베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

요약

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

초록

미토콘드리아는 호기성 호흡이 가능한 진핵세포의 필수 세포입니다. 그(것)들은 원형 게놈 및 유전자 발현 장치를 포함합니다. 제빵사의 효모의 미토콘드리아 게놈은 8가지 단백질을 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p의 서브유닛. 여기서 설명된 방법의 목적은 이러한 단백질을 ^35S메티오닌으로 구체적으로 라벨링하고, 전기포고에 의해 분리하고 신호를 화면에 이산밴드로 시각화하는 것이다. 절차는 몇 가지 단계를 포함한다. 첫째, 효모 세포는 후기 로와산성장 단계에 도달할 때까지 갈라토스 함유 배지에서 배양된다. 다음으로, 사이클로헤시미드 치료는 세포질 번역을 차단하고 미토콘드리아 번역 제품에만 ³⁵S 메티오닌을 통합할 수 있습니다. 그런 다음, 모든 단백질은 효모 세포에서 추출되고 폴리 아크릴라미드 젤 전기 포광에 의해 분리됩니다. 마지막으로, 젤은 저장 인광판으로 건조되고 배양됩니다. 화면은 밴드를 드러내는 인산화기에서 스캔됩니다. 이 방법은 미토콘드리아 유전자 발현 결함을 연구하는 데 유용한 야생형대 돌연변이 효모 균주의 미토콘드리아내 단일 폴리펩타이드의 생합성 율을 비교하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 모든 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 그러나 적절한 결론을 내리기 위해서는 여러 가지 제어 및 추가 실험이 필요합니다.

서문

미토콘드리아는 진핵 세포의 대사에 깊이 관여하는 세포기관입니다. 그들의 전자 전송 사슬은 여러 생화학 경로에 사용되는 주요 에너지 통화 인 ATP로 세포를 공급합니다. 게다가, 그들은 석 면에 관여, 지방산과 헴 합성, 그리고 다른 프로세스. 미토콘드리아의 기능 장애는 인간 질환 1의 잘 알려진^{소스이다.} 그것은 세포기관^2의구조 또는 조절 성분을 코딩하는 핵 또는 미토콘드리아 유전자에 있는 돌연변이에서 유래할 수 있습니다. 베이커의 효모 사카로미세스 세레비시아는 여러 가지 이유로 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 우수한 모델 유기체입니다. 첫째, 그들의 게놈은 완전히 시퀀스^3,잘 음부, 데이터의 큰 합계는 이 유기체로 실행된 조사의 긴 역사 덕분에 문학에서 이미 유효합니다. 둘째, 핵 게놈을 가진 조작은 그들의 빠른 성장 속도와 고도로 효율적인 상동성 재조합 시스템 때문에 상대적으로 빠르고 쉽습니다. 셋째, 제빵사의 효모 S. cerevisiae는 미토콘드리아 게놈으로 조작이 개발되는 몇 안되는 유기체 중 하나입니다. 마지막으로, 제빵사의 효모는 발효 탄소 공급원을 함유하는 미디어에서 성장할 수 있기 때문에 호흡기 결함이 있는 돌연변이를 격리하고 연구할 수 있는 에어로브-혐기성 자극 유기체입니다.

우리는 번역 수준^4에서제빵사 효모 S. cerevisiae의 미토콘드리아 유전자 발현을 연구하는 방법을 설명합니다. 그것의 주요 원칙은 여러 관찰에서 온다. 첫째, 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 단백질만 인코딩합니다: 시토크롬 c 산화제의 3개의 서브유닛(Cox1p, Cox2p, 및 Cox3p), ATP synthase의 3개의 하위 단위(Atp6p, Atp8p 및 Atp9p), 유비퀴놀-시토크롬 c 옥시도레덕타제 효소, 사이토크롬 b(Cytb), 및 미토콘드리아 리보소말 단백질 Var1p^5의서브유닛. 이 숫자는 작고, 그들 모두는 적절한 조건에서 단일 젤에 전기 전광에 의해 분리 될 수있다. 둘째, 미토콘드리아 리보솜은 진핵^6이아닌 원핵계 클래스에 속하며, 따라서 항생제에 대한 민감성은 효모 세포질 및 미토콘드리아 리보좀에 대해 다릅니다. 그것은 세포혈증 번역의 억제를 허용, 라벨 아미노산⁽³⁵S-메티오닌)가 미토콘드리아 번역 제품에만 통합 될 때 조건을 제공. 그 결과, 이 실험은 미토콘드리아 단백질합성 드 노보에 아미노산 의 혼입 속도에 대한 정보를 제공하여 8개 제품에 대한 미토콘드리아 번역의 전반적인 효율을 반영합니다.

