Kennzeichnung und Visualisierung von mitochondrialen Genomexpressionsprodukten in Baker es Yeast Saccharomyces cerevisiae

Zusammenfassung

Bakers Hefe mitochondriales Genom kodiert acht Polypeptide. Das Ziel des aktuellen Protokolls ist es, sie alle zu beschriften und anschließend als separate Bänder zu visualisieren.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind essentielle Organellen von eukaryotischen Zellen, die aerobe Atmung können. Sie enthalten kreisförmige Genom- und Genexpressionsapparate. Ein mitochondriales Genom der Bäckerhefe kodiert acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-C-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondrialem ribosomalem Protein Var1p. Der Zweck der hier beschriebenen Methode ist es, diese Proteine gezielt mit ³⁵S Methionin zu kennzeichnen, sie durch Elektrophorese zu trennen und die Signale als diskrete Bänder auf dem Bildschirm zu visualisieren. Das Verfahren umfasst mehrere Schritte. Zunächst werden Hefezellen in einem Galaktose-haltigen Medium kultiviert, bis sie das späte logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Als nächstes blockiert die Cycloheximid-Behandlung die zytoplasmatische Translation und erlaubt ³⁵S-Methionin-Einarbeitung nur in mitochondriale Translationsprodukte. Anschließend werden alle Proteine aus Hefezellen extrahiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Schließlich wird das Gel getrocknet und mit dem Speicherphosphor-Bildschirm inkubiert. Der Bildschirm wird auf einem Phosphorimager gescannt, der die Bänder enthüllt. Die Methode kann angewendet werden, um die Biosyntheserate eines einzelnen Polypeptids in der Mitochondrie eines mutierten Hefestamms mit dem Wildentyp zu vergleichen, der für die Untersuchung von mitochondrialen Genexpressionsdefekten nützlich ist. Dieses Protokoll liefert wertvolle Informationen über die Übersetzungsrate aller Hefe mitochondrialen mRNAs. Es erfordert jedoch mehrere Kontrollen und zusätzliche Experimente, um richtige Schlussfolgerungen zu ziehen.

Einleitung

Mitochondrien sind die Organellen, die tief in den Stoffwechsel einer eukaryotischen Zelle involviert sind. Ihre Elektronentransferkette versorgt die Zelle mit ATP, der wichtigsten energetischen Währung, die in mehreren biochemischen Bahnen verwendet wird. Außerdem sind sie an Apoptose, Fettsäure- und Hämsynthese und anderen Prozessen beteiligt. Dysfunktion der Mitochondrien ist eine bekannte Quelle der menschlichen Krankheit¹. Es kann aus Mutationen in nuklearen oder mitochondrialen Genen resultieren, die strukturelle oder regulatorische Komponenten der Organellen kodieren². Bakers Hefe Saccharomyces cerevisiae ist aus mehreren Gründen ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung der mitochondrialen Genexpression. Erstens ist ihr Genom vollständig sequenziert³, gut annotiert, und eine große Summe von Daten ist bereits in der Literatur dank der langen Geschichte der Untersuchungen mit diesem Organismus durchgeführt. Zweitens sind die Manipulationen mit ihrem Kerngenom aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und ihres hocheffizienten homologen Rekombinationssystems relativ schnell und einfach. Drittens ist die Bäckerhefe S. cerevisiae einer der wenigen Organismen, für die die Manipulationen mit mitochondrialen Genomen entwickelt werden. Schließlich ist Bäckerhefe ein aerobe-anaerobe fakultativer Organismus, der die Isolierung und Untersuchung von atemmedizinischen defekten Mutanten ermöglicht, da sie in Medien wachsen können, die fermentierbare Kohlenstoffquellen enthalten.

