Podosit Proteinleri Nephrin, Actin ve Podocin'in Genleşme Mikroskopisi ile Görüntülenmesi

Özet

Sunulan yöntem, floresan etiketli hücresel proteinlerin, geleneksel bir mikroskopta 70 nm çözünürlüğe yol açan genleşme mikroskopisi ile görselleştirilmesini sağlar.

Özet

Glomerüler endotel, glomerüler bodrum membranı ve podositlerden oluşan glomerüler filtrenin bozulması albüminüri ile sonuçlanır. Podosit ayak prosesleri, podocin gibi sitoskeletal adaptör proteinlerine bağlanan aktin demetleri içerir. Podocin gibi adaptör proteinleri, nefrin gibi glomerüler yarık diyaframın omurgasını aktin sitoskeleton'a bağlar. Bu ve diğer podositik proteinlerin lokalizasyonunu ve işlevini incelemek, glomerüler filtrenin sağlık ve hastalıktaki rolünün anlaşılması için gereklidir. Sunulan protokol, kullanıcının geleneksel bir mikroskopta süper çözünürlüklü görüntüleme ile hücrelerde akrin, podokin ve nefrin görselleştirmesini sağlar. İlk olarak, hücreler geleneksel bir immünoresans tekniği ile lekelenir. Numunedeki tüm proteinler daha sonra kovalently şişme bir hidrojel'e tutturulır. Proteinaz K ile sindirim yoluyla, yapısal proteinler son adımda jelin izotropik şişmesine izin vererek bölünür. Numunenin suda diyaliz edilmesi, numunenin 4-4,5 kat genişlemesine neden olur ve numune geleneksel bir floresan mikroskobu ile görüntülenebilir ve 70 nm'lik potansiyel bir çözünürlük sağlar.

Giriş

Albüminüri kardiyovasküler riskin taşıyıcı bir parametresidir ve glomerüler filtrenin bozulmasından kaynaklanır¹. Glomerüler filtre fenestratlı endotel, glomerüler bodrum zarı ve podositlerin oluşturduğu yarık diyaframdan oluşur. Podositlerin birincil ve ikincil ayak süreçleri glomerulum^2'ninkılcal duvarının etrafına sarılır. Ayak proseslerinin hassas yapısı, birden fazla yarık diyafram proteini ve diğer adaptör proteinleri için çapa görevi gören kortikal akrin demetleri tarafından korunur². Yarık diyaframın omurga proteinine nephrin denir ve karşıt podositlerin nefrin molekülleriyle homofilik bir şekilde etkileşime girer. Çeşitli adaptör proteinleri aracılığıyla, nephrin aktin sitoskeleton^2,3ile bağlantılıdır. Nefrin kodlayıcı gen NPHS1'deki mutasyonlar Finlandiya tip^4'ünnefrotik sendromuna yol açar.

Nephrin'in etkileşime giren proteinlerinden biri, stomatin ailesinin saç tokası benzeri bir proteini olan podocin³. Podocin lipid salları için nephrin işe ve actin sitoskeleton⁵bağlar . Podocin NPHS2 geni tarafından kodlanmıştır. NPHS2'deki mutasyonlar steroid dirençli nefrotik sendroma yol açar⁶.

Akin adaptör proteinlerini görselleştirmek ve birlikte lokalize etmek için immünofluoresans teknikleri kullanılabilir. Ne yazık ki, ışığın kırınım bariyeri geleneksel floresan mikroskopların çözünürlüğünü 200-350 nm⁷ile sınırlar. Yeni mikroskopi teknikleri, örneğin uyarılmış emisyon tükenmesi (STED)⁸, foto-aktif lokalizasyon mikroskopisi (PALM)⁹, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM veya dSTORM) veya zemin durumu silme mikroskopisi ve ardından bireysel molekül dönüşü (GSDIM) 9^,10,11, yaklaşık 10 nm'ye kadar bir çözünürlük sağlar. Bununla birlikte, bu süper çözünürlük teknikleri çok pahalı mikroskoplar, iyi eğitimli personel gerektirir ve bu nedenle birçok laboratuvarda mevcut değildir.

