Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Resumo

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Resumo

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Eles contêm genoma circular e aparelho de expressão genética. Um genoma mitocondrial da levedura do padeiro codifica oito proteínas: três subunidades do citocromome c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb) e proteína ribossômica mitocondrial Var1p. O objetivo do método descrito aqui é rotular especificamente essas proteínas com methionina ³⁵S, separá-las por eletroforese e visualizar os sinais como bandas discretas na tela. O procedimento envolve várias etapas. Primeiro, as células de levedura são cultivadas em um meio contendo galactose até chegarem ao estágio de crescimento logarítmico tardio. Em seguida, o tratamento de cicloheximida bloqueia a tradução citoplasmática e permite a incorporação de metionina ³⁵S apenas em produtos de tradução mitocondrial. Em seguida, todas as proteínas são extraídas de células de levedura e separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Finalmente, o gel é seco e incubado com a tela de fósforo de armazenamento. A tela é escaneada em um fosphorimager revelando as bandas. O método pode ser aplicado para comparar a taxa de biossíntese de um único polipeptídeo nas mitocôndrias de uma cepa de levedura mutante versus o tipo selvagem, o que é útil para estudar defeitos de expressão genética mitocondrial. Este protocolo fornece informações valiosas sobre a taxa de tradução de todas as mRNAs mitocondrial de leveduras. No entanto, requer vários controles e experimentos adicionais para tirar conclusões adequadas.

Introdução

Mitocôndrias são as organelas profundamente envolvidas no metabolismo de uma célula eucariótica. Sua cadeia de transferência de elétrons fornece a célula com ATP, a principal moeda energética usada em múltiplas vias bioquímicas. Além disso, estão envolvidos em apoptose, ácido graxo e síntese de heme, entre outros processos. A disfunção das mitocôndrias é uma fonte bem conhecida da doença humana¹. Pode resultar de mutações em genes nucleares ou mitocondriais codificando componentes estruturais ou regulatórios das organelas². O saccharomyces cerevisiae de baker é um excelente organismo modelo para estudar a expressão genética mitocondrial devido a várias razões. Primeiro, seu genoma é completamente sequenciado³, bem anotado, e uma grande soma de dados já está disponível na literatura graças à longa história de investigações realizadas com esse organismo. Em segundo lugar, as manipulações com seu genoma nuclear são relativamente rápidas e fáceis devido à sua taxa de crescimento rápido e sistema de recombinação homólogo altamente eficiente. Em terceiro lugar, a levedura de padeiro S. cerevisiae é um dos poucos organismos para os quais as manipulações com genomas mitocondriais são desenvolvidas. Finalmente, a levedura do padeiro é um organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite o isolamento e o estudo de mutantes com defeito respiratório, uma vez que eles podem crescer em mídia contendo fontes de carbono fermentáveis.

Descrevemos o método para estudar a expressão genética mitocondrial da levedura de padeiro S. cerevisiae no nível translacional⁴. Seu princípio principal vem de várias observações. Primeiro, o genoma mitocondrial da levedura codifica apenas oito proteínas: três subunidades do citocromo c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb), e proteína ribossômica mitocondrial Var1p⁵. Este número é pequeno, e todos eles podem ser separados por eletroforese em um único gel nas condições apropriadas. Em segundo lugar, ribossomos mitocondriais pertencem à classe procariótica em vez de eucariótico⁶, e, portanto, a sensibilidade aos antibióticos é diferente para ribossmos citoplasmáticos e mitocondriais de levedura. Permite a inibição da tradução citoplasmática com cicloheximida, proporcionando as condições quando o aminoácido rotulado (³⁵S-methionina) é incorporado apenas em produtos de tradução mitocondrial. Como resultado, o experimento fornece informações sobre a taxa de incorporação de aminoácidos em proteínas mitocondriais sintetizadas de novo, refletindo a eficiência global da tradução mitocondrial para cada um dos oito produtos

Protocolo

1. Preparação da cultura da levedura

1. Leveduras de listras das culturas de estoque congelado em placas frescas com o meio apropriado. Coloque as placas em uma incubadora de cultura a 30 °C para 24-48 h.
   NOTA: Deixe os mutantes sensíveis à temperatura crescerem na temperatura permissiva.
2. Culturas de levedura inoculada em 2 mL de meio YPGal (2% peptone, 1% extrato de levedura, 2% galactose) da raia fresca em tubos de 15 mL e incubar-as durante a noite agitando a 200 rpm a 30 °C.
3. Meça a densidade óptica da cultura em um comprimento de onda de 600 nm (OD₆₀₀).
4. Pegue o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em tubos estéreis, células de levedura de pelotização a 9.000 x g para 30 s em temperatura ambiente e descarte o supernasce.
5. Lave células com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s. Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células diluís em 2 mL de meio YPGal fresco.
6. Incubar agitação a 200 rpm e 30 °C até OD₆₀₀ atingir 1,5-1,9 valores.
   NOTA: As taxas de crescimento da levedura variam, por isso esteja preparado para esperar. É razoável fazer as etapas 1.3-1.6 no início da manhã. Geralmente leva de 4 a 5 h, mas pode demorar mais.

