Маркировка и визуализация продуктов экспрессии митохондриального генома в хлебобулочных saccharomyces cerevisiae

Резюме

Дрожжи Бейкера митохондриального генома кодирует восемь полипептидов. Цель текущего протокола состоит в том, чтобы обозначить все из них, а затем визуализировать их как отдельные полосы.

Аннотация

Митохондрии являются важными органеллами эукариотических клеток, способных к аэробному дыханию. Они содержат круговой геном и аппарат экспрессии генов. Митохондриальный геном хлебопекарных дрожжей кодирует восемь белков: три субъединита цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазы АТФ (Atp6p, Atp8p и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Цель метода, описанного здесь, состоит в том, чтобы конкретно обозначить ^{эти белки с 35}S метионином, отделить их электрофорезом и визуализировать сигналы как дискретные полосы на экране. Процедура включает в себя несколько этапов. Во-первых, дрожжевые клетки культури в галактозоссодержащей среде, пока они не достигнут поздней стадии логаритмического роста. Далее, циклохексимид лечения блокирует цитоплазмический перевод ^{и позволяет 35}S метионин включения только в митохондриальных переводческих продуктов. Затем все белки извлекаются из дрожжевых клеток и отделяются полиакриламинидным гель-электрофорезом. Наконец, гель сушат и инкубируется с экраном фосфора хранения. Экран сканируется на фосфоримагер выявления полос. Метод может быть применен для сравнения скорости биосинтеза одного полипептида в митохондриях штамма мутантных дрожжей по сравнению с диким типом, который полезен для изучения дефектов экспрессии митохондриального гена. Этот протокол дает ценную информацию о скорости перевода всех дрожжей митохондриальных мРНК. Тем не менее, для того, чтобы сделать правильные выводы, требуется несколько элементов управления и дополнительные эксперименты.

Введение

Митохондрии являются органеллы глубоко участвует в метаболизме эукариотической клетки. Их цепочка передачи электронов снабжает клетку АТФ, основной энергетической валютой, используемой в нескольких биохимических путях. Кроме того, они участвуют в апоптозе, синтезе жирных кислот и гемов, а также в других процессах. Дисфункция митохондрий является известным источником болезни человека¹. Это может быть результатом мутаций в ядерных или митохондриальных генах, кодирующих структурные или регулятивные компоненты^{органелл 2.} Дрожжи Бейкера Saccharomyces cerevisiae является отличной моделью организма для изучения митохондриальной экспрессии генов по нескольким причинам. Во-первых, их геном^{полностью секвенирован 3,}хорошо аннотирован, и большая сумма данных уже доступна в литературе благодаря долгой истории исследований, проведенных с этим организмом. Во-вторых, манипуляции с их ядерным геномом относительно быстры и просты из-за их быстрых темпов роста и высокоэффективной гомологичной системы рекомбинации. В-третьих, хлебопекарные дрожжи S. cerevisiae являются одним из немногих организмов, для которых разрабатываются манипуляции с митохондриальными геномами. Наконец, хлебопекарные дрожжи – это аэробе-анаэробный биологический организм, который позволяет изоляцию и изучение респираторных дефектных мутантов, так как они могут расти в средствах массовой информации, содержащих ферментируемые источники углерода.

Мы описываем метод изучения митохондриальной экспрессии генов пекаря дрожжей S. cerevisiae на трансляционной^{уровне 4}. Его основной принцип исходит из нескольких наблюдений. Во-первых, дрожжи митохондриального генома кодирует только восемь белков: три подразделения цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазы^АТФ(Atp6p, Atp8p, и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Это число невелико, и все они могут быть разделены электрофорезом на одном геле в соответствующих условиях. Во-вторых, митохондриальные рибосомы относятся к прокариотическому классу, а не^{к эукариотическим 6,}и поэтому чувствительность к антибиотикам различна для дрожжевых цитоплазмических и митохондриальных рибосом. Это позволяет ингибировать цитоплазмический перевод циклохексимидом, обеспечивая условия, при которых маркированная аминокислота⁽³⁵S-метионин) включается только в митохондриальные переводческие продукты. В результате эксперимента дается информация о скорости включения аминокислот в митохондриальные белки, синтезированные de novo, что отражает общую эффективность митохондриального перевода для каждого из восьми продуктов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка дрожжевой культуры