Genleşme mikroskopisi (ExM), geleneksel mikroskoplarla süper çözünürlüklü görüntüleme sağlayan ve büyük bir araştırma topluluğu için potansiyel olarak kullanılabilen yeni ve basit bir tekniktir¹². Protein tutma genleşme mikroskopisinde (proExM), ilgi örneği (hücreler veya doku) sabitlenir ve floroforlarla lekelenir¹³. Numune içindeki proteinler daha sonra küçük bir molekül (6-(((Acryloyl)amino)heksanoik asit, süksinimsal ester, AcX) tarafından koordine bir şekilde şişme bir hidrojel^13'etutturulr. Proteinaz K (ProK) ile enzimmatik sindirim yoluyla, proteinler ve floroforlar genişlemeden sonra jel içindeki göreceli konumlarını^{korurlar 13}. Jelin şişmesi sonrasında, numune 4,5 kata (90 kat hacimsel genleşme) kadar genişleyerek yaklaşık 60-70 nm (300 nm/4,5) etkili bir yanal çözünürlüğe sahiptir. Bu tekniğin modifikasyonları, geleneksel mikroskoplarda^14,15,^16'da20-30 nm çözünürlük oluşturarak 10 kat genişlemeye^(1.000kat hacimsel genişleme) bile izin verebilir.

Fare ve insan böbreklerinin glomerüler yapıları ExM¹⁷ile görselleştirilmiştir. Bu yazıda, geleneksel bir floresan mikroskobu kullanarak F-actin ve aksin adaptörü protein podocin'in süper çözünürlüklü görüntülerini görselleştirmek için ayrıntılı bir proExM protokolü sunuyoruz.

Protokol

1. Hücrelerin bölünmesi ve tohumlama

1. %10 fetal baldır serumu (FCS), steril Fosfat tamponlu salin (PBS) ve steril tripsin dahil olmak üzere steril Dulbecco Modifiye Eagle's Medium 'u (DMEM) 37 °C'ye ısıtın. Temiz bankı aktif hale getir.
2. Steril tokmaklar kullanarak her kuyuya bir steril cam kapak kayması (10 mm) ekleyerek 6 kuyulu bir plaka hazırlayın.
3. Temiz tezgahın altına Cos7 hücreli 10 cm hücre kültürü yemeği koyun. Temiz tezgahın altında, bir vakum cihazı kullanarak hücrelerin ortamını aspire edin.
4. Angüle edilmiş hücre kültürü çanasını bir elinizde tutun ve hücrelerin durulamasını önlemek için hücre kültürü çanağının yanına 10 mL steril PBS ekleyin. PBS'nin tüm hücre kültürü çanasını durulaması için hücre kültürü çanasını yere koyun.
5. PBS'yi çıkarın ve hücre kültürü çanağının ortasına 1 mL tripsin ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
6. %10 FCS dahil olmak üzere 10 mL DMEM ekleyerek ve hücreleri manuel olarak ayırmak için bir pipetle hücre çözeltisini yukarı ve aşağı pipetle kapatarak trypnizasyon reaksiyonunu durdurun.
7. Sayım odası kullanarak mililitre başına hücre numarasını analiz edin.
8. Cam kapağın üzerine kuyu başına 2 mL ortamda 68.000 hücre tohumu 6 kuyu plakasında kayar. Plakayı yatay ve dikey olarak dikkatlice sallayarak hücreleri 6 kuyu plakası içinde dağıtın.
   NOT: Hücreler dağınık olarak uzanmalıdır.
9. %5 CO₂ile 37 °C inkübatörde hücreleri bir gecede kuluçkaya yatırın.

2. Hücrelerin transeksiyon

1. İki steril 1,5 mL tüp hazırlayın (biri seyreltilmiş DNA (A) için ve diğeri katyonik lipid transfeksiyon (B) için seyreltilmiş reaktif için). Pipet 0.75 μg nefrin ve 0.75 μg podocin cDNA ekspresyon plazmid kuyu başına bir 1.5 mL tüp içine ve kuyu başına 100 μL azaltılmış serum ortamına seyreltin. İkinci 1,5 mL tüpe kuyu başına 3 μL katyonik lipid transfeksiyon reaktifi ekleyin ve 100 μL azaltılmış serum ortamı ile seyreltin. Her iki reaksiyona da oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
2. Her iki reaksiyoni (A ve B) bir DNA lipit kompleksinde birleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Her kuyuya 200 μL DNA-lipit kompleksi ekleyin.
3. Transfected hücreleri 37 °C'de, ortamı değiştirmeden 48 saat boyunca% 5 CO₂ ile kuluçkaya yatırın.