프로토콜

1. 효모 문화 준비

1. 냉동 재고 배양에서 적절한 매체로 신선한 접시에 효모를 줄입니다. 24-48h에 대한 30 °C에서 배양 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
   참고: 온도에 민감한 돌연변이가 허용 온도에서 자랄 수 있도록 합니다.
2. YPGal 배지 2mL(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 갈모 추출물 2%)에서 효모 배양을 접종하여 15mL 튜브의 신선한 줄무늬에서 30°C에서 200rpm에서 밤새 교반하는 배양합니다.
3. 600nm(OD_600)의파장에서 배양의 광학 밀도를 측정한다.
4. 멸균 튜브에 0.2 흡광도 단위에 대응하는 부피를 취하고, 실온에서 30 초 동안 9,000 x g의 펠릿 효모 세포를 복용하고 상복부을 폐기하십시오.
5. 5 s에 대 한 소용돌이하 여 멸 균 수의 0.5 mL로 셀을 세척. 펠릿 효모 세포는 실온에서 30 초 동안 9,000 x g에서 슈퍼 나탄을 폐기합니다. 신선한 YPGal 배지의 2 mL에 세포를 희석.
6. OD 600이 1.5-1.9 값에 도달할 때까지₂₀₀ rpm 및 30°C에서 교반하는 배양.
   참고: 효모 성장률은 다양하므로 기다릴 준비를 하십시오. 이른 아침에 1.3-1.6 단계를 하는 것이 합리적입니다. 그것은 일반적으로 4-5 시간이 걸리지만 더 오래 걸릴 수 있습니다.

