贝克酵母糖精中线粒体基因组表达产品的标记和可视化

摘要

贝克的酵母线粒体基因组编码了八种多肽。当前协议的目标是将所有这些都标记为单独的频段，然后将其可视化为单独的频段。

摘要

线粒体是能够有氧呼吸的真核细胞的基本细胞。它们含有圆形基因组和基因表达装置。面包师酵母的线粒体基因组编码八种蛋白质:细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和考克斯3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，是紫基酚-细胞色素c氧化酶、细胞色素b（细胞色素b）和线粒体核糖体蛋白Var1p的子单位。这里描述的方法的目的是用 ³⁵S甲氨酸专门标记这些蛋白质，通过电磷分离它们，并将信号可视化为屏幕上的离散带。该过程涉及几个步骤。首先，酵母细胞在含角质的介质中培养，直到它们到达晚期对数生长阶段。其次，环素酰胺治疗阻断细胞质转化，仅允许 ³⁵S甲基氨酸在线粒体翻译产品中结合。然后，所有蛋白质都从酵母细胞中提取，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。最后，凝胶干燥并与存储磷屏幕一起孵育。屏幕扫描在荧光仪上，显示带子。该方法可用于比较突变酵母菌株线粒体中单个多肽的生物合成率与野生菌型，这有助于研究线粒体基因表达缺陷。此协议提供了有关所有酵母线粒体 mRNA 翻译速率的宝贵信息。然而，它需要几个控制和额外的实验，以作出适当的结论。

引言

线粒体是深陷真核细胞代谢的细胞器。他们的电子传输链为细胞提供ATP，ATP是用于多种生化途径的主要能量货币。此外，他们参与凋亡，脂肪酸和血红素合成，和其他过程。线粒体功能障碍是人类疾病的著名来源^。它可以是由于核基因或线粒体基因的突变，编码细胞器²的结构或调节成分。贝克的酵母 糖精 是研究线粒体基因表达的一个很好的模型有机体，原因有几个。首先，他们的基因组被完全测序^3，有很好的注释，由于与这种生物体进行的长期调查历史，大量的数据已经在文献中可用。其次，由于其快速的生长速度和高效的同源重组系统，其核基因组的处理相对快速和容易。第三，面包师的酵母 S.脑膜 是少数利用线粒体基因组进行操作的生物之一。最后，面包师的酵母是一种气样-厌食性有机体，它允许分离和研究呼吸缺陷突变体，因为它们可以在含有可发酵碳源的介质中生长。

我们描述了研究面包师酵母 S.cerevisiae 的线粒体基因表达的方法在转化水平^4。它的主要原则来自几个观察。首先，酵母线粒体基因组只编码八种蛋白质:细胞色素c氧化酶的三个亚单位（Cox1p， 考克斯2p和Cox3p），ATP合成酶（Atp6p、Atp8p和Atp9p）的三个子单位，ubiquinol-细胞色素c氧化酶、细胞色素b（细胞）和线粒体核糖体蛋白Var1p⁵的子单位。这个数字很小，在适当条件下，所有凝胶上的电光可以分离。其次，线粒体核糖体属于原核糖体类，而不是真核生物^6，因此，酵母细胞质和线粒体核糖体对抗生素的敏感性不同。它允许用环氧化物抑制细胞质转化，为标记的氨基酸^（35S-甲基氨酸）仅在线粒体转化产品中结合提供条件。因此，该实验提供了有关线粒体蛋白中氨基酸的吸收率的信息，反映了八种产品中线粒体转化的整体效率。

