Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تمكن الطريقة المقدمة من تصور البروتينات الخلوية المسماة بالفلورسنت مع المجهر التوسعي مما يؤدي إلى دقة 70 نانومتر على المجهر التقليدي.

Abstract

تعطيل مرشح الكبيبي تتألف من بطانة الرحم الكبيبية، غشاء الطابق السفلي الكبيبي وpodocytes، والنتائج في الزلال. تحتوي عمليات القدم Podocyte على حزم أكتين ترتبط ببروتينات محول الهيكل الخلوي مثل بودوسين. تلك البروتينات محول، مثل بودوسين، ربط العمود الفقري للحجاب الحاجز شق الكبيبي، مثل الكليفرين، إلى الهيكل الخلوي أكتين. دراسة توطين ووظيفة هذه وغيرها من البروتينات podocytic أمر ضروري لفهم دور مرشح الكبيبي في الصحة والمرض. البروتوكول المقدم يمكن المستخدم من تصور أكتين، بودوسين، والنيفرين في الخلايا مع التصوير فائقة الدقة على المجهر التقليدي. أولا، الخلايا ملطخة بتقنية الفلورة المناعية التقليدية. ثم يتم تثبيت جميع البروتينات داخل العينة بشكل متناقض على هيدروجيل قابل للانتفاخ. من خلال الهضم مع البروتين K ، يتم شق البروتينات الهيكلية مما يسمح بتورم إيزوتروبي من الجل في الخطوة الأخيرة. يؤدي غسيل الكلى للعينة في الماء إلى توسيع العينة بمقدار 4-4.5 أضعاف ويمكن تصوير العينة عبر مجهر مضان تقليدي ، مما يجعل الدقة المحتملة 70 نانومتر.

Introduction

الزلال هو معلمة بديلة من مخاطر القلب والأوعية الدموية والنتائج من تعطيل مرشح الكبيبي1. يتكون الفلتر الكبيبي من البطانة الفينيستة، وغشاء الطابق السفلي الكبيبي والحجاب الحاجز الشقي الذي تشكله الخلايا الحبيبية. عمليات القدم الأولية والثانوية من podocytes التفاف حول جدار الشعيرات الدموية من الكبيبة2. يتم الحفاظ على الهيكل الدقيق لعمليات القدم من خلال حزم أكتين القشرية التي تعمل أيضا كمرساة لبروتينات الحجاب الحاجز متعددة الشق وغيرها من البروتينات محول2. ويسمى البروتين العمود الفقري للشق الحاجز الكليرين ويتفاعل بطريقة متجانسة مع جزيئات الكليفرين من podocytes معارضة. عن طريق البروتينات محول متنوعة, ويرتبط الكليفرين إلى الهيكل الخلوي أكتين2,3. الطفرات في الجين NPHS1 ترميز الكلية تؤدي إلى متلازمة الكلى من النوع الفنلندي4.

واحدة من البروتينات المتفاعلة في الكليفرين هو بودوسين، وهو بروتين يشبه دبوس الشعر لعائلة ستوماتين3. بودوسين يجند النيفرين إلى الطوافات الدهون ويربط ذلك إلى الهيكل الخلوي أكتين5. يتم ترميز بودوسين بواسطة الجين NPHS2. الطفرات في NPHS2 تؤدي إلى متلازمة الكلية المقاومة للستيرويد6.

لتصور والمشاركة في توطين البروتينات محول أكتين، يمكن استخدام تقنيات immunofluorescence. لسوء الحظ ، فإن حاجز الحيود للضوء يحد من دقة المجاهر الفلورية التقليدية إلى 200-350 نانومتر7. تقنيات المجهر رواية، على سبيل المثال، حفز استنفاد الانبعاثات (STED)الصورة تنشيط المجهر التعريب (PALM)مجهرية إعادة البناء البصري العشوائي (العاصفة أو dSTORM) أو المجهر حذف الحالة الأرضية تليها عودة جزيء الفردية (GSDIM)9،10،11،تمكين قرار يصل إلى ما يقرب من 10 نانومتر. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات فائقة الدقة تتطلب مجاهر باهظة الثمن ، وموظفين مدربين تدريبا جيدا ، وبالتالي فهي غير متوفرة في العديد من المختبرات.