2. 방사성 동위 원소 통합

1. 마이크로센심분리기 튜브에서 하나의 광학 장치에 해당하는 배양 량을 전송합니다. 튜브를 3,000 x g에서 1분 동안 회전시키고 상체를 폐기합니다. 5 초 동안 소용돌이로 멸균 수의 0.5 mL로 씻어.
   1. 펠릿 효모 세포는 실온에서 30 초 동안 9,000 x g에서 슈퍼 나탄을 폐기합니다. 멸균 변환 버퍼의 0.5 mL에서 효모 세포를 재일시 중단합니다. 서스펜션을 15mL 튜브에 놓습니다.
      참고: 번역 버퍼는 pH 6.0을 함유한 2% 갈라토세(w/v) 및 50mM 칼륨 인산염을 함유하는 솔루션입니다.
2. 0.2 mg/mL의 최종 농도까지 세포 현탁액에 사이클로헨시미드를 추가하십시오. 세포 변환을 억제하기 위해 200 rpm 및 30 °C에서 5 분 교반하는 동안 배양하십시오.
   참고: 사이클로헤시미드 용액(20 mg/mL, 에탄올)은 실험 전에 신선하게 준비해야 한다. 클로람페니콜은 동일한 농도^7에서애니소마이신으로 성공적으로 대체될 수 있다.
3. 세포 현탁액에 ³⁵S-메티오닌의 25-30 μCi를 추가하고 200 rpm 및 30 °C에서 30 분 교반하는 동안 배양하십시오.
   참고: ³⁵S-메티오닌과 ³⁵S-시스테인의 혼합물도 사용할 수 있습니다. 퓨어 ³⁵S-메티오닌은 가장 강력한 신호와 최고의 신호 대 잡음 비율을 초래합니다. 일반적으로 메티오닌은 미토콘드리아 단백질에서 이 아미노산의 함량이 높기 때문에 시스테인보다 더 효과적입니다. 그러나, ³⁵S-메티오닌과 시스테인의 EasyTag 혼합물은 저렴하고 비교 결과를 제공합니다^7.
   주의: ³⁵S-메티오닌은 방사성입니다. 방사성 물질 취급에 대한 일반적인 안전 관행을 따르십시오.
   참고: 방사능의 통합이 시간이 지남에 따라 총 신호가 평준화되는 한계에 도달하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 이 제한에 도달하면 다른 번역 제품이 합성되는 속도를 결정하는 것은 거의 불가능합니다. 미토콘드리아 번역의 속도를 분석하기 위해, 선형 방식으로 ³⁵S-메티오닌을 가진 잠복의 시간에 따라 신호 강도가 증가하는 조건에 필수적이다. 일반적인 실험실 야생 형 균주의 경우 신호는 이미 30 분보다 훨씬 짧은 잠복 시간에 대해 포화상태입니다. 번역 돌연변이는 매우 다르게 행동할 수 있습니다. 시간 과정은 방사능 통합의 운동학을 확립하고 따라서 번역의 비율을 확립하기 위해 수행되어야한다, 적어도 새로운 변형으로 작업 할 때. 이를 위해 몇 분 간격으로 샘플을 채취하는 것이 좋습니다(예: 2.5, 5.0, 7,5, 10 및 20분).
4. 라벨이 부착되지 않은 "콜드" 메티오닌(최종 농도는 20mMM이어야 한다)과 푸오마이신(최종 농도는 1-10 μg/mL이어야 한다)을 추가하여 라벨링을 중지합니다. 200 rpm 및 30 °C에서 10 분 교반하십시오.
   참고: 이 단계는 리보솜에게 펩티드 변환을 완료할 시간을 제공하는 데 매우 중요합니다. 그렇지 않으면, 전체 길이보다 짧은 모든 폴리펩타이드는 다른 크기로 검출될 것이다. 미토콘드리아 번역 제품의 안정성을 결정하기 위해 이 단계에서 타임코스 실험(pulse-chase)을 수행할 수 있다. 이를 위해 30분 간격으로 시료를 채취하여 배양을 계속한다(예를 들어, 30분, 60, 90 분 및 120분).

3. 효모 세포 리시스 및 단백질 추출

1. 30 s에 대 한 9,000 x g에서 원심 분리에 의해 효 모 세포를 수집 합니다. 5 s에 대 한 소용돌이하 여 멸 균 수의 0.5 mL로 세포를 씻어. 펠릿 효모 세포는 실온에서 30 s에 대한 9,000 x g에서. 상부체를 폐기합니다.
   메모. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 샘플을 -20°C에 저장합니다.
2. 5-10s의 펠릿과 소용돌이에 75 μL의 용해 버퍼를 넣습니다.
   참고: 리시스 버퍼는 1.8 M NaOH, 1M β-메카토에탄올, 1mM PMSF의 물이다. 단백질의 알칼리성 가수분해로 이어지는 리시스 버퍼로 과도한 배양을 피하십시오. 즉시 3.3 단계로 진행합니다.
3. pH 6.8로 0.5M Tris-HCl 버퍼500 μL을 추가합니다. 소용돌이가 짧게.

4. 단백질의 강수량

주의: 메탄올과 클로로폼은 유기 용매입니다. 유기 물질 취급을 위한 일반적인 안전 관행을 따르십시오.