3. Hücresel yapıların immünoblabeling

1. Bir sabitleme çözeltisi (PBS'de %4 (w/v) paraformaldehit, 1 mL/kuyu), permeabilizasyon çözeltisi (PBS'de %0,5 (w/v) Triton X-100, 1 mL/well) ve bir engelleme çözeltisi (PBS'de %5 (v/v) sığır serum albümini, 1 mL/kuyu) hazırlayın.
2. Ortamı bir vakum cihazıyla çıkarın. Ekstra ortamı çıkarmak için her kuyuya 2 mL PBS ekleyin. PBS'i tamamen aspire edin.
   NOT: Hücrelerin PBS ile yıkanmasını önlemek için, PBS'yi doğrudan cam kapak kaymasına değil pipetle yıkadığından emin olun.
3. PBS'de çözünmüş %4 (w/v) paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sabitlayın.
   NOT: Alternatif olarak, hücreleri% 3 (v / v) glioksial-etanol^18'desabitler.
4. Cam kapak kaymalarına doğrudan pipetlemekten kaçınarak PFA'yı atın ve hücreleri PBS'de iki kez (her biri 2 mL) yıkayın. Sabit hücreleri ODA sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de Triton X-100%0,5 (w/v) ile permeabilize edin.
5. Permeabilizasyon çözeltisini çıkarın ve adım 3.2'de belirtildiği gibi PBS ile iki kez yıkayın.
6. PBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 (v/v) BSA'nın 1 mL'sini ekleyerek hücreleri engelleyin. Hücreleri 4 °C'de bir gecede birincil antikorun 200 μL'si (PBS'de % 1 (v/v) BSA'da 1:200 anti-podokin antikoru) ile kuluçkaya yatırın.
   NOT: Alternatif olarak, birincil antikoru oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
7. Birincil antikoru çıkarın ve adım 3.2'de olduğu gibi PBS ile üç kez yıkayın. İkincil antikor (keçi anti-tavşan Alexa 488 1:1000 içinde 1% (v/v) BSA PBS) oda sıcaklığında 1 saat için ekleyin. Bir kutu kullanarak hücreleri karanlıkta tutun.
8. İkincil antikorları atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
9. PBS'yi çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 1 (v/ v) BSA'da 1:100 μL anti-nefrin antikoru ile kuluçkaya yatırın. PBS ile üç kez yıkayın. Bir kutu kullanarak hücreleri karanlıkta tutun.
10. PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikor eşek anti-gine domuzu 633, 1:200 ile kuluçkaya yatırın. PBS ile üç kez yıkayın. Bir kutu kullanarak hücreleri karanlıkta tutun.