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研究方案

1. 酵母文化准备

1. 用适当的介质在新鲜盘子上冷冻库存培养物上的条纹酵母。将盘子放入30°C的文化孵化器中，24-48小时。
   注意:让对温度敏感的突变体在允许的温度下生长。
2. 接种酵母培养物在2 mL的YPGal介质（2%的肽，1%酵母提取物，2%的辣椒素）从新鲜条纹在15 mL管，并孵育他们过夜搅拌在200 rpm在30°C。
3. 以 600 nm （OD 600） 的波长测量培养的光学密度。
4. 以无菌管中对应0.2吸收单元的体积为例，在室温下以9，000 x g的 颗粒酵母细胞，在室温下丢弃超纳坦。
5. 用0.5 mL的无菌水清洗细胞，通过漩涡5s。颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。稀释细胞在2 mL的新鲜YPGal介质。
6. 在 OD 600 达到 1.5-1.9 值之前，在 200 rpm 和₃₀ °C 下孵化搅拌。
   注意:酵母的增长率各不相同，所以请准备好等待。在清晨采取1.3-1.6步骤是合理的。它通常需要4-5小时，但可能需要更长的时间。

2. 放射性同位素结合

1. 传输相当于微中心管中的一个光学单元的培养量。以 3，000 x g 旋转 管子 1 分钟，然后丢弃超纳坦。用 0.5 mL 的无菌水洗净， 漩涡 5 s 。
   1. 颗粒酵母细胞在室温下在9，000 x g 30s，并丢弃超纳坦。在0.5 mL的无菌翻译缓冲中重新悬念酵母细胞。将悬架放置在 15 mL 管中。
      注:翻译缓冲区是一种含有2%辣椒酸（w/v）和50 mM磷酸钾的溶液，pH 6.0。
2. 将环氧化物添加到细胞悬浮物中，最终浓度为 0.2 毫克/mL。在 200 rpm 和 30 °C 下孵化 5 分钟搅拌，以抑制细胞自体翻译。
   注:环氧化物溶液（乙醇中20毫克/mL）应在实验前新鲜制备。氯霉素可以成功地用同浓度⁷的异霉素替代。
3. 在细胞悬浮液中加入35 S-甲氨酸的 ^25-30微分，在200转/分和30°C下孵育30分钟搅拌。
   注^:35S-甲基氨酸和³⁵S-半胱氨酸的混合物也可用于。纯³⁵S-甲氨酸导致最强的信号和最好的信号噪声比。一般来说，甲基氨酸比西斯泰因更有效，因为线粒体蛋白中这种氨基酸的含量更高。然而^，35S-甲基氨酸和半胱氨酸的EasyTag混合物更便宜，并给出可比的结果^7。
   警告 ^:35S-甲氨酸是放射性的。遵循处理放射性物质的通常安全做法。
   注:众所周知，放射性的结合达到了一个极限，因此总信号会随着时间而趋于平止。一旦达到此限制，几乎不可能确定合成不同翻译产品的速率。要分析线粒体转换速率，必须处于信号强度随 ³⁵S-甲氨酸的潜伏时间而增加的条件下。对于常见的实验室野生型菌株，信号已经饱和，潜伏时间远短于30分钟。转化突变体的行为可能非常不同。应执行时间过程，以确定放射性结合的动能，从而确定翻译速率，至少在处理新菌株时是这样。为此，我们建议每隔几分钟采集样本（例如，2.5、5.0、7、5、10 和 20 分钟）。
4. 添加未标记的"冷"甲基氨酸（最终浓度应为20mM）和紫杉醇（最终浓度应为1-10μg/mL）以阻止标签。在 200 rpm 和 30 °C 下孵化 10 分钟搅拌。
   注意:这一步骤对于给核糖体时间完成多肽的翻译至关重要。否则，所有短于全长的多肽都将以不同的尺寸被检测到。在此步骤中可以进行时间过程实验（脉冲追逐），以确定线粒体翻译产品的稳定性。为此，继续以30分钟（例如，30、60、90和120分钟）的间隔采集样品。

3. 酵母细胞裂解和蛋白质提取

1. 以9，000 x g 的离心收集酵母细胞，30s。用0.5 mL的无菌水清洗细胞，旋涡5s。在室温下，30s 的颗粒酵母细胞在 9，000 x g。 丢弃超纳坦。
   注意。协议可在此处暂停。将样品存放在-20°C。
2. 将 75μL 的裂解缓冲器添加到颗粒和漩涡中，达到 5-10 s。
   注:裂解缓冲液是1.8 M NaOH、1M β甲醇和1米PMSF在水中的溶液。避免过度孵化与裂解缓冲，导致碱性水解的蛋白质。立即进入步骤 3.3。
3. 添加 500μL 的 0.5 M 特里斯-HCl 缓冲区，带 pH 6.8。漩涡短暂。