Wir beschreiben die Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Genexpression der Bäckerhefe S. cerevisiae auf der Translationsebene⁴. Sein Hauptprinzip ergibt sich aus mehreren Beobachtungen. Erstens kodiert das Hefemitochondrialgenom nur acht Proteine: drei Untereinheiten der Cytochrom-c-Oxidase (Cox1p, Cox2p und Cox3p), drei Untereinheiten der ATP-Synthase (Atp6p, Atp8p und Atp9p), eine Untereinheit des Ubiquinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktivase-Enzyms, Cytochrom b (Cytb) und mitochondriales ribosomales Protein Var1p⁵. Diese Zahl ist klein, und alle von ihnen können durch Elektrophorese auf einem einzigen Gel unter den entsprechenden Bedingungen getrennt werden. Zweitens gehören mitochondriale Ribosomen eher zur prokaryotischen Klasse als zu eukaryotischen⁶, und daher ist die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika bei Hefezytoplasma- und Mitochondrienribosomen unterschiedlich. Es ermöglicht die Hemmung der zytoplasmatischen Translation mit Cycloheximid, die Bedingungen, wenn die markierte Aminosäure⁽³⁵S-Methionin) nur in mitochondrialen Übersetzungsprodukten enthalten ist. Als Ergebnis liefert das Experiment Informationen über die Rate der Aminosäure-Inkorporation in mitochondrialen Proteinen synthetisiert de novo, was die Gesamteffizienz der mitochondrialen Übersetzung für jedes der acht Produkte widerspiegelt

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Protokoll

1. HefekulturVorbereitung

1. Streifen Hefe aus den gefrorenen Stockkulturen auf frischen Tellern mit dem entsprechenden Medium. Legen Sie die Platten in einen Kultur-Inkubator bei 30 °C für 24-48 h.
   HINWEIS: Lassen Sie die temperaturempfindlichen Mutanten bei der freizügigen Temperatur wachsen.
2. Hefekulturen in 2 ml YPGal-Medium (2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Galaktose) aus dem frischen Streifen in 15 ml-Röhrchen impfen und über Nacht bei 200 U/min bei 30 °C aufregen.
3. Messen Sie die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀).
4. Nehmen Sie das Volumen von 0,2 Absorptionseinheiten in sterilen Röhren, Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie den Überstand.
5. Waschen Sie Zellen mit 0,5 ml sterilem Wasser durch Wirbeln für 5 s. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Verdünnung der Zellen in 2 ml frischem YPGal-Medium.
6. Inkubieren Sie bei 200 Umdrehungen/ Min.und 30 °C, bis OD₆₀₀ 1,5–1,9 Werte erreicht.
   HINWEIS: Die Hefewachstumsraten variieren, also seien Sie bereit zu warten. Es ist vernünftig, die Schritte 1.3–1.6 am frühen Morgen zu machen. Es dauert in der Regel 4-5 h, kann aber länger dauern.