4. Genleşme mikroskopisi

1. Hazırlık
   1. Jelleşme odası için ara parçaları oluşturmak için, cam kapak kaymalarını #1.0 ve #1.5'i elmas bir bıçak kullanarak 5 mm çizgiler halinde (cam slayt başına dört) kesin. #1,5 mm kapak kayması şeritlerini cam bir kaydıraktan 2,5 cm uzunluğunda bir kare oluşturacak şekilde yerleştirin ve bir boyama odasınayerleştirin (Şekil 2A1-C1). Pipet bir damla ddH₂O kare köşelerine cam kapak kayma şeritleri birbirine ve cam slayta yapışmak için (Şekil 2A2-C2).
      NOT: Yapışıklık kuvveti kaybolacağı için ddH₂O'nun tamamen kurutılmasından kaçının. Gerekirse, daha fazla ddH₂damlacık uygulayın #1.
   2. #1,5 mm kapak kaymalarına kapak kayması başına dört #1,0 cam kapak kayması şeridi yerleştirin. Her #1,5 mm kapak kayması şeridine bir damlacık pipet takarak şeritleri yapıştırın (Şekil 2A3-C3).
      NOT: Protokolün ilerlemesinde kullanımı kolaylaştırmak için jelin kalınlığı en az 0,15 mm olmalıdır. Bununla birlikte, hücrelerin üstünde aşırı jel olmasını önlemek için, aralayıcıların yüksekliğini hücre alt tabakasına yakın tutun. #1.5 ve #1.0 kapak kayması şeritlerini aralayıcı olarak kullanarak, ara uzayların yüksekliği yaklaşık 0,3 mm olacaktır. Hücreler kapak camına yapışır (yükseklik 0,12 mm). Bu nedenle, jel işlemek için yeterince kalın olacaktır, ancak #1.0 ve #1.5 kapak cam şeritleri aralayıcı olarak kullanılarak hücrelerin üstündeki aşırı jelden kaçınılır.
   3. Jelasyon odası kapağı için, bir kapak camını (#1,5) parafin filmi ile sarın. Parafin filmi üzerinde herhangi bir kıvrım veya kirden kaçının (Şekil 2A5-C5).
2. Ankraj ve polimerizasyon (jelleşme)
   1. Bağlantı arabelleği hazırlayın (bkz. Tablo 1). Ankraj tedavisi için PBS'yi kuyu başına 250 μL ankraj tamponu ile doğrudan cam kapak kayması üzerine değiştirin ve oda sıcaklığında 3 saat kuluçkaya yatırın. Bir kutu kullanarak substratı karanlıkta tutun.
      NOT: Alternatif olarak, oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın. Her deney için taze ankraj tamponu hazırlayın ve düzgün bir şekilde çözünene kadar 10-15 dakika bekleyin. 6-((Acryloyl)amino)heksanoik asit, süksinimimidyl ester (AcX) yeterli ankraj sağlamak için her 4-5 ayda bir değiştirilmelidir.
   2. Ankraj tamponu çıkarın ve kuyu başına 1,5 mL PBS ile bir kez yıkayın.
   3. Akrin liflerini lekelemek için ExM uyumlu bir phalloidin çözeltisini çözün ve phalloidini (PBS/kuyuda% 1 (v/v) BSA'nın 195 μL'sinde seyreltilmiş 5 μL phalloidin) oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın. Bir kutu kullanarak örnekleri karanlıkta tutun.
   4. Bu arada, sodyum akrilatını karıştırma cihazı kullanarak ddH₂O'da çözün. Buz üzerinde monomer çözeltisini hazırlayın (bkz. Tablo 1).
      NOT: Çözünmüş sodyum akrilat net ve renksiz bir çözelti olmalıdır. Çözelti sarı ise, yeni sodyum akrilit ile değiştirin.
   5. Jelleşme çözeltisini buz üzerinde hazırlayın (bkz. Tablo 1). Jelasyon çözeltisi jelleşme odasına uygulanmadan hemen önce jelleşme çözeltisine pipet amonyumperoksisidsülfat (APS).
   6. Phalloidin'i hücrelerden çıkarın ve oda sıcaklığında iki kez 1,5 mL PBS ile yıkayın. Numunenin cam kapak kayması üzerinde çıkarılmasını kolaylaştırmak için kuyunun içinde 1,5 mL PBS bırakın.
   7. Kapak camındaki hücreleri, kapak camı kaymasını 6 kuyulu plakadan kaldırmak için tokalar ve bir kanül kullanarak jelleşme odasına yerleştirin.
      NOT: Hücreler cam kapak kaymasının üstünde olmalıdır. Cam kapak kayması ara parçalarına dokunmamalıdır.
   8. Jelleşme çözeltisine aps ekleyin ve kısa süre içinde girdap. Pipet 200 μL jelleşme çözeltisi numune üzerinde (Şekil 2A4-C4). Jel içindeki hava kabarcıklarından kaçınarak jelleşme odasını dikkatlice kapatın (Şekil 2A5-C5).
   9. Jelleşme odasını ıslak boyama odasında polimerize etmek için 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya bırakın.
3. Homojenizasyon (sindirim)
   1. Leke haznesini inkübatörden çıkar. Jelasyon odası kapağını açmak için, kapak ve aralayıcı arasına bir jilet takın. Kapağı dikkatlice çıkarın. Araları jiletle çıkarın ve jiletle keserek tüm ekstra jeli ortadan kaldırın.
   2. Jel ve kapak camı ile slaytı PBS ile dolu bir tabağa koyun. Hafifçe sallayarak, müstakil kapak camını jelden çıkarın. Jeli tabaktan kolayca çıkarmak için, jeli slayda tutturmak için jelin altına slaydı koyun.
   3. Jel slayttayken, jeli jilet kullanarak küçük parçalara bölün (jelin çeyreği iki ila üç parçaya ayrılır). Bir parça jeli cam tabanlı 6 kuyulu bir tabağa hafifçe itin ve bir boya fırçasıyla katlayın. Jelin susuz kalmasını önlemek için boya fırçasını kullanarak jeli biraz PBS ile nemlendirin.
      NOT: Hücreler aşağı doğru bakacaktır.
   4. Ters mikroskop kullanarak, genişletmeden sonra genişletme faktörünü belirlemek için düşük sayısal diyafram açıklığına sahip genel bakış görüntüleri alın.
   5. Sindirim arabelleği hazırlayın (bkz. Tablo 1). Sindirim çözeltisini almak için sindirim tamponunda Proteinaz K ila 4 U/mL seyreltin.
      NOT: Proteinaz K içermeyen sindirim tamponu 1-2 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
   6. Her kuyuya 500 μL sindirim çözeltisi ekleyin ve jeli çözeltinin içine daldırın. Oda sıcaklığında gece boyunca sindirin ve numuneleri karanlıkta tutarak kapağı kapatın.
      NOT: Alternatif olarak, 1 saat boyunca 37 °C'de sindirin.
4. Genişleme
   1. Sindirim solüsyonunu bir pipetle çıkarın ve atın. 1 mL ddH₂O ekleyin Daldırma jelini oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın.
   2. Suyu çıkarın ve 1 mL taze ddH₂O ekleyin.
      NOT: 4,5 kata kadar numune genişlemesi elde edilebilir. Jel optik olarak netleşir.
5. Görüntüleme
   1. Suyu jelden çıkarın ve doğrudan mikroskopiye başlayın. Ters mikroskop kullanarak, öncelikle genişleme öncesi durumda görüntülenmiş hücreleri bulmak için bir hava hedefi (düşük büyütme) kullanın (adım 4.3.4).
   2. Daha iyi çözünürlük için 40x (yağ/su) ve 63x hedefe geçin. İlginin dalga boyu ile heyecanlandırın ve görüntüyü kamera üzerinden alın.
6. Doğrulama
   1. Örneğin genel bir görüntüsünü alın. 4.3.4 adımında görüntülenmiş örnekteki yapıları bulun ve eşleştirin. Doğrulama için en iyi sinyal-gürültü oranına sahip kanalı kullanın (Şekil 3 A-B).
      NOT: Genişletilmemiş durumda elde edilen görüntüde olduğu gibi benzer parlaklık elde etmek için görüntüleme parametrelerini ayarlayın (adım 4.3.4).
   2. ImageJ ile döndürerek ve kaydırarak genişletme öncesi ve sonrası görüntüleri kaplayın. Açıkça tanımlanabilir yapılar arasındaki mesafeleri ölçmek için ImageJ'deki mesafe ölçüm aracını kullanın. En az 10 farklı yapıyı ölçün.
      NOT: Alternatif olarak,¹⁴'te açıklandığı gibi mesafeleri ölçmek için bir Python komut dosyası kullanın.
   3. Genişletme sonrası/öncesi ölçümleri bölerek genişleme faktörünü hesaplayın.
   4. Bozulmaları belirlemek için, daha yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip görüntüler çekin (Şekil 4A-B). Bu görüntüleri kaplayın ve ImageJ ile veya¹⁵'te açıklandığı gibi analiz edin.
      NOT: Bozulmaların tespiti rutin olarak yapılmalıdır, ancak her numunede mutlaka yapılmamalıdır.