المجهر التوسع (إكس إم) هو تقنية جديدة وبسيطة تمكن التصوير فائقة الدقة مع المجاهر التقليدية ويحتمل أن تكون متاحة لمجتمع بحثي كبير12. في المجهر توسيع الاحتفاظ بالبروتين (proExM) ، يتم إصلاح عينة من الفائدة (الخلايا أو الأنسجة) وملطخة بالفلوروفوريس13. ثم ترتكز البروتينات داخل العينة بشكل مكافئ بواسطة جزيء صغير (6-(Acryloyl)amino) حمض الهيكسانويك ، إستر succinimidyl ، AcX) في هيدروجيل قابل للانتفاخ13. من خلال الهضم الأنزيمي مع البروتين K (ProK) ، تحافظ البروتينات والفلوروفوريس على وضعها النسبي داخل الجل بعد التوسع13. بعد تورم الجل ، تتوسع العينة حتى 4.5 أضعاف (توسع حجمي 90 ضعفا) مما يؤدي إلى دقة الجانبية الفعالة من حوالي 60-70 نانومتر (300 نانومتر / 4.5). تعديلات هذه التقنية يمكن أن تسمح حتى لتوسيع 10 أضعاف (1000 أضعاف التوسع الحجمي)، مما يجعل قرار من 20-30 نانومتر على المجاهر التقليدية14،15،16.

وقد تم تصور الهياكل الكبيبية من الفئران والكلى البشرية عن طريق ExM17. ضمن هذه الورقة، نقدم بروتوكول proExM مفصل لتصور صور فائقة الدقة ل F-actin وبوبودوسين البروتين محول أكتين داخل الخلايا باستخدام المجهر الفلوري التقليدي.

Protocol

1. تقسيم وبذر الخلايا

  1. الاحماء المعقمة Dulbecco النسر المعدل المتوسط (DMEM) بما في ذلك 10٪ مصل العجل الجنيني (FCS)، الفوسفات المعقم العازلة المالحة (PBS) والريبسين العقيم إلى 37 درجة مئوية. تفعيل مقاعد البدلاء نظيفة.
  2. إعداد لوحة 6-جيدا بإضافة زلة غطاء زجاجي معقم واحد (10 ملم) إلى كل بئر باستخدام ملقط معقم.
  3. وضع طبق ثقافة الخلية 10 سم مع خلايا Cos7 تحت مقاعد البدلاء نظيفة. تحت مقاعد البدلاء نظيفة، يستنشق المتوسطة الخلايا باستخدام جهاز فراغ.
  4. عقد طبق ثقافة الخلية المقشورة في يد واحدة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم إلى جانب طبق ثقافة الخلية لتجنب الشطف قبالة الخلايا. وضع طبق ثقافة الخلية أسفل بحيث PBS يشطف طبق ثقافة الخلية كاملة.
  5. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من تريبسين إلى منتصف طبق ثقافة الخلية واحتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
  6. وقف رد فعل المحاولة بإضافة 10 مل من DMEM بما في ذلك FCS 10٪ وماصة حل الخلية صعودا وهبوطا مع ماصة لفصل الخلايا يدويا.
  7. تحليل رقم الخلية لكل ملليلتر باستخدام غرفة الجرد.
  8. البذور 68،000 الخلايا في المتوسط 2 مل لكل بئر على الغطاء الزجاجي زلات في لوحة 6-جيدا. توزيع الخلايا داخل لوحة 6-جيدا عن طريق هز بحذر لوحة أفقيا وعموديا.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا مبعثرة.
  9. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.

2. نقل الخلايا

  1. إعداد أنبوبين معقمين سعة كل منهما 1.5 مل (أحدهما للحمض النووي المخفف (A) وواحد للكواشف المخففة لإصابة الدهون القيصرية (B)). ماصة 0.75 ميكروغرام من الكليفرين و 0.75 ميكروغرام من بودوسين cDNA التعبير البلازميد لكل بئر في أنبوب واحد 1.5 مل وتمييعه إلى 100 ميكروغرام من انخفاض متوسط المصل لكل بئر. أضف 3 ميكرولتر من كاشف إصابة الدهون القيصرية لكل بئر إلى أنبوب 1.5 مل الثاني وتمييعه مع 100 ميكرولتر من متوسط المصل المنخفض. احتضان كل من ردود الفعل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. الجمع بين كل من ردود الفعل (A و B) إلى مجمع الحمض النووي الدهون واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة بحذر 200 ميكرولتر من مجمع الحمض النووي الدهون إلى كل بئر.
  3. احتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة دون تغيير الوسط.