2. Incorporação de isótopos radioativos

1. Transfira o volume de cultura equivalente a uma unidade óptica em um tubo de microcentrifuuagem. Gire os tubos a 3.000 x g por 1 min e descarte o supernaspe. Lave com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s.
   1. Células de levedura de pelota a 9.000 x g por 30 s em temperatura ambiente e descartam o supernasce. Células de levedura resuspend em 0,5 mL de tampão de tradução estéril. Coloque a suspensão em um tubo de 15 mL.
      NOTA: O buffer de tradução é uma solução que contém 2% de galactose (c/v) e fosfato de potássio de 50 mM com pH 6.0.
2. Adicione cicloheximida à suspensão celular até uma concentração final de 0,2 mg/mL. Incubar por 5 min agitando a 200 rpm e 30 °C para inibir a tradução citosolica.
   NOTA: A solução de cicloheximida (20 mg/mL, no etanol) deve ser preparada fresca antes do experimento. O clorofenicol pode ser substituído com sucesso por anisomicina na mesma concentração⁷.
3. Adicione 25-30 μCi de ³⁵S-methionine à suspensão celular e incubar por 30 min agitando a 200 rpm e 30 °C.
   NOTA: A mistura de ³⁵S-methionine e ³⁵S-cisteína também pode ser usada. Pure ³⁵S-methionine resulta no sinal mais forte e na melhor relação sinal-ruído. Geralmente, a methionina é mais eficaz que a cisteína porque o conteúdo deste aminoácido em proteínas mitocondriais é maior. No entanto, a mistura EasyTag de ³⁵S-methionina e cisteína é menos cara e dá resultados comparáveis⁷.
   ATENÇÃO: ³⁵S-methionina é radioativa. Siga as práticas habituais de segurança para o manuseio de materiais radioativos.
   NOTA: É sabido que a incorporação da radioatividade atinge um limite devido ao qual o nível total de sinais se nivela ao longo do tempo. Uma vez alcançado esse limite, é quase impossível determinar as taxas pelas quais os diferentes produtos de tradução são sintetizados. Para analisar a taxa de tradução mitocondrial, é imprescindível estar em uma condição em que a intensidade do sinal aumenta com o tempo de incubação com ³⁵S-metionina de forma linear. Para cepas de laboratório comuns, o sinal já está saturado para tempos de incubação muito mais curtos do que os 30 minutos. Mutantes translacionais podem se comportar de forma muito diferente. Um curso-período deve ser realizado para estabelecer a cinética da incorporação da radioatividade e, portanto, a taxa de tradução, pelo menos quando se trabalha com uma nova cepa. Para isso, sugerimos a coleta de amostras com um intervalo de vários minutos (por exemplo, 2,5, 5,0, 7,5, 10 e 20 min).
4. Adicione methionina "fria" sem rótulo (concentração final deve ser de 20 mM) e puromycine (concentração final deve ser de 1-10 μg/mL) para parar a rotulagem. Incubar por 10 min agitando a 200 rpm e 30 °C.
   NOTA: Este passo é fundamental para dar tempo aos ribossomos para terminar a tradução dos peptídeos. Caso contrário, todos os polipeptídeos mais curtos do que o comprimento total serão detectados em um tamanho diferente. Um experimento de curso de tempo (pulse-chase) pode ser feito nesta etapa para determinar a estabilidade dos produtos de tradução mitocondrial. Para isso, continue a incubação coletando amostras com um intervalo de 30 minutos (por exemplo, 30, 60, 90 e 120 min).

3. Lise celular de levedura e extração de proteínas

1. Coletar células de levedura por centrifugação a 9.000 x g para 30 s. Lave as células com 0,5 mL de água estéril por vórtice para 5 s. Células de levedura de pelota a 9.000 x g para 30 s em temperatura ambiente. Descarte o supernaspeso.
   nota. O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene as amostras a -20 °C.
2. Adicione 75 μL de tampão de lise à pelota e vórtice para 5-10 s.
   NOTA: O tampão de lise é uma solução de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanol e 1 mM PMSF na água. Evite a incubação excessiva com tampão de lise levando à hidrólise alcalina das proteínas. Imediatamente prossiga para a etapa 3.3.
3. Adicione 500 μL de 0,5 M Tris-HCl buffer com pH 6.8. Vórtice brevemente.

