler, bir zaman kursu oluşturmak için doygunluk öncesinde her 2,5 dakikada bir toplanmışt?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gen ekspresyasyonu incelemeleri modern yaşam bilimlerinde merkezi bir yer kaplar. Bu karmaşık süreç hakkında fikir veren çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Burada, fırıncı mayası S. cerevisiae mitokondrisinde protein biyosentezine erişmeye izin verme yöntemini tanımladık. Genellikle mutant maya suşunun mitokondrilerindeki mRNA'ların çeviri verimliliklerini, çalışılan mutasyonun sonuçlarına erişmek için vahşi tipe karşı karşılaştırmak için uygulanır. Bu, araştırmacıları...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625