2. Radioaktive Isotopen-Einarbeitung

1. Übertragen Sie das Kulturvolumen, das einer optischen Einheit in einem Mikrozentrifugenrohr entspricht. Drehen Sie die Rohre bei 3.000 x g für 1 min und entsorgen Sie den Überstand. Mit 0,5 ml sterilem Wasser durch Wirbeln für 5 s waschen.
   1. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und entsorgen den Überstand. Hefezellen in 0,5 ml sterilem Translationspuffer resuspendieren. Legen Sie die Aufhängung in ein 15 ml Rohr.
      HINWEIS: Der Translationspuffer ist eine Lösung, die 2% Galaktose (w/v) und 50 mM Kaliumphosphat mit pH 6.0 enthält.
2. Cycloheximid bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zur Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min Aufreger bei 200 Rpm und 30 °C, um die zytosolische Übersetzung zu hemmen.
   HINWEIS: Cycloheximidlösung (20 mg/ml, in Ethanol) sollte vor dem Experiment frisch zubereitet werden. Chloramphenicol kann erfolgreich mit Anisomycin in der gleichen Konzentration ersetzt werden⁷.
3. Fügen Sie der Zellsuspension 25–30 Ci von ³⁵S-Methionin hinzu und inkubieren Sie 30 min Aufreger bei 200 Umdrehungen bei 200 Rprossen und 30 °C.
   HINWEIS: Die Mischung aus ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein kann auch verwendet werden. Pure ³⁵S-Methionin ergibt das stärkste Signal und das beste Signal-Rausch-Verhältnis. Im Allgemeinen ist Methionin effektiver als Cystein, weil der Gehalt dieser Aminosäure in mitochondrialen Proteinen höher ist. Die EasyTag-Mischung aus ³⁵S-Methionin und Cystein ist jedoch kostengünstiger und liefert vergleichbare Ergebnisse⁷.
   VORSICHT: ³⁵S-Methionin ist radioaktiv. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken für den Umgang mit radioaktiven Stoffen.
   HINWEIS: Es ist allgemein bekannt, dass die Einbeziehung von Radioaktivität eine Grenze erreicht, aufgrund derer sich die Gesamtsignale im Laufe der Zeit absetzen. Sobald diese Grenze erreicht ist, ist es fast unmöglich, die Raten zu bestimmen, mit denen die verschiedenen Übersetzungsprodukte synthetisiert werden. Um die Rate der mitochondrialen Übersetzung zu analysieren, ist es zwingend erforderlich, in einem Zustand zu sein, in dem die Signalintensität mit der Zeit der Inkubation mit ³⁵S-Methionin in linearer Weise zunimmt. Bei gängigen Labor-Wildtyp-Stämmen ist das Signal bereits für Inkubationszeiten gesättigt, die weit kürzer sind als die 30 min. Translationale Mutanten können sich sehr unterschiedlich verhalten. Es sollte ein Zeitkurs durchgeführt werden, um die Kinetik der Radioaktivitätsintegration und damit die Übersetzungsrate zu ermitteln, zumindest wenn mit einer neuen Sorte gearbeitet wird. Hierfür empfehlen wir, Proben mit einem Intervall von mehreren Minuten (z. B. 2,5, 5,0, 7,5, 10 und 20 min) zu nehmen.
4. Fügen Sie unbeschriftetes "kaltes" Methionin (Endkonzentration sollte 20 mM betragen) und Puromycin (Endkonzentration sollte 1–10 g/ml betragen) hinzu, um die Etikettierung zu stoppen. 10 min aufstellen bei 200 Umdrehungen bei 200 Umdrehungen und 30 °C inkubieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um Ribosomen Zeit zu geben, um die Übersetzung der Peptide abzuschließen. Andernfalls werden alle Polypeptide, die kürzer als die volle Länge sind, in einer anderen Größe erkannt. In diesem Schritt kann ein Zeit-Kurs-Experiment (Pulse-Chase) durchgeführt werden, um die Stabilität von mitochondrialen Übersetzungsprodukten zu bestimmen. Setzen Sie dazu die Inkubationsaufnahme mit einem Intervall von 30 min (z. B. 30, 60, 90 und 120 min) fort.

3. Hefezelllyse und Extraktion von Proteinen

1. Sammeln Sie Hefezellen durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 30 s. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml sterilem Wasser, indem Sie 5 s wirbeln. Pellethefezellen bei 9.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand.
   Hinweis. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.
2. Fügen Sie dem Pellet 75 L Lysepuffer und Wirbel für 5–10 s hinzu.
   HINWEIS: Lysispuffer ist eine Lösung aus 1,8 M NaOH, 1 M β-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF in Wasser. Vermeiden Sie eine übermäßige Inkubation mit Lysepuffer, der zu einer alkalischen Hydrolyse von Proteinen führt. Fahren Sie sofort mit Schritt 3.3 fort.
3. Fügen Sie 500 l von 0,5 M Tris-HCl Puffer mit pH 6.8 hinzu. Wirbel kurz.

4. Niederschlag von Proteinen

VORSICHT: Methanol und Chloroform sind organische Lösungsmittel. Befolgen Sie die üblichen Sicherheitspraktiken für den Umgang mit organischen Stoffen.