4. Precipitação de proteínas

ATENÇÃO: Metanol e clorofórmio são solventes orgânicos. Siga as práticas habituais de segurança para o manuseio de substâncias orgânicas.

1. Adicione 600 μL de metanol à amostra. Vórtice para 5 s.
2. Adicione 150 μL de clorofórmio à amostra. Vórtice para 5 s.
3. Centrifugar as amostras por 2 min a 12.000 x g. Descarte cuidadosamente a fase superior com um sampler.
4. Adicione 600 μL de metanol à amostra. Misture cuidadosamente invertendo o tubo várias vezes.
5. Centrifugar as amostras por 2 min a 12.000 x g. Descarte o supernaspeso.
6. Seque a pelota por 2 min a 80 °C.
   NOTA: Todo o líquido deve evaporar. Há o risco de ter uma separação aberrante de proteínas no gel se a pelota foi seca insuficientemente. No entanto, não é possível secar demais a pelota, por isso pode até ser armazenada durante a noite a 4 °C.
7. Dissolver proteínas precipitadas em 60 μL de 1x tampão amostral de Laemmli.
8. Aqueça por 10 min a 40 °C.
   NOTA: Evite ferver as amostras a 95 °C, pois isso causa agregação. Se os agregados ainda se formarem, gire as amostras a 12.000 x g por 2 min e colete o supernaspeso. As amostras podem ser armazenadas a -20 °C. O protocolo pode ser pausado aqui.

5. SDS-PAGE

1. Elenco o gel de 17,5% Laemmli SDS-poliacrilamida.
   NOTA: 6 M de ureia pode ser adicionada ao gel para resolver melhor ATP8 e ATP9. Gradient 15%-20% géis também podem dar melhor resolução.
2. Carregar 15 μL (40-50 μg) de cada amostra nos bolsos.
   NOTA: Não é necessário medir a concentração proteica se os valores de₆₀₀ OD estavam próximos na etapa 1.6. Caso não, meça as concentrações proteicas utilizando o ensaio com reagentes compatíveis com detergente.
3. Execute o gel em uma sala fria até que o corante azul atinja aproximadamente 65% do comprimento do gel.
   NOTA: Para o sistema utilizado (por exemplo, célula Protean II xi), usamos qualquer um dos dois modos: 16-17 h a 5 V/cm ou 5 h a 15 V/cm. Nenhuma proteína corre mais rápido que o corante azul bromofenol, mas longas corridas podem resultar em borrão de sinais atp8 e atp9.
4. Manche o gel com coomassie azul brilhante e faça uma varredura ou foto, que é necessária como um controle de carregamento.
   NOTA: Uma maneira alternativa de fazer um controle de carregamento é a imunoblotação com um anticorpo para o gene mitocondrial "house-keeping", por exemplo, porin 1.

6. Autordiografia

1. Seque o gel em uma secadora de gel. Mantenha-o no com uma tela de fósforo de armazenamento por 3-5 dias.
   NOTA: Uma alternativa para a triagem do gel seco é a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose por eletro-mancha e triagem posteriormente. Resulta em sinais mais fortes e bandas mais nítidas.
2. Escaneie a tela em um fósforo.
   NOTA: Como alternativa à imagem de fósforo, a película de raios-X também pode ser usada para revelar os sinais.

Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de S. cerevisiae: o tipo selvagem(WT) e uma exclusão de rolamento mutante do gene AIM23 (AIM23Δ),codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial 3(Tabela 1)⁸. Os produtos de tradução mitocondrial foram rotulados radioativamente e separados em SDS-PAAG9. As amostras foram coletadas a cada 2,5 minutos antes da saturação para a con...

Discussão

Investigações de expressão genética ocupam uma parte central nas ciências da vida moderna. Inúmeros métodos que fornecem insights sobre esse processo complexo foram desenvolvidos. Aqui, descrevemos o método que permite acessar a biossíntese proteica na levedura s. cerevisiae mitocôndrias. Geralmente é aplicado para comparar a eficiência de tradução dos mRNAs em mitocôndrias de levedura mutante versus tipo selvagem para acessar as consequências da mutação estudada. Este é um dos experimentos b?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625