1. Полоса дрожжей из замороженных фондовых культур на свежих тарелках с соответствующей среде. Положите пластины в инкубатор культуры при 30 градусов по Цельсию на 24-48 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пусть чувствительные к температуре мутанты растут при разрешительной температуре.
2. Прививают дрожжевые культуры в 2 мл YPGal среды (2% пептона, 1% дрожжевой экстракт, 2% галактозы) из свежей полосы в 15 мл трубок и инкубировать их ночь агитации при 200 об/мин при 30 градусов по Цельсию.
3. Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нм (OD₆₀₀).
4. Возьмите объем, соответствующий 0,2 абсорбторных единиц в стерильных трубках, гранулы дрожжевых клеток на 9000 х г для 30 с при комнатной температуре, и отказаться от супернатанта.
5. Вымойте клетки с 0,5 мл стерильной воды вихрем в течение 5 с. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Разбавить клетки в 2 мл свежей среды YPGal.
6. Инкубационный агитационный при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию, пока OD₆₀₀ не достигнет значений 1,5-1,9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Темпы роста дрожжей варьируются, так что будьте готовы ждать. Разумно сделать шаги 1.3-1.6 рано утром. Обычно это занимает 4-5 ч, но может занять больше времени.

2. Включение радиоактивных изотопов

1. Передача объема культуры, эквивалентного одному оптическому блоку в микроцентрифуге трубки. Спин трубки на 3000 х г в течение 1 мин и отказаться от супернатанта. Вымойте 0,5 мл стерильной воды вихрем на 5 с.
   1. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Resuspend дрожжевых клеток в 0,5 мл стерильного буфера перевода. Поместите подвеску в трубку 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод буфера является решением, содержащим 2% галактозы (w/v) и 50 мМ фосфат калия с рН 6.0.
2. Добавьте циклохексимид в подвеску клеток до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Инкубация в течение 5 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию для ингибирования цитозолового перевода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор циклохексимида (20 мг/мл, в этаноле) должен быть подготовлен свежим перед экспериментом. Хлорамфеникол можно успешно заменить анизомицином в той же концентрации^7.
3. Добавьте 25-30 мкг ³⁵S-мезионина в подвесную клетку и инкубировать в течение 30 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь ³⁵S-methionine и ³⁵S-цистеин также может быть использован. Чистый ³⁵S-methionine приводит к самому сильному сигналу и лучшему соотношению сигнала к шуму. Как правило, мезионин является более эффективным, чем цистеин, потому что содержание этой аминокислоты в митохондриальных белков выше. Тем не менее, смесь EasyTag ^{из 35}S-methionine и цистеина дешевле и дает сопоставимые результаты⁷.
   ВНИМАНИЕ: ³⁵S-мезионин является радиоактивным. Следуйте обычным правилам безопасности при обращении с радиоактивными материалами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо известно, что включение радиоактивности достигает предела, из-за которого общее количество сигналов выравнивается с течением времени. Как только этот предел будет достигнут, практически невозможно определить скорость синтеза различных переводческих продуктов. Чтобы проанализировать скорость митохондриального перевода, необходимо быть в состоянии, при котором интенсивность сигнала увеличивается со временем инкубации ^{с 35}S-methionine в линейной манере. Для обычных лабораторных штаммов дикого типа, сигнал уже насыщен инкубации раз гораздо короче, чем 30 мин. Переводные мутанты могут вести себя совсем по-другому. Следует проводить тайм-курс для установления кинетики включения радиоактивности и, следовательно, скорости перевода, по крайней мере при работе с новым штаммом. Для этого мы предлагаем брать пробы с интервалом в несколько минут (например, 2,5, 5,0, 7,5, 10 и 20 мин).
4. Добавьте неочищенные «холодные» метионин (окончательная концентрация должна быть 20 мМ) и пуромицин (окончательная концентрация должна быть 1-10 мкг/мл), чтобы остановить маркировку. Инкубация в течение 10 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, чтобы дать рибосомы время, чтобы закончить перевод пептидов. В противном случае, все полипептиды короче, чем в полный рост будут обнаружены на другой размер. На этом этапе можно провести эксперимент по времени (пульс-погоня) для определения стабильности митохондриальных переводческих продуктов. Для этого продолжайте инкубацию, взяв пробы с интервалом в 30 минут (например, 30, 60, 90 и 120 мин).