1. Fügen Sie der Probe 600 l Methanol hinzu. Wirbel für 5 s.
2. Fügen Sie der Probe 150 l Chloroform hinzu. Wirbel für 5 s.
3. Zentrifugieren Sie die Proben für 2 min bei 12.000 x g. Entsorgen Sie die obere Phase vorsichtig mit einem Sampler.
4. Fügen Sie der Probe 600 l Methanol hinzu. Mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr mehrmals invertieren.
5. Zentrifugieren Sie die Proben für 2 min bei 12.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand.
6. Das Pellet 2 min bei 80 °C lufttrocknen.
   HINWEIS: Die gesamte Flüssigkeit sollte verdampfen. Es besteht die Gefahr einer abwegigen Trennung von Proteinen im Gel, wenn das Pellet unzureichend getrocknet wurde. Es ist jedoch nicht möglich, das Pellet zu übertrocknen, so dass es sogar über Nacht bei 4 °C gelagert werden kann.
7. Lösen Sie ausgefällte Proteine in 60 l 1x Laemmli-Probenpuffer auf.
8. 10 min bei 40 °C erhitzen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie das Kochen der Proben bei 95 °C, da dies zu einer Aggregation führt. Wenn sich die Aggregate noch bilden, drehen Sie die Proben bei 12.000 x g für 2 min und sammeln Sie den Überstand. Proben können bei -20 °C gelagert werden. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

5. SDS-PAGE

1. Gießen Sie das 17,5% Laemmli SDS-Polyacrylamid-Gel.
   HINWEIS: 6 M Harnstoff kann dem Gel hinzugefügt werden, um besser atp8 und atp9 aufzulösen. Gradient 15%–20% Gele können auch eine bessere Auflösung geben.
2. Legen Sie 15 l (40–50 g) jeder Probe in die Taschen.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Proteinkonzentration zu messen, wenn die OD_600-Werte in Schritt 1.6 nahe waren. Wenn nicht, messen Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Assay mit waschmittelkompatiblen Reagenzien.
3. Führen Sie das Gel in einem kalten Raum, bis der blaue Farbstoff etwa 65% der Gellänge erreicht.
   HINWEIS: Für das verwendete System (z. B. Protean II xi Cell) verwenden wir einen der beiden Modi: 16–17 h bei 5 V/cm oder 5 h bei 15 V/cm. Keine Proteine laufen schneller als der Bromphenol-Blaufarbstoff, aber lange Läufe können zu Einer Verwischung der atp8- und atp9-Signale führen.
4. Färben Sie das Gel mit Coomassie brillant blau und machen Sie einen Scan oder Foto, die als Ladekontrolle erforderlich ist.
   HINWEIS: Eine alternative Möglichkeit, eine Belastungskontrolle zu machen, ist die Immunoblotting mit einem Antikörper gegen das mitochondriale "Haushalte"-Gen, z. B. Porin 1.

6. Autoradiographie

1. Trocknen Sie das Gel in einem Gel-Trockner. Bewahren Sie es 3–5 Tage lang mit einem Phosphor-Speicherbildschirm in der Kassette auf.
   HINWEIS: Eine Alternative zum Screening des getrockneten Gels ist die Übertragung von Proteinen auf eine Nitrocellulosemembran durch Elektro-Blotting und anschließendes Screening. Es führt zu stärkeren Signalen und schärferen Bändern.
2. Scannen Sie den Bildschirm auf einem Phosphorimager.
   HINWEIS: Als Alternative zur Phosphor-Bildgebung kann auch Röntgenfilm verwendet werden, um die Signale zu offenbaren.

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Ergebnisse

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir mitochondriale Übersetzungsprodukte aus zwei S. cerevisiae Stämmen zugewiesen: den wilden Typ (WT) und eine mutierte Lagerlöschung des AIM23-Gens (AIM23 ),die mitochondrialen Translationinitiationsfaktor 3 (Tabelle 1)⁸kodieren. Mitochondriale Übersetzungsprodukte wurden in SDS-PAAG9 radioaktiv gekennzeichnet und getrennt. Die Proben wurden alle 2,5 min vor der Sättigung gesammelt, um einen Zei...

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Diskussion

Untersuchungen der Genexpression spielen einen zentralen Teil der modernen Biowissenschaften ein. Es wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die Einblicke in diesen komplexen Prozess geben. Hier beschrieben wir die Methode, die den Zugang zur Proteinbiosynthese in der Bäckerhefe S. cerevisiae mitochondria ermöglicht. Es wird in der Regel angewendet, um die Übersetzungseffizienz der mRNAs in Mitochondrien des mutierten Hefestamms im Vergleich zum Wildtyp zu vergleichen, um auf die Folgen der untersuchten Mutati...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625