4. 蛋白质沉淀

注意:甲醇和氯仿是有机溶剂。遵循处理有机物质的通常安全做法。

1. 在样品中加入600μL的甲醇。漩涡为5s。
2. 向样品中添加 150μL 的氯仿。漩涡为5s。
3. 在12，000 x g时将样品离心2分钟。使用取样器小心地丢弃上部。
4. 在样品中加入600μL的甲醇。通过多次倒置管子仔细混合。
5. 在12，000 x g时将样品离心2分钟。丢弃超纳坦。
6. 在 80 °C 下将颗粒空气干燥 2 分钟。
   注意:所有的液体都应该蒸发。如果颗粒干燥不足，凝胶中蛋白质有异常分离的风险。但是，不可能将颗粒过度干燥，因此它甚至可以在 4 °C 下存放过夜。
7. 溶解沉淀蛋白在60μL的1x莱姆利样品缓冲区。
8. 在40°C下加热10分钟。
   注意:避免在95°C下煮沸样品，因为这会导致聚合。如果聚合仍然形成，在 12，000 x g 下旋转样品 2 分钟，并收集超纳坦。样品可储存在-20°C。 协议可在此处暂停。

5. SDS页

1. 铸造17.5%莱姆利SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
   注:6 M尿素可以添加到凝胶中，以解决更好的atp8和atp9。梯度 15%-20% 凝胶也可以给出更好的分辨率。
2. 在口袋中加载每个样品的 15 μL （40-50μg）。
   注:如果OD_{600值在第1.6} 步接近，则无需测量蛋白质浓度。如果没有，使用与洗涤剂兼容的试剂进行检测来测量蛋白质浓度。
3. 在寒冷的房间里运行凝胶，直到蓝色染料达到凝胶长度的大约 65%。
   注:对于所使用的系统（例如 Protean II xi 单元），我们使用两种模式中的任何一种:5 V/cm 时的 16-17 小时或 15 V/cm 的 5 小时。没有蛋白质比溴酚蓝色染料跑得快，但长跑会导致 atp8 和 atp9 信号模糊。
4. 用库马西明亮的蓝色染色凝胶，并做扫描或照片，这是作为加载控制所必需的。
   注:进行装载控制的另一种方法是用抗体对线粒体"保管"基因进行免疫，例如，孔1。

6. 自传

1. 将凝胶干燥机干燥。将其保存在带存储磷屏幕的盒式磁带中 3-5 天。
   注:筛选干凝胶的替代方案是通过电污迹将蛋白质转移到硝基纤维素膜，然后进行筛选。它产生更强的信号和更清晰的波段。
2. 扫描荧光片上的屏幕。
   注:作为磷成像的替代品，X射线膜也可用于显示信号。

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结果

按照上述协议，我们从两个 S. Cerevisiae 菌株中分配线粒体翻译产品:野生类型（WT）和 AIM23 基因的突变轴承删除（AIM23Δ），编码线粒体翻译启动因子 3 （表 1）^8.线粒体翻译产品在SDS-PAAG9中被放射性标记和分离。样本在饱和前每2.5分钟收集一次，以建立一个时间过程（图1A）。凝胶在为期5天的展览（图1A...

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讨论

基因表达研究在现代生命科学中占有核心地位。已开发出许多方法，为这一复杂的过程提供见解。在这里，我们描述了允许在面包师酵母S.脑线粒体中获取蛋白质生物合成的方法。它通常用于比较突变酵母菌株线粒体中的mRNA的翻译效率与野生类型，以获得研究突变的后果。这是研究人员在研究带有突变的酵母细胞线粒体功能时进行的基本实验之一，该细胞被建议影响线粒体^8、...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625