Sonuçlar

Bu proExM protokolünün kavramı ve zamanlaması Şekil 1'de tasvir edilmiştir. 5. günde, transfected hücreler ilgi proteinini hedefleyen floresan antikorlarla sabitlenir ve lekelenir (Şekil 1A,B). 6. günde, AcX ile tedavi tüm proteinler üzerinde amin gruplarının oluşumuna yol açar (floroforlar dahil) (Şekil 1A,B)¹². Hidrojel poli...

Tartışmalar

Sunulan yöntem, araştırmacının hücresel proteinleri, örneğin podocin, nephrin ve sitoskeletal bileşenleri, örneğin F-actin'i görselleştirmesini sağlar. Bu protokolde, transfected cos7 hücreleri, yarık diyafram proteinlerinin F-actin ile etkileşimini incelemek için bir model olarak kullanılır. Ne yazık ki, ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hatları yeterli miktarda yarık diyafram proteinini ifade etmez¹⁹.

Bu yöntemle hücresel proteinler gelen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	store up to 4 months
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckgläser (cover glasses)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cutter	VWR	201-0392	for cutting the cover slips
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M Stock can be kept at RT
Marten hair paintbrush	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckgläser (cover glasses)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N`-Methylenbisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220	check purity
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Staining chamber			produced at the university's workshop
TEMED	ROTH	2367.1
6-Well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N
Antibodies
Actin-ExM 546	chrometra	non-available	1:40
Anti Podocin produced in rabbit	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Donkey anti guinea-pig CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Goat anti rabbit 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Guinea pig anti nephrin	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	non-available