3. التكبيل المناعي للهياكل الخلوية

  1. إعداد حل تحديد (4٪ (ث / الخامس) paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني، 1 مل / حسنا)، والحل permeabilization (0.5٪ (ث / الخامس) تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، 1 مل / حسنا)، وحل حجب (5٪ (v/v) ألبوم مصل البقر في برنامج تلفزيوني، 1 مل / حسنا).
  2. قم بإزالة الوسيطة باستخدام جهاز فراغ. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر لإزالة المتوسطة اضافية. يستنشق برنامج تلفزيوني تماما.
    ملاحظة: لتجنب غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، تأكد من ماصة PBS لا على الغطاء الزجاجي زلة مباشرة.
  3. إصلاح الخلايا مع 4٪ (ث / الخامس) paraformaldehyde (PFA) المذاب في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا في 3٪ (v/v) غليوكسيال الإيثانول18.
  4. تجاهل PFA وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (2 مل لكل منهما) عن طريق تجنب الأنابيب المباشرة على زلات الغطاء الزجاجي. Permeabilize الخلايا الثابتة مع تريتون X-100 0.5٪ (ث / الخامس) في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة الحل permeabilization وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو مبين في الخطوة 3.2.
  6. منع الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 5٪ (v/v) BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (الأجسام المضادة للبودوسين 1:200 في 1٪ (v/v) BSA في برنامج تلفزيوني) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، احتضان الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. إزالة الأجسام المضادة الأساسية وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو الحال في الخطوة 3.2. إضافة الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للأرنب اليكسا 488 1:1000 في 1٪ (v/v) BSA في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إبقاء الخلايا في الظلام باستخدام مربع.
  8. تجاهل الأجسام المضادة الثانوية وغسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
  9. إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة للنيفرين 1:100 في 1٪ (v/v) BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إبقاء الخلايا في الظلام باستخدام مربع.
  10. إزالة برنامج تلفزيوني واحتضان مع حمار الأجسام المضادة الثانوية خنزير غينيا 633، 1:200، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إبقاء الخلايا في الظلام باستخدام مربع.