3. Дрожжевой клеточныйлиз и экстракция белков

1. Соберите дрожжевые клетки путем центрифугации на 9000 х г на 30 с. Вымойте клетки с 0,5 мл стерильной воды вихрем в течение 5 с. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г для 30 с при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта.
   заметка. Протокол можно приостановить здесь. Храните образцы при -20 градусов по Цельсию.
2. Добавьте 75 МКЛ буфера лиза к гранулам и вихрю в течение 5-10 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лиз буфер является решением 1.8 M NaOH, 1 M β-меркаптоэтанол, и 1 мМ PMSF в воде. Избегайте чрезмерной инкубации с буфером лиза, что приводит к щелочному гидролизу белков. Немедленно приступайте к шагу 3.3.
3. Добавьте 500 МКЛ буфера 0,5 М Трис-HCl с рН 6,8. Вортекс кратко.

4. Осадки белков

ВНИМАНИЕ: Метанол и хлороформ являются органическими растворителями. Следуйте обычной практике безопасности для обработки органических веществ.

1. Добавьте в образец 600 МКЛ метанола. Вихрь для 5 с.
2. Добавьте в образец 150 МКЛ хлороформа. Вихрь для 5 с.
3. Центрифуга образцов в течение 2 мин при 12000 х г. Аккуратно отбросьте верхнюю фазу с помощью пробоя.
4. Добавьте в образец 600 МКЛ метанола. Тщательно перемешайте трубку несколько раз.
5. Центрифуга образцов в течение 2 мин при 12000 х г. Откажитесь от супернатанта.
6. Воздушно-сухие гранулы в течение 2 мин при 80 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся жидкость должна испаряться. Существует риск иметь аномальное разделение белков в геле, если гранулы были высушены недостаточно. Тем не менее, это не возможно, чтобы пересушить гранулы, так что он может даже храниться на ночь при 4 градусов по Цельсию.
7. Растворите осажденные белки в 60 МКЛ 1x буфера образца Laemmli.
8. Нагрейте в течение 10 мин при температуре 40 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте кипячения образцов при 95 градусов по Цельсию, потому что это вызывает агрегацию. Если агрегаты все еще образуются, закруть образцы на 12 000 х г в течение 2 мин и соберите супернатант. Образцы можно хранить при -20 градусов по Цельсию. Протокол можно приостановить здесь.

5. СТРАНИЦА SDS

1. Бросьте 17,5% Laemmli SDS-полиакриламидный гель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 6 M мочевины могут быть добавлены в гель для решения лучше atp8 и atp9. Градиент 15%-20% гелей также может дать лучшее разрешение.
2. Загрузите 15 МКЛ (40–50 мкг) каждого образца в карманах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости измерять концентрацию белка, если значения OD₆₀₀ были близки в шаге 1.6. Если нет, то измерьте концентрации белка с помощью анализа с помощью моющих средств, совместимых с реагентами.
3. Запустите гель в холодной комнате, пока синий краситель достигает примерно 65% от длины геля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для используемой системы (например, ячейки Protean II xi) мы используем любой из двух режимов: 16-17 ч при 5 В/см или 5 ч при 15 В/см. Нет белков работать быстрее, чем бромофено синий краситель, но длинные трассы может привести к размытию сигналов atp8 и atp9.
4. Пятно гель с Coomassie блестящий синий и сделать сканирование или фото, которое требуется в качестве управления загрузкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным способом управления погрузкой является иммуноблотинг с антителом к митохондриальному гену «домашнего хранения», например, порин 1.

6. Авторадиография

1. Высушите гель в геле-сушилке. Храните его в кассете с экраном фосфора хранения в течение 3-5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой скринингу сушеного геля является передача белков в мембрану нитроцеллюлозы путем электро-блоттинга и скрининга его после этого. Это приводит к более сильным сигналам и более острым полосам.
2. Сканирование экрана на фосфоримагере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы фосфорной визуализации, рентгеновская пленка также может быть использована для выявить сигналы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Следуя описанной выше протоколу, мы назначили продукты митохондриального перевода из двух штаммов S. cerevisiae: дикого типа (WT)и мутанта, подшипника удаления гена AIM23 (AIM23), кодируя фактор посвящения митохондриального перевода 3 (Таблица 1)⁸. Продукты м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Исследования экспрессии генов занимают центральное место в современных науках о жизни. Разработаны многочисленные методы, обеспечивающие понимание этого сложного процесса. Здесь мы описали метод, позволяющий получить доступ к биосинтезу белка в хлебопекарных дрожжах S. cerevisiae ми?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625