1. 샘플에 메탄올 600 μL을 추가합니다. 5 s에 대한 소용돌이.
2. 샘플에 150 μL의 클로로폼을 추가합니다. 5 s에 대한 소용돌이.
3. 원심 분리는 12,000 x g에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 조심스럽게 샘플러와 상위를 폐기.
4. 샘플에 메탄올 600 μL을 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전시켜 조심스럽게 섞는다.
5. 원심 분리는 12,000 x g에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
6. 80 °C에서 2 분 동안 펠릿을 공기 건조시십시오.
   참고: 모든 액체가 증발해야 합니다. 펠릿이 불충분하게 건조된 경우 젤에 단백질의 비정상적인 분리가 있을 위험이 있다. 그러나 펠릿을 과도하게 건조시킬 수 없으므로 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수도 있습니다.
7. 침전된 단백질을 1x Laemmli 시료 버퍼의 60 μL에 녹입니다.
8. 40 °C에서 10 분 동안 가열하십시오.
   참고: 95°C에서 시료를 끓이는 것은 집계를 유발하기 때문입니다. 골재가 여전히 형성되면 샘플을 12,000 x g에서 2분 동안 회전하고 상체를 수집합니다. 샘플은 -20°C에서 저장할 수 있습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.

5. SDS 페이지

1. 17.5% Laemmli SDS-폴리아크라이엘라미드 젤을 캐스팅합니다.
   참고: 6M 우레아는 더 나은 atp8 및 atp9를 해결하기 위해 젤에 첨가될 수 있다. 그라데이션 15%-20% 젤도 더 나은 해상도를 제공할 수 있습니다.
2. 주머니에 각 샘플의 15 μL (40-50 μg)를적재합니다.
   참고: OD₆₀₀ 값이 1.6단계에서 근접했다면 단백질 농도를 측정할 필요가 없습니다. 그렇지 않은 경우, 세제 호환 시약과 분석체를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
3. 파란색 염료가 젤 길이의 약 65%에 도달할 때까지 차가운 방에서 젤을 실행합니다.
   참고: 사용된 시스템(예: Protean II xi cell)의 경우, 우리는 두 가지 모드 중 하나를 사용합니다: 5 V/cm에서 16-17 h 또는 15 V/cm에서 5h. 브로모페놀 블루 염료보다 더 빨리 단백질이 실행되지 않지만, 긴 실행은 atp8 및 atp9 신호의 흐림을 초래할 수 있습니다.
4. 쿠마시 블루와 젤을 염색하고 로딩 컨트롤로 필요한 스캔이나 사진을 만듭니다.
   참고: 로딩 제어를 만드는 또 다른 방법은 미토콘드리아 "하우스 키핑" 유전자, 예를 들어, 포린 1에 대한 항체를 면역로하는 것이다.

6. 사학 사진

1. 젤 건조기에서 젤을 건조시십시오. 3-5 일 동안 저장 인광판 화면으로 카세트에 보관하십시오.
   참고: 말린 젤을 선별하는 대안은 전기 블로팅을 통해 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전달하여 그 이후에 이를 선별하는 것입니다. 그것은 강한 신호와 선명한 밴드를 초래한다.
2. 인산화기의 화면을 스캔합니다.
   참고: 인광 화상 진찰에 대한 대안으로, 엑스레이 필름은 또한 신호를 드러내기 위하여 이용될 수 있습니다.

결과

전술한 프로토콜에 따라, 우리는 두 가지 S. 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당: 야생 형(WT)및 AIM23 유전자의 돌연변이 베어링 삭제(AIM23Δ),인코딩 미토콘드리아 번역 개시 인자 3(표 1)^8. 미토콘드리아 번역 제품은 SDS-PAAG9에서 방사성 라벨을 부착하고 분리시켰다. 샘플은 포화 전에 2.5 분마다 수집하여 시간 과정

토론

유전자 발현의 조사는 현대 생명 과학에 있는 중앙 부분을 차지합니다. 이 복잡한 프로세스에 대한 통찰력을 제공하는 수많은 방법이 개발되었습니다. 여기서, 우리는 베이커의 효모 S. cerevisiae 미토콘드리아에서 단백질 생합성에 접근하는 것을 허용하는 방법을 설명했습니다. 그것은 일반적으로 연구된 돌연변이의 결과에 접근하기 위하여 돌연변이 효모 긴장대 미토콘드리아에 있는 mRNAs?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625