4. المجهر التوسع

  1. اعداد
    1. لتشكيل الفواصل لغرفة الهلام، قطع الغطاء الزجاجي زلات #1.0 و #1.5 إلى 5 ملم المشارب (أربعة لكل شريحة زجاجية) باستخدام سكين الماس. وضع #1.5 ملم تغطية زلة المشارب بحيث تشكل مربع من 2.5 سم طول على شريحة زجاجية ووضعها في غرفة تلطيخ (الشكل 2A1-C1). ماصة قطرة من DDH2O في زوايا المربع على الالتزام بخطوط زلة الغطاء الزجاجي لبعضها البعض وإلى الشريحة الزجاجية (الشكل 2A2-C2).
      ملاحظة: تجنب التجفيف الكامل من DDH2O كما سوف تضيع قوة التصاق. إذا لزم الأمر، وتطبيق المزيد من قطرات من DDH2O. الانتظار لمدة 20 دقيقة تقريبا بحيث يتم إرفاق زلات غطاء #1.5 ملم بشكل ثابت قبل البدء مع الخطوة 4.1.2.
    2. ضع أربعة خطوط #1.0 زلة غطاء زجاجي لكل غطاء زلة على زلات غطاء #1.5 ملم. الالتزام المشارب عن طريق pipetting قطرة على كل #1.5 ملم غطاء زلة الشريط (الشكل 2A3-C3).
      ملاحظة: يجب أن يكون سمك الجل 0.15 ملم على الأقل لتسهيل التعامل مع تقدم البروتوكول. ومع ذلك، لتجنب هلام المفرط على رأس الخلايا، والحفاظ على ارتفاع الفواصل قريبة من ركيزة الخلية. باستخدام #1.5 و #1.0 تغطية زلة المشارب كما الفواصل، وارتفاع الفواصل سيكون حوالي 0.3 ملم. تلتصق الخلايا بزجاج الغطاء (الارتفاع 0.12 مم). ولذلك، فإن هلام تكون سميكة بما يكفي للتعامل مع ولكن يتم تجنب هلام المفرط على رأس الخلايا باستخدام #1.0 و #1.5 تغطية خطوط الزجاج والفواصل.
    3. بالنسبة لغطاء غرفة الهلام، قم بلف زجاج غطاء (#1.5) مع فيلم البارافين. تجنب أي طيات أو الأوساخ على فيلم البارافين(الشكل 2A5-C5).
  2. الرسو والبوليمرة (هلام)
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للإرساء (راجع الجدول 1). لترسيخ العلاج، واستبدال برنامج تلفزيوني مع 250 ميكرولتر من مرساة العازلة لكل بئر مباشرة على زلة الغطاء الزجاجي واحتضان لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على الركيزة في الظلام باستخدام مربع.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إعداد العازلة مرساة جديدة لكل تجربة وانتظر لمدة 10-15 دقيقة حتى يذوب بشكل صحيح. 6-((Acryloyl)amino)حمض هيكسانويك، وينبغي استبدال إستر succinimidyl (AcX) كل 4-5 أشهر لضمان الرسو كافية.
    2. إزالة العازلة ترسيخ وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1.5 مل لكل بئر.
    3. لتلطيخ ألياف أكتين، إذابة محلول phalloidin متوافق ExM واحتضان phalloidin (5 ميكرولتر من phalloidin المخفف في 195 ميكرولتر من 1٪ (v/v) BSA في PBS / جيدا) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بعينات في الظلام باستخدام صندوق.
    4. في غضون ذلك، حل أكريلات الصوديوم في DDH2O باستخدام جهاز إثارة. على الجليد، وإعداد حل مونومر (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: يجب أن يكون أكريلات الصوديوم المذاب محلولا واضحا وعديم اللون. إذا كان المحلول أصفر، فاستبدله بأكريلات الصوديوم الجديدة.
    5. إعداد حل هلام على الجليد (انظر الجدول 1). ماصة الأمونيومبيروكسيدسولفيت (APS) في حل الهلام الحق قبل تطبيق حل هلام إلى غرفة الهلام.
    6. إزالة phalloidin من الخلايا ويغسل مع 1.5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين في درجة حرارة الغرفة. اترك 1.5 مل من برنامج تلفزيوني داخل البئر لتسهيل إزالة العينة على زلة الغطاء الزجاجي.
    7. ضع الخلايا على زجاج الغطاء في غرفة الهلام باستخدام ملقط وقنية لرفع زلة زجاج الغطاء من لوحة 6-well.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا في الجزء العلوي من زلة الغطاء الزجاجي. وينبغي أن زلة غطاء الزجاج لا تلمس الفواصل.
    8. إضافة وكالة الأنباء الجزائرية إلى حل هلام ودوامة قريبا. ماصة 200 ميكرولتر من حل هلام على العينة (الشكل 2A4 -C4). أغلق بحذر غرفة الهلام عن طريق تجنب فقاعات الهواء داخل الجل (الشكل 2A5-C5).
    9. احتضان غرفة هلام لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية لبلمرة هلام في غرفة تلطيخ الرطب.
  3. التجانس (الهضم)
    1. أخرج غرفة التلطيخ من الحاضنة لفتح غطاء غرفة الهلام، أدخل شفرة حلاقة بين الغطاء والمتباعد. إزالة الغطاء بحذر. إزالة الفواصل مع شفرة الحلاقة والقضاء على جميع هلام اضافية عن طريق قطع عليه مع شفرة الحلاقة.
    2. وضع الشريحة مع هلام وتغطية الزجاج في طبق مليء برنامج تلفزيوني. عن طريق هز بلطف، وإزالة الزجاج غطاء منفصلة من هلام. لإزالة الجل من الطبق بسهولة، ضع الشريحة أسفل الجل لإرفاق الجل بالشريحة.
    3. مع هلام على الشريحة، وتقسيم هلام في قطع صغيرة (ينقسم ربع هلام إلى قطعتين إلى ثلاث قطع) باستخدام شفرة الحلاقة. دفع بلطف قطعة واحدة من هلام في بئر من لوحة 6-جيدا مع أسفل الزجاج وتطويه بواسطة فرشاة الطلاء. الحفاظ على هلام مبللة مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني باستخدام فرشاة الرسم لتجنب الجفاف من هلام.
      ملاحظة: تواجه الخلايا لأسفل.
    4. باستخدام المجهر المقلوب، خذ صورا عامة ذات فتحة رقمية منخفضة لتحديد عامل التوسع بعد التوسع.
    5. قم بإعداد المخزن المؤقت للهضم (انظر الجدول 1). تمييع البروتين K إلى 4 U / مل في العازلة الهضم لتلقي محلول الهضم.
      ملاحظة: يمكن تخزين مخزن الهضم المؤقت بدون Proteinase K عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
    6. أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم إلى كل بئر وغمر الجل داخل المحلول. السماح لها هضم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وإغلاق الغطاء حفظ العينات في الظلام.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، دعه يهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  4. توسع
    1. إزالة محلول الهضم مع ماصة والتخلص منه. أضف 1 مل من ddH2O. احتضن الجل المغمور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة المياه وإضافة 1 مل من ddHالطازجة 2O. الانتظار لمدة 10 دقيقة ومواصلة تبادل المياه كل 10 دقيقة حتى يتم التوصل إلى هضبة من التوسع.
      ملاحظة: يمكن تحقيق توسيع العينة حتى 4.5 أضعاف. يصبح الجل واضحا بصريا.
  5. التصوير
    1. إزالة الماء من الجل وبدء المجهر مباشرة. باستخدام مجهر مقلوب، استخدم في المقام الأول هدف الهواء (التكبير المنخفض) للعثور على خلايا مصورة في حالة ما قبل التوسع (الخطوة 4.3.4).
    2. قم بالتبديل إلى هدف 40x (الزيت /الماء) و 63x للحصول على دقة أفضل. تثير مع الطول الموجي للاهتمام واتخاذ الصورة عبر الكاميرا.
  6. التحقق
    1. خذ صورة عامة للعينة. ابحث عن نفس الهياكل الموجودة في العينة التي تم تصويرها في الخطوة 4.3.4 ومطابقتها. استخدام القناة مع أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء للتحقق من صحة(الشكل 3 A-B).
      ملاحظة: ضبط معلمات التصوير لتحقيق سطوع مماثل كما هو الحال في الصورة المكتسبة في حالة غير موسعة (الخطوة 4.3.4).
    2. تراكب الصور قبل وبعد التوسع عن طريق تدويرها وتحويلها مع ImageJ. استخدم أداة قياس المسافة في ImageJ لقياس المسافات بين الهياكل التي يمكن تحديدها بوضوح. قياس ما لا يقل عن 10 هياكل مختلفة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم برنامج نصي Python لقياس المسافات كما هو موضح في14.
    3. حساب عامل التوسعة بقسمة قياسات ما بعد/ما قبل التوسع.
    4. لتحديد التشوهات ، التقاط الصور مع فتحة رقمية أعلى(الشكل 4A--باء). تراكب هذه الصور وتحليلها مع ImageJ أو كما هو موضح في15.
      ملاحظة: يجب أن يتم تحديد التشوهات بشكل روتيني ولكن ليس بالضرورة على كل عينة.

النتائج

يتم تصوير مفهوم وتوقيت هذا البروتوكول proExM في الشكل 1. في اليوم 5، يتم إصلاح الخلايا المصابة وملطخة بالأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف البروتين من الفائدة(الشكل 1A،B). في اليوم السادس، يؤدي العلاج ب AcX إلى تكوين مجموعات أمين على ج?...

Discussion

تمكن الطريقة المعروضة المحقق من تصور البروتينات الخلوية ، على سبيل المثال ، بودوسين ، نيفرين ، ومكونات الهيكل الخلوي ، على سبيل المثال ، F-actin. ضمن هذا البروتوكول، يتم استخدام خلايا cos7 المصابة كنموذج لدراسة التفاعل بين بروتينات الحجاب الحاجز الشق مع F-actin. لسوء الحظ، خطوط خلايا podocyte الخالدة ...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

ويود صاحبا البلاغ أن يشكرا بلانكا دوفنياك ونيكولا كوهر على مساعدتهما التقنية الممتازة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide >99%Sigma-AldrichA3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SEinvitrogenA-20770store up to 4 months
APSSigma-AldrichA3678-25G
Deckgläser (cover glasses)EngelbrechtK1243224x32mm #1.0
Diamont cutterVWR201-0392for cutting the cover slips
Guanidine HClSigma-AldrichG3272-100G8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrushLeon Hardy3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)Thermo Fischer 1565478624x24mm #1.5
N,N`-MethylenbisacrylamideSigma-AldrichM7256-25G
Objektträger UniMarkMarienfeld703010
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Sodium AcrylateSigma-Aldrich408220check purity 
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
Staining chamberproduced at the university's workshop
TEMEDROTH2367.1
6-Well glass bottom platesCellvisP06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546 chrometranon-available1:40
Anti Podocin produced in rabbitSigmaP-0372-200UL1:200
Donkey anti guinea-pig CF633SigmaSAB4600129-50UL1:200
Goat anti rabbit 488Life TechnologiesA110341:1000
Guinea pig anti nephrinOrigeneBP50301:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1Zeissnon-available

References

  1. Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
  3. Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
  4. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  5. Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
  6. Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
  7. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  8. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  9. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  10. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  11. Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
  12. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  13. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  14. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  15. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
  16. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  17. Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
  18. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  19. Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
  20. Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
  21. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
  22. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  23. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  24. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